Methodenartikel

De oprichting van een Long kolonisatie Assay voor het circulerende Tumor visualisatie van de cel in de weefsels van de longen

DOI:

10.3791/56761

⸱

16 juni 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University, 3Trauma Office, Children's National Health System

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een dierlijk model is nodig om het ontcijferen van de rol van circulerende tumorcellen (CTCs) bij de bevordering van longkanker kolonisatie tijdens kanker uitzaaiingen. Hier, we vastgesteld en met succes uitgevoerd een in vivo assay op specifiek proef de eis van polymere fibronectine (polyFN) vergadering over CTCs voor longkanker kolonisatie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metastase is de belangrijke doodsoorzaak kanker. De rol van circulerende tumorcellen (CTCs) biij van uitzaaiing van de kanker, waarin Long kolonisatie door CTCs kritisch aan de vroege Long metastatische processen bijdraagt, heeft krachtig onderzocht. Als zodanig, zijn dierlijke modellen de enige aanpak die de volledige systemische proces van metastase vangt. Gezien het feit dat er zich problemen in eerdere experimentele designs voordoen voor de behandeling van de bijdragen voor CTCs aan bloedvat extravasation, we een in vivo -bepaling van het Long-kolonisatie vastgesteld waarin een lange-termijn-fluorescentie cel-tracer, carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), werd gebruikt voor het label van de geschorste tumorcellen en longkanker perfusie Schakel niet-specifiek gevangen CTCs voorafgaand aan longkanker verwijdering, confocal imaging en kwantificering werd uitgevoerd. Polymere fibronectine (polyFN) is geassembleerd op CTC oppervlakken is gebleken te bemiddelen Long kolonisatie in de uiteindelijke oprichting van uitgezaaide tumor weefsels. Hier, als u wilt specifiek testen de eis van polyFN vergadering op CTCs voor longkanker kolonisatie en extravasation, we korte termijn uitgevoerd Long kolonisatie testen waarin geschorst Lewis lung carcinoma cellen (LLCs) stabiel uiten FN-shRNA (shFN) of Scramble-shRNA (shScr) en vooraf gelabeld met 20 μM van CFSE waren intraveneus geënt in C57BL/6 muizen. Wij succesvol gebleken dat de capaciteiten van shFN LLC cellen te koloniseren de muis longen werden aanzienlijk verminderd ten opzichte van shScr LLC cellen. Daarom kan dit op korte termijn methodologie algemeen worden toegepast om aan te tonen specifiek de mogelijkheid voor CTCs binnen het verkeer om te koloniseren de longen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metastase is de belangrijkste oorzaak van kanker overlijden1,2. Tumorcellen uit primaire weefsels verkregen Voer het verkeer in suspensie en overleven van verschillende hematogene uitdagingen, bijvoorbeeld, anoikis, immuun aanvallen en schade als gevolg van de shear stress van bloeddruk of geometrische beperkingen, voordat ze zijn kundig voor koloniseren verre organen, een belangrijke stap die het succes van metastase3,,4,,5,6te dicteren. Daarom, krachtige inspanningen momenteel gedaan in karakterisering van circulerende tumorcellen (CTCs) en het correleren van deze kenmerken met maligniteit van de tumor, uitzaaiingen en overlevingskansen bij kanker patiënten7,8 , 9. aangezien het proces van uitzaaiing van kanker specifiek een in vivo -evenement toont, dierlijke modellen zijn de enige aanpak die de volledige systemische proces van metastase10,11,12 vangt .

CTCs geworden uitgezaaide tumor weefsels via meerdere cellulaire gebeurtenissen met inbegrip van de kolonisatie van verre organen1,2. Echter, de meest gebruikte metastase assays13,14,15 bieden niet een manier om het observeren van CTC kolonisatie van verre organen. Een in vivo test ontwerp voor CTC kolonisatie visualisatie is daarom dringend noodzakelijk. Hoewel verschillende in vivo en ex vivo korte blijven termijn Long kolonisatie testen zijn ontworpen, problemen en nadelen. Bijvoorbeeld, terwijl groene fluorescentie proteïne (GFP)-overexpressing tumor cellen zijn gebruikt in deze testen22,23, het kost tijd om stabiel transfect en kloon van tumorcellen met voldoende GFP fluorescerende intensiteit onder de Microscoop. Evenzo, voorbijgaande kleuring van tumorcellen met de lange termijn cel tracer CFSE is werkzaam ter vervanging van de tumorcellen GFP-uitdrukken, maar nog steeds moeilijk te beoordelen of de CFSE-geëtiketteerden tumorcellen zijn gekoppeld of alleen aanwezig binnen de therapieën voor de verwijderde verre organen16,17.

