Methodenartikel

Een Protocol voor Real-time 3D één deeltje Tracking

DOI:

10.3791/56711

⸱

3 januari 2018

 , 
1Department of Chemistry, Duke University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze gegevens van het protocol, de bouw en de exploitatie van een real-time 3D één deeltje tracking Microscoop staat tracking nanoschaal fluorescerende probes hoge diffusive snelheden en lage foton graaf tarieven.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Real-time driedimensionaal één deeltje bijhouden (RT-3D-SPT) heeft het potentieel om licht te werpen op snelle, 3D processen in cellulaire systemen. Hoewel in de afgelopen jaren verschillende RT-3D-SPT methoden naar voren gebracht hebben, blijft hoge Trackingsnelheid 3D verspreiding van deeltjes tegen lage foton graaf tarieven een uitdaging. Bovendien, RT-3D-SPT opstellingen zijn over het algemeen complexe en moeilijk uit te voeren, door hun wijdverbreide toepassing voor biologische problemen te beperken. Dit protocol stelt een systeem van de RT-3D-SPT genoemd 3D dynamische Photon lokalisatie Tracking (3D-DyPLoT), die deeltjes met hoge diffusive snelheid (tot 20 µm2/s) kunnen volgen bij lage foton graaf tarieven (tot 10 kHz). 3D-DyPLoT maakt gebruik van een 2D electro-optic deflector (2D-EOD) en een lens afstembare akoestische verloop (TAG) naar station een honkslag gericht laser spot dynamisch in 3D. Gecombineerd met een geoptimaliseerde positie schatting algoritme, kunt 3D-DyPLoT op enkele deeltjes met hoge snelheid en hoge lokalisatie precisie vergrendelen. Als gevolg van de interne excitatie en één detectie pad-indeling is 3D-DyPLoT robuust en eenvoudig te installeren. Dit protocol wordt beschreven hoe u het bouwen van 3D-DyPLoT stap voor stap. Ten eerste, de optische lay-out wordt beschreven. Vervolgens is het systeem gekalibreerd en geoptimaliseerd door raster scannen een 190 nm fluorescerende kraal met de piëzo-elektrische nanopositioner. Tot slot, om aan te tonen real-time 3D tracking vermogen, 110 nm fluorescerende kralen worden bijgehouden in water.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De opkomst van geavanceerde beeldvormende technieken heeft geopend een venster om te zien steeds meer gedetailleerde structuur van cellulaire fenomenen, helemaal tot op het moleculaire niveau. Methoden zoals stochastische optische wederopbouw microscopie (STORM)1,2,3, foto-geactiveerde lokalisatie microscopie (PALM)4,5,6,7 , gestructureerd verlichting microscopie (SIM)8,9,10,11, en gestimuleerd emissie uitputting microscopie (STED)12,13, 14 ver voorbij de limiet van de diffractie te leveren van ongekende detail in de structuur en functie van levende cellen. Volledige inzicht van hoe deze systemen zich gedragen, vereist echter dynamische informatie evenals structurele informatie. De super resolutie methodes hierboven vermelde omvatten een trade-off tussen ruimtelijke resolutie en temporele resolutie, beperking van de temporele precisie waarmee dynamische processen kunnen worden bestudeerd. Een methode die biedt zowel hoge precisie van de ruimtelijke en temporele resolutie is RT-3D-SPT15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27,28,29. Hier maken we een onderscheid tussen de traditionele 3D-SPT30 en RT-3D-SPT. traditioneel 3D-SPT gewoon vereist een tijdreeks van gegevens van de drie-dimensionale afbeelding (die kan worden verkregen via een confocal microscoop of een epifluorescence-Microscoop gegeven van de juiste configuratie). In traditionele 3D-SPT, worden de coördinaten van het deeltje bepaald na de gegevensverzameling door het lokaliseren van het deeltje in elke afbeeldingsstapel en concatenatie van de locaties in opeenvolgende volumes maken een traject. Voor deze methoden, wordt de ultieme temporele resolutie bepaald door de volumetrische imaging tarief. Voor confocal microscopen is dit gemakkelijk op de schaal van seconden tot tientallen seconden. Voor epifluorescence methoden, waarin de optische weglengte wordt gemanipuleerd zodat de axiale locatiegegevens kan worden geëxtraheerd, is de temporele resolutie beperkt door de camera belichting of uitlezing tijd. Deze epifluorescerende-methoden zijn beperkt in het bereik waarover axiale informatie kan worden verzameld, hoewel de recente vooruitgang in Fourier vliegtuig fase maskers ontwerp en adaptieve optiek breidt deze varieert tot 10 µm of meer31,32 , 33 , 34.

In tegenstelling, afhankelijk RT-3D-SPT niet is van het verwerven van een 3D-beeld-stack en het vinden van deeltjes na het feit. In plaats daarvan, real-time locatie-informatie wordt uitgepakt via aanspreekpunt detectoren en feedback wordt toegepast op effectief "vergrendelen" het deeltje in het focal volume van het objectief door het gebruik van een highspeed piëzo-elektrische fase. Hierdoor continue meting van de deeltjes van standpunt beperkt slechts door hoeveel fotonen kunnen worden verzameld. Deze methode kan bovendien spectrale ondervraging van het deeltje als het beweegt over lange afstanden. RT-3D-SPT feitelijk werken verwant aan een optische kracht-vrije val voor de nanoschaal objecten, waarin het deeltje is voortdurend gesondeerd en gemeten in real time zonder de behoefte aan grote laser bevoegdheden of optische dwingt. Gezien het feit dat RT-3D-SPT een middel voor continue ondervraging van snel diffusive objecten (maximaal 20 µm2/s)25,29 in drie dimensies op lage foton graaf tarieven20,29biedt, 35, dient het een venster in snelle of voorbijgaande biologische processen zoals intracellulaire vrachtvervoer, ligand-receptor binden en de extracellulaire dynamiek van één virionen. Op dit punt is de toepassing van de RT-3D-SPT echter beperkt tot het handjevol groepen werken om deze technologie verder te gaan.

Een barrière is de complexiteit van de optische indeling vereist door RT-3D-SPT methoden, die zijn gevarieerd. Voor de meeste methoden, wordt de optische feedback geleverd door een piëzo-elektrische fase. Als het deeltje maakt kleine bewegingen in X, Y, of Z, uitlezingen van aanspreekpunt detectoren zijn geconverteerd naar fout functies en gevoed met hoge snelheid naar een piëzo-elektrische nanopositioner, die in zijn beurt beweegt aan het tegengaan van de particle beweging, effectief monster vergrendelen in plaats ten opzichte van het objectief. Voor het meten van kleine positionele bewegingen in X, Y, en Z, ofwel meerdere detectoren (4 of 5 afhankelijk van de uitvoering)15,-18,21 of meerdere excitatie vlekken (2-4, de laagste van die kan worden toegepast als een Lock-in versterker wordt gebruikt voor het uitpakken van X en Y-positie met behulp van een roterende laser spot)25,28 worden toegepast. De overlapping van deze meerdere detectie en emissie vlekken bemoeilijken de systemen voor het uitlijnen en onderhouden.

Hierin presenteren wij een high-speed doel-locked 3D-SPT-methode met een vereenvoudigde optische ontwerp genaamd 3D-DyPLoT29. 3D-DyPLoT maakt gebruik van een 2D-EOD en een TAG lens36,37,38 om dynamisch een plek gericht laser via het objectieve focal volume op een hoog tempo (50 kHz XY, 70 kHz Z). Het combineren van de laser focus positie en de aankomsttijd foton kunt van het deeltje 3D kunnen snel zelfs bij lage foton graaf tarieven worden verkregen. De 2D-EOD drijft de laser focus in een knight's tour patroon39 met een vierkante grootte van 1 x 1 µm in het X-Y vlak en de TAG-lens focus van de laser in axiale richting met een bereik van 2-4 µm. De positie van 3D deeltje wordt verkregen met een geoptimaliseerde positie schatting algoritme29,40 in 3D. De controle van de 3D dynamisch bewegende laser spot, foton geteld vanaf de lawine fotodiode (APD), real-time deeltje positie berekening, piëzo-elektrische stadium feedback en opname van de gegevens worden uitgevoerd op een veld programmable gate array (FPGA).In dit protocol, we beschrijven hoe het bouwen van een 3D-DyPLoT Microscoop stapsgewijze, met inbegrip van optische uitlijning, kalibratie met vaste deeltjes, en ten slotte gratis deeltje tracking. Als een demonstratie, werden 110 nm fluorescerende kralen voortdurend bijgehouden in water voor minuten per keer.

De hier beschreven methode is een ideale keuze voor elke toepassing waar het gewenst is een snel bewegende fluorescente sonde bij lage lichtniveaus, met inbegrip van virussen, nanodeeltjes en blaasjes zoals Endosomen continu te volgen. In tegenstelling tot de vorige methoden is er slechts een enkele excitatie en één detectie traject, uitlijning en onderhoud eenvoudig maken. Bovendien kunnen het grote detectie gebied dankzij deze Microscoop te halen gemakkelijk snel verspreiden van deeltjes, terwijl de mogelijkheid om bij te houden (tot 10 kHz) niveau laag signaal deze methode ideaal voor low-light toepassingen29 maakt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. instellen van de lay-out en uitlijning

  1. Installatie en collimatie van de tracking excitatie laser
    1. Brengt de laser aan de optische tabel met behulp van een huis-gebouwde mount. Het onderstel is een eenvoudige aluminiumplaat met montage gaten voor het hoofd van de laser en de optische tabel. De laser moet stevig worden gekoppeld aan een metalen mount voor stabiliteit en warmteafvoer. Gebruik hiervoor een 488 nm solid state laser voor verlichting (Figuur 1), hoewel de golflengte kan worden geselecteerd om te passen bij een bepaalde fluorophore of experimenteren. Een kritieke factor is dat de golflengte van de laser past het werkbereik van de 2D-EOD, die wordt bepaald door de golf plaat tussen de twee leidschoepen voornamelijk (Figuur 1: W2). De 488 nm laser kan effectief de groene of gele fluorescente proteïne (GFP/YFP), die gemeenschappelijke fluorescerende tags in levende cellen experimenten prikkelen.
    2. De laser beam hoogte en richting met behulp van een paar diëlektrische spiegels aanpassen (Figuur 1: M). Zorg ervoor dat de laserstraal is parallel aan de optische tabel en passen het aan een geschikte hoogte.
      Opmerking: De hoogte moet worden gekozen op basis van het platform van de Microscoop. Deze hoogte moet worden gehandhaafd voor alle latere spiegels gebruikt in dit protocol, hoewel het niet expliciet zal worden vermeld.
    3. Collimate van de lichtbundel met een paar lenzen (Figuur 1: L1 en L2). De brandpuntsafstand van lenzen moet zorgvuldig gekozen worden om te voorkomen dat de plek van de laser wordt afgekapt door de opening van de 2D-EOD. Knippen is duidelijk door een verandering in de vorm van de laser beam na het passeren van de 2D-EOD. De kwaliteit van collimatie hier is zeer belangrijk omdat aberraties zal worden versterkt door latere lenzen en eventuele afwijkingen de prestaties van de 2D-EOD uitwijking verslechteren zal. In het ideale geval collimate de bundel door te focussen op de lichtbundel naar een punt ten minste 20 meter afstand.
  2. Plaats een gaatje (Figuur 1: PH) van passende omvang op de focus van de eerste collimatie lens (Figuur 1: L1).
    1. Kies een gepaste afmetingen pinhole. De grootte van het gaatje kan worden gekozen op basis van de volgende berekening:
      figure-protocol-1
      Waar λ de golflengte van de laser, is f is de brandpuntsafstand van de eerste lens en D is de diameter van de input lichtbundel.
    2. Het gaatje in het werkgebied van een 3D-translatie zo monteren dat het precies op de focus van de eerste collimatie lens kan worden geplaatst.
    3. Pas de positie van de pinhole. Plaats een laser power meter na het gaatje en pas de positie van de pinhole in XYZ te maximaliseren van de uitlezing van de meter macht. Als een diffractie-ring wordt waargenomen, blokkeert u het met een iris voor de 2D-EOD geplaatst.
  3. Installatie van Glan-Thompson polarisator
    1. Zet de polarisator Glan-Thompson (Figuur 1: GP) na de tweede collimatie lens (Figuur 1: L2) de polarisatie van de laserstraal schoon te maken. Draaien van de polarisator om te zoeken naar maximale transmissie met de Energiemeter.
  4. Installatie van EODs
    1. Gebruik 2 EODs (Figuur 1: EOD1 & EOD2) om te doen afwijken van de laser in de X- en Y-richting. Maximaliseer de laser-overdracht door de yaw, de toonhoogte en de hoogte van elke EOD aanpassen.
    2. Hiermee lijnt u de twee EODs ten opzichte van elkaar met de markering van de uitlijning die door de fabrikant aan de kant van elke deflector.
    3. Een test patroon hebt toegepast op de controller van de 2D-EOD te inspecteren de output van de EOD. Dit kan via de FPGA hieronder beschreven of een eenvoudige sinusgolf geboden door een functiegenerator de knight's tour (Figuur 2). Voor de beste prestaties moet de uitwijking door elke deflector evenwijdig aan de X- of Y-richting van de piezo-nanopositioner. Deze richting wordt gedicteerd door de hoekige richting van de leidschoepen over de transmissie-as. Om te draaien de doorbuiging richting zonder te verplaatsen van de 2D-EOD, voegt u een duif prisma na de 2D-EOD aan het uitlijnen van de assen van de uitwijking aan de piezo nanopositioner assen.
  5. Installatie van half-golf plaat
    1. Plaats een half-golf-plaat (Figuur 1: W1) tussen de polarisator Glan-Thompson (Figuur 1: GP) en de 2D-EOD aan het uitlijnen van de binnenkomende laser beam polarisatie met de assen van de doorbuiging van de 2D-EOD. Plaats van een lang brandpunt lens (300 mm) na de 2D-EOD en plaats een sCMOS camera op de laser focus. Vervolgens zet de 2D-EOD voor het genereren van de knight's tour beschreven hieronder (Figuur 2). Draai de helft-golf plaat totdat een gelijkmatig vierkante laser distributie is waargenomen op de camera.
  6. Installatie van een lichtbundel gebruikten lens pair en relais lens paar
    1. Plaats een paar lenzen (Figuur 1: L3 en L4) na de 2D-EOD uit te breiden van de lichtbundel te vullen het terug diafragma van de lens doelstelling (Figuur 1: OL) en een ander paar van lenzen (Figuur 1: L5 en L6) om te relay het brandvlak aan de doelstelling van de Microscoop. Zitten zekere voor vertrek genoeg ruimte tussen deze twee paren van lenzen, zoals de TAG lens tussen hen in een later stadium zal worden geïnstalleerd.
  7. Installeer de dichroïde filter, de 10/90 balk splitter, gericht lens, APD, objectief en fluorescentie emissie filter Voltooi het detectie-traject.
    1. Het dichroïde filter installeren (Figuur 1: DC) aan de laser naar de objectief. Hiermee lijnt u de laser gaat dwars door het midden van de lens van de doelstelling met behulp van twee irissen op de boven- en onderkant van de buis van een lange lens.
    2. Installeer een 10/90 balk splitter (Figuur 1: BS) door die 10% van het licht voor imaging wordt weerspiegeld door een sCMOS camera (hieronder beschreven) en 90% van passeert aan de APD voor bijhouden.
    3. Hiermee lijnt u de APD. Richten de laser op een dekglaasje aan door het objectief. Gebruik de reflectie van het dekglaasje aan om alle downstream elementen uitlijnen door de invoering van een dekglaasje aan op de objectieve focus en controle van de intensiteit van de APD uitlezing. Na de balk splitter, installeren de APD lens gericht (Figuur 1: L7) gevolgd door de APD in het werkgebied van een 3D-translatie. Plaats de lens zodat de reflectie van de laser van de doelstelling door het midden van de lens gaat.
De APD positie kan worden geoptimaliseerd door het aanpassen van de 3D positie om te maximaliseren van de intensiteit van de reflectie van de laser op het dekglaasje aan. De APD-positie is op de optimale positie wanneer een verhuizing van de positie van de detector in elke gewenste richting de intensiteit vermindert.
  • Een longpass filter voor de emissie van de fluorescentie installeren (Figuur 1: F) vóór de balk splitter te verwijderen van het licht gereflecteerd en verspreid.
  • Installatie van de TAG-lens
    1. Plaatsen van de TAG lens tussen de twee paren van lenzen (tussen Figuur 1: L4 en L5) genoemde vóór als aangegeven in Figuur 1. Stel de yaw, de toonhoogte, de hoogte en de zijligging zo in dat de bundel loodrecht door de lens van het centrum van de TAG gaat.

    • 2. de monstervoorbereiding.

    1. Voorbereiding van vaste deeltjes
      1. Verdun 190 nm fluorescerende kralen naar ~ 5 × 108 kralen/mL in PBS. Voeg 400 µL kralen oplossing op een dekglaasje aan en mount op de monsterhouder van de piëzo-elektrische fase (het aantal kralen hangt af van de monsterhouder; de diameter van de monsterkamer houder gebruikt hier is 18 mm). Voor de kralen gebruikt hier, PBS zorgt ervoor dat de deeltjes te storten op het dekglaasje aan.
    2. Gratis bewegende deeltjes voorbereiding
      1. Verdun 110 nm fluorescerende kralen naar ~ 5 × 108 kralen/mL met DI water. Voeg 400 µL kralen oplossing op een dekglaasje aan en mount op de monsterhouder van de piëzo-elektrische fase.

    3. Optimaliseer bijhouden van Parameters

    1. Raster scan vaste deeltjes
      1. Een steekproef van vaste deeltjes zetten de Microscoop.
      2. Inschakelen van de laser, micropositioner controller, piëzo-controller voor nanopositioner, TAG lens controller en EOD-controller. Merk op dat de volgorde niet kritisch is. De piezo-nanopositioner in gesloten lus worden uitgevoerd.
      3. Raster scannen het monster in XYZ met behulp van een aangepaste software scanprogramma (Figuur S3, software beschikbaar op verzoek van de auteurs), die de 2D-EOD rijdt in een knight's tour (Figuur 2), verzamelt graven van de APD, rijdt de piezo nanopositioner, en positie berekening (Figuur S2). De stap-grootte is 40 nm en het scannen bereik is 2 µm.
        1. Om te plaatsen het dekglaasje aan op de focus van de doelstelling, de fluorescentie emissie filter verwijderen en gebruik de reflectie van de laser van het dekglaasje aan om te maximaliseren van de intensiteit van het signaal als een functie van de Z-positie van de micropositioner. Na het plaatsen van het monster op het brandvlak, filter plaatsen, terug de fluorescentie emissie.
        2. Open het scannerprogramma. Stel de scannen bereik en de stap-grootte door het getal in de 'start', 'finish' en 'stap' te typen. Stelt u eerst een groot scannen bereik en de stap-grootte te vinden van een deeltje (bijv, 10 x 10 µm bereik met 200 nm stap-grootte). Na het vinden van het deeltje, krimpen van het scannen bereik en stap verkleinen (bijv., 2 x 2 µm bereik met 100 nm stap-grootte). Klik op de knop 'scan' om het uitvoeren van een scan 3D raster om te zoeken naar de fluorescerende focus.
    2. TAG lens instellingen (Zie ook Figuur 3)
      1. Klik op de TAG software voor de controle van de lens. Klik achtereenvolgens op 'verbinden', 'inschakelen'.
      2. Als u de fase van de uitvoer van de trigger-signalen, is het nodig te wijzigen van de uitvoermodus voor de trigger. Wijzig eerst de modus van 'RGB' naar 'Multiplane' en wijzig het terug. Nu de fase kan worden veranderd (Figuur 3b).
      3. Instellen van de fase van de uitvoer als 0 °, 90 ° en 270 °. Terwijl alle drie fasen die betrekking hebben op de faseruimte kunnen worden gebruikt, deze drie zijn gevonden te werken goed empirisch (Figuur 3 c).
      4. Selecteer de 68.500 Hz frequentie-instelling.
      5. Om te zoeken naar de optimale frequentie is het vaak nodig om te veranderen van de frequentiebereik. Klik op 'Geavanceerd', 'instellen'. Wijziging van de ' Max. Freq(Hz)' van kolom 0 van 70.000 Hz tot 71,500 Hz. Dit kan worden aangepast aan wat frequentiebereik geschikt is. Klik op 'Bewaar kalibratie', 'Exit kalibratie' (figuur 3d).
      6. Om de nieuwe kalibratie effectieve, de resonantie overschakelen naar een andere frequentie (bijvoorbeeld, 189,150 Hz) en vervolgens overgeschakeld terug naar de 68.500 Hz frequentie-instelling (de 3e figuur).
      7. De amplitude geleidelijk veranderen naar 35%. Klik op 'Vergrendelen resonantie'. Nadat de frequentie is vergrendeld, klikt u op 'Ontgrendelen resonantie' (figuur 3e). De lens van de TAG is klaar nu te gebruiken.
      8. Kalibreren, wijzigt u de parameters die worden gebruikt in de schatting te maken van de geschatte positie gelijk is aan het echte standpunt, zoals weergegeven in figuur 4e, f. ingangsbereik het scannen van x, y, en z en klik op de 'scan' knop voor het scannen van het monster in XYZ te bewegen de deeltjes via de bewegende laser plek. De positie van het deeltje moet het wordt gescand door de laser focus eens met het standpunt van de geschatte deeltje bepaald door de positie schatting lus (Figuur S1). De relatie tussen de geschatte positie of echte (Figuur 4 d) kan worden geëxtraheerd uit geschatte positie beelden (figuur 4f). Als de standpunten niet instemt, wijzig de waarden van laser positie (ck) gebruikt in de positie schatting lus (Figuur S1).
      9. Uitlijnen van TAG objectief
        1. Als de TAG lens-controller uitgeschakeld is, gescande de raster afbeeldingen van het (hieronder beschreven) deeltje, genomen vóór het installeren van TAG lens en na installeren TAG lens er identiek ziet. Vervolgens uitvoeren fluorescerende deeltje Z stapel scannen door het bewegen van de doelstelling met de z-nanopositioner om af te stemmen op de positie en hoek van TAG lens (Figuur 4). Tune de positie van de TAG lens zolang er geen geen drift in de beelden van de deeltjes in de XY-oppervlakte langs de Z-richting, die wordt bereikt wanneer er geen verandering in de XY-positie van het deeltje als een functie van de positie op de Z (Figuur 4 d is). De trackingsysteem is klaar voor gebruik na uitlijning van de TAG-lens.
    3. Installatie van sCMOS camera voor toezicht op deeltje
      1. Installeer een sCMOS camera om te visualiseren deeltjes terwijl ze worden bijgehouden. Installeer de sCMOS pas nadat het alle onderdelen van de tracking-systeem zijn geïnstalleerd en geoptimaliseerd.
    Laad een vaste fluorescerende deeltje monster naar de Microscoop en tracking programma één deeltje in het objectieve focal volume vergrendelen uit te voeren. Vervolgens installeert u de 100 mm brandpuntsafstand lens (Figuur 1: L8) en sCMOS. De sCMOS positie aanpassen zodat het beeld van het deeltje is gericht op de kleinste en de slimste plek.

    4. real-time 3D volgen van het verspreiden van vrije nanodeeltjes

    1. Zet de 110 nm vrij bewegen deeltje monster op de Microscoop.
    2. Inschakelen van laser, micro-positioner controller, piëzo-controller voor nanopositioner, TAG lens controller en EOD-controller. De piezo-nanopositioner in open lus worden uitgevoerd. Instellen van de software TAG objectief volgens stap 3.2.
    3. Open en voer de tracking-software (beschikbaar op verzoek van de auteurs). Stel de positie schatting parameters geoptimaliseerde standaardwaarden, die werden gevonden in sectie 3.
    4. Om te plaatsen het dekglaasje aan op de focus van de doelstelling, de fluorescentie emissie filter verwijderen en gebruik de reflectie van de laser van het dekglaasje aan om te maximaliseren van de intensiteit van het signaal als een functie van de Z-positie van de micropositioner. Na het vinden van het dekglaasje aan, de focus positie 15 µm om zich te concentreren op de laser weg van het dekglaasje aan en in de oplossing te verhogen. Terug de fluorescentie emissie filter plaatsen.
    5. Stel de integrale controle-constanten zijn. De integrale controle-constanten zijn instelbaar beginnen op een lage waarde en langzaam verhogen totdat oscillaties kunnen worden gezien in het deeltje van positie uitlezingen. Zodra oscillaties worden waargenomen, stel de integrale controle-constanten zijn op 80% van de waarde die de trillingen veroorzaakt. Typische waarden zullen rond 0,012 voor de XY 'integraal gewin' en 0.004 voor de Z 'integraal winst'.
    6. De tracking van de drempelwaarden in 'Track drempel' en 'Track Minimum' en het bijhouden van experiment starten door te klikken op 'Zoeken' en 'Auto Track'. De drempel voor de afsluitende tracking ligt iets hoger dan het achtergrondniveau en de drempel voor het genereren van tracking is ongeveer twee keer hoger dan de achtergrond. Hier, de drempel voor het genereren van tracking is 3 kHz en de drempel voor het einde van het traject is 1,5 kHz.

    Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Resultaten

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Vaste deeltjes scannen (Figuur 4) en vrij verspreiden 110 nm fluorescerende deeltje bijhouden (Figuur 5) werden uitgevoerd volgens de bovenstaande protocol. Het scannen van de deeltjes werd uitgevoerd door het bewegen van de piëzo-elektrische nanopositioner en bin fotonen, terwijl tegelijkertijd de berekening van het deeltje van naar schatting positie op elk punt in de scan. Het scannen afbeelding toont een vierkant van zelfs int...

    Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Discussie

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Hoewel vele verscheidenheden van 3D één deeltje bijhouden methoden naar voren zijn gekomen in de afgelopen jaren, is robuuste real-time tracking van 3D diffusie van de hoge snelheid bij lage foton graaf tarieven met een eenvoudige opstelling nog steeds een uitdaging, die de toepassing ervan op belangrijke biologische beperkt problemen. De 3D-DyPLoT methode beschreven in deze protocoladressen deze uitdagingen in een verschillende manieren. Ten eerste zijn de excitatie en detectie trajecten vereenvoudigd sterk ten opzichte...

    Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Openbaarmakingen

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

    Dankbetuigingen

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Dit werk werd gesteund door de National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health award onder nummer R35GM124868 en door Duke University.

    Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Materialen

    Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
    NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
    2D Electro-optic Deflector ConOpticsM310A2 vereist
    Voeding voor EODConOptics412Converteert FPGA-uitvoer naar hoge spanning voor EOD
    TAG  LensTAG OpticsTAG 2.0Wordt gebruikt om de laser langs de axiale richting af te buigen
    XY piezo-elektrische nanopositionerMadCity LabsNano-PDQ275HSWordt gebruikt om het monster te verplaatsen om het deeltje in het objectief focale volume te vergrendelen in 
    Z piezo-elektrische nanoposiitonerMadCity LabsNano-OP65HSWordt gebruikt om het objectieflens te verplaatsen om het diffunderende deeltje te volgen
    MicropositionerMadCity LabsMicroDriveWordt gebruikt om het monster grof te positioneren en te evalueren
    ObjectieflensZeissPlanApoHoge numerieke apertuur vereist voor de beste gevoeligheid. 100X, 1.49 NA, M27, Zeiss
    sCMOS-cameraPCOpco.edge 4.2Wordt gebruikt om de positie van het deeltje te bewaken
    APDExcelitasSPCM-ARQH-15Lage donkere tellen gunstig
    Programmeerbare poortarrayNational InstrumentsNI-7852r
    SoftwareNational InstrumentsLabVIEW
    Tracking-excitatilaserJDSUFCD488-30
    LensThorLabsAC254-150-A-MLL1
    LensThorLabsAC254-200-A-MLL2
    PinholeThorLabsP75SPH
    Glan-Thompson-polarisatorThorLabsGTH5-AGT
    HalfgolfplaatThorLabsWPH05M-488WP
    LensThorLabsAC254-75-A-MLL3
    LensThorLabsAC254-250-A-MLL4
    LensThorLabsAC254-200-A-MLL5
    LensThorLabsAC254-200-A-MLL6
    Dichroic spiegelChromaZT405/488/561/640rpcDC
    Fluorescentie-emissiefilterChromaD535/40mF
    10/90 beamsplitterChroma21012BS
    PBSSigmaD8537
    190 nm fluorescente nanodeeltjesBangs laboratoriesFC02F/9942
    110 nm fluorescente nanodeeltjesBangs laboratoriesFC02F/10617
    DekglasFisher Scientific12-545A
    PowermeterThorlabsPM100D
    CMOSThorlabsDCC1545M
    IrisThorlabsSM1D12D
    MicroscoopMad City LabsRM21

    Referenties

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
    2. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
    3. Jones, S. A., Shim, S. H., He, J., Fast Zhuang, X. W. Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells. Nat. Methods. 8 (6), 499-505 (2011).
    4. Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
    5. Shtengel, G., Galbraith, J. A., Galbraith, C. G., Lippincott-Schwartz, J., Gillette, J. M., Manley, S., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 3125-3130 (2009).
    6. Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
    7. Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nat. Methods. 5 (5), 417(2008).
    8. Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Methods. 8 (12), 1044(2011).
    9. Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination. Nat. Methods. 6 (5), 339(2009).
    10. Schermelleh, L., Carlton, P. M., Haase, S., Shao, L., Winoto, L., Kner, P., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
    11. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198, 82-87 (2000).
    12. Persson, F., Bingen, P., Staudt, T., Engelhardt, J., Tegenfeldt, J. O., Hell, S. W. Fluorescence Nanoscopy of Single DNA Molecules by Using Stimulated Emission Depletion (STED). Angew. Chem. 50 (24), 5581-5583 (2011).
    13. Hein, B., Willig, K. I., Hell, S. W. Stimulated emission depletion (STED) nanoscopy of a fluorescent protein-labeled organelle inside a living cell. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14271-14276 (2008).
    14. Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (15), 8206-8210 (2000).
    15. Welsher, K., Yang, H. Multi-resolution 3D visualization of the early stages of cellular uptake of peptide-coated nanoparticles. Nat. Nano. 9 (3), 198-203 (2014).
    16. Welsher, K., Yang, H. Imaging the behavior of molecules in biological systems: breaking the 3D speed barrier with 3D multi-resolution microscopy. Faraday Discuss. 184 (0), 359-379 (2015).
    17. Xu, C. S., Cang, H., Montiel, D., Yang, H. Rapid and quantitative sizing of nanoparticles using three-dimensional single-particle tracking. J. Phys. Chem. C. 111 (1), 32-35 (2007).
    18. Cang, H., Xu, C. S., Montiel, D., Yang, H. Guiding a confocal microscope by single fluorescent nanoparticles. Opt. Lett. 32 (18), 2729-2731 (2007).
    19. Cang, H., Wong, C. M., Xu, C. S., Rizvi, A. H., Yang, H. Confocal three dimensional tracking of a single nanoparticle with concurrent spectroscopic readouts. Appl. Phys. Lett. 88 (22), 223901(2006).
    20. Han, J. J., Kiss, C., Bradbury, A. R. M., Werner, J. H. Time-Resolved, Confocal Single-Molecule Tracking of Individual Organic Dyes and Fluorescent Proteins in Three Dimensions. ACS Nano. 6 (10), 8922-8932 (2012).
    21. Wells, N. P., Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Phipps, M. E., Cutler, P. J., Lidke, D. S., et al. Time-Resolved Three-Dimensional Molecular Tracking in Live Cells. Nano Lett. 10 (11), 4732-4737 (2010).
    22. Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Werner, J. H. Three-dimensional tracking of individual quantum dots. Appl. Phys. Lett. 91 (22), (2007).
    23. McHale, K., Mabuchi, H. Intramolecular Fluorescence Correlation Spectroscopy in a Feedback Tracking Microscope. Biophys. J. 99 (1), 313-322 (2010).
    24. McHale, K., Mabuchi, H. Precise Characterization of the Conformation Fluctuations of Freely Diffusing DNA: Beyond Rouse and Zimm. J. Am. Chem. Soc. 131 (49), 17901-17907 (2009).
    25. McHale, K., Berglund, A. J., Mabuchi, H. Quantum Dot Photon Statistics Measured by Three-Dimensional Particle Tracking. Nano Lett. 7 (11), 3535-3539 (2007).
    26. Juette, M. F., Bewersdorf, J. Three-Dimensional Tracking of Single Fluorescent Particles with Submillisecond Temporal Resolution. Nano Lett. 10 (11), 4657-4663 (2010).
    27. Katayama, Y., Burkacky, O., Meyer, M., Bräuchle, C., Gratton, E., Lamb, D. C. Real-Time Nanomicroscopy via Three-Dimensional Single-Particle Tracking. ChemPhysChem. 10 (14), 2458-2464 (2009).
    28. Perillo, E. P., Liu, Y. -L., Huynh, K., Liu, C., Chou, C. -K., Hung, M. -C., et al. Deep and high-resolution three-dimensional tracking of single particles using nonlinear and multiplexed illumination. Nat Commun. 6, (2015).
    29. Hou, S., Lang, X., Welsher, K. Robust real-time 3D single-particle tracking using a dynamically moving laser spot. Opt. Lett. 42 (12), 2390-2393 (2017).
    30. Chenouard, N., Smal, I., de Chaumont, F., Maska, M., Sbalzarini, I. F., Gong, Y., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nat Meth. 11 (3), 281-289 (2014).
    31. Shechtman, Y., Weiss, L. E., Backer, A. S., Sahl, S. J., Moerner, W. E. Precise 3D scan-free multiple-particle tracking over large axial ranges with Tetrapod point spread functions. Nano Lett. 15 (6), 4194-4199 (2015).
    32. Lee, H. -lD., Sahl, S. J., Lew, M. D., Moerner, W. E. The double-helix microscope super-resolves extended biological structures by localizing single blinking molecules in three dimensions with nanoscale precision. Appl. Phys. Lett. 100 (15), 153701(2012).
    33. Pavani, S. R. P., Thompson, M. A., Biteen, J. S., Lord, S. J., Liu, N., Twieg, R. J., et al. Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 2995-2999 (2009).
    34. Sancataldo, G., Scipioni, L., Ravasenga, T., Lanzanò, L., Diaspro, A., Barberis, A., et al. Three-dimensional multiple-particle tracking with nanometric precision over tunable axial ranges. Optica. 4 (3), 367-373 (2017).
    35. Balzarotti, F., Eilers, Y., Gwosch, K. C., Gynnå, A. H., Westphal, V., Stefani, F. D., et al. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 355 (6325), 606(2017).
    36. Duocastella, M., Theriault, C., Arnold, C. B. Three-dimensional particle tracking via tunable color-encoded multiplexing. Opt. Lett. 41 (5), 863-866 (2016).
    37. Duocastella, M., Sun, B., Arnold, C. B. Simultaneous imaging of multiple focal planes for three-dimensional microscopy using ultra-high-speed adaptive optics. BIOMEDO. 17 (5), (2012).
    38. Mermillod-Blondin, A., McLeod, E., Arnold, C. B. High-speed varifocal imaging with a tunable acoustic gradient index of refraction lens. Opt. Lett. 33 (18), 2146-2148 (2008).
    39. Wang, Q., Moerner, W. E. Optimal strategy for trapping single fluorescent molecules in solution using the ABEL trap. Appl. Phys. B. 99 (1), 23-30 (2010).
    40. Fields, A. P., Cohen, A. E. Optimal tracking of a Brownian particle. Opt. Express. 20 (20), 22585-22601 (2012).
    41. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes. Biophys. J. 82 (5), 2775-2783 (2002).

    Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Herprints en machtigingen

    Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

    Toestemming aanvragen

    Trefwoorden

    Real time 3D Single Particle Tracking3D Dynamic Photon Localization Tracking2D Electro optic DeflectorTunable Acoustic Gradient LensAvalanche Photo DiodeField Programmable Gate ArrayPiezoelectric NanopositionerFluorescent Bead TrackingPhoton Counting RatePosition Estimation Algorithm

    Gerelateerde artikelen