Polymere fibronectine (polyFN) is geassembleerd op oppervlakken voor CTCs is gebleken dat kritisch bijdragen tot de uiteindelijke oprichting van uitgezaaide tumor weefsels18,19,20,21,22 . Hier, we uitgevoerd korte termijn Long kolonisatie testen die in zwevende Lewis lung carcinoma cellen (LLCs) stabiel uiting van FN-shRNA (shFN) of scramble-shRNA (shScr) en vooraf gemarkeerd met CFSE intraveneus in C57BL/6 muizen geënt werden. Na 2-3 dagen, werden muis longen eerst geperfundeerd met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) voor het verwijderen van niet-vastgemaakte CTCs binnen de therapieën alvorens te worden onderworpen aan confocale microscopie en kwantificering van LLCs Long-koloniseren. We toonden duidelijk dat het aantal Long-koloniseren shFN LLCs en tumor knobbeltjes aanzienlijk werden verminderd in vergelijking met shScr LLCs, aanzienlijk ondersteunend de rol van polyFN vergadering op CTCs in het vergemakkelijken van de kolonisatie en de groei van CTCs in de longen. Onze studie nog verdere onderzoek voor de rol van polyFN in kanker uitzaaiingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle experimenten op muizen werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van ons Instituut (de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren, NCKU Medical College).

1. voorbereiding van de instrumenten, cultuurmedia en gerechten

  1. Voordat u begint de experimentele protocollen, verkrijgen steriele chirurgische hechtingen, 1 mL spuiten met 26G/0,5 cm naald (voor staart-veneuze injectie), 3 mL spuiten met 24G/3 cm naald (voor longkanker perfusie), Dulbecco van bewerkt Eagle Media (DMEM), trypsine-EDTA-oplossing (5 g/L trypsine en 0.53 mM), foetale runderserum (FBS), 1 x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM nb2PHO4en 1,8 mM KH2PO4) en 6 cm cultuur gerechten.

2. voorbereiding en herstel van tumorcellen in suspensie

  1. Bereiden van steriele Dulbecco bewerkt Eagle Media (DMEM) bevattende 10% of 20% FBS en 2 mM L-glutamine, 1 x PBS en 0,05% vers toevoegen trypsine-EDTA.
  2. Cultuur van de cellen in de DMEM aangevuld met 10% FBS bij 37 ° C en ze groeien zolang er geen samenvloeiing van 70-80% in de cultuur-schotel.
  3. Verwijder het medium van de cultuur (DMEM) van de gerechten, gevolgd door twee wasbeurten met 2 mL steriele 1 x PBS.
  4. Voeg vervolgens 1 mL van 0,05% trypsine-EDTA in de gerechten ter grondig dekking van alle cellen. Onmiddellijk verwijderen van 800 μL van de oplossing en laat slechts 200 μl in de gerechten. Incubeer de gerechten bij 37 ° C gedurende 30 s naar 1 min (afhankelijk van het celtype) en wachten totdat de meerderheid van de cellen in de onderbroken toestand.
  5. Voeg 1 mL verse DMEM met 10% FBS rechtstreeks in de gerechten om te stoppen met de enzymatische activiteit van trypsine en krachtig Pipetteer de celsuspensie het op en neer met een pipet 1000 µL ter voorbereiding van de schorsing van een enkele cel.
  6. Overdracht van de cellen van de schotel naar een 1,5 mL microcentrifuge buis, en spin down de cellen bij kamertemperatuur op 162 x g gedurende 3 minuten.
  7. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de cellen van de tumor in 1,5 mL DMEM met 20% FBS en eind over de cellen in suspensie bij 37 ° C gedurende 2 uur roteren.
    Opmerking: Als het medium geel tijdens het herstel, wisselen de oud medium met verse medium dat 20% FBS.

3. fluorescentie kleuring en analyse van tumorcellen in suspensie met Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

  1. Na herstel van de cel in suspensie, de juiste levensvatbare cellen getallen tellen met Trypan blauw in een kamer voor de titrating van de fluorescentie kleuring doses tellen Neubauer en voor staart veneuze injectie.
  2. Spin down de cellen bij 162 x g bij kamertemperatuur voor 3 min en resuspendeer die de Ingehuld cellen in 1 mL gesteriliseerd 1 x PBS, gevolgd door de kamertemperatuur centrifugeren op 162 x g gedurende 3 minuten.
  3. Resuspendeer de Ingehuld cellen in 500 µL van 1 X PBS met 10% FBS en 0, 5, 10, 20 of 40 µM CFSE voor dosistitraties, en de celsuspensie bij 37 oC gedurende 10 minuten in het donker uit te broeden.
  4. Spin down de cellen bij 162 x g bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten en resuspendeer de Ingehuld cellen met 4 mL DMEM met 1% FBS. Herhaal deze stap van wassen drie keer. Resuspendeer de Ingehuld cellen met 4 mL DMEM alleen voor de laatste wasbeurt.
  5. De cellen van CFSE-label onverminderd fluorescentie-activated cell sorting (FACS) analyse om te kwantificeren van de intensiteit van de fluorescentie van een enkele cel of staart veneuze injectie.
    Opmerking: Houd de cellen op ijs voordat de FACS analyse of staart ader injecties wordt uitgevoerd.

4. lung kolonisatie Assay

  1. De cellen met het label met 20 µM CFSE bereiden (verwijs naar stap 3.1 via 3.4).
    Opmerking: Etikettering van tumorcellen, gebaseerd op de resultaten van de titratie van de analyse van FACS beslissen de dosis van de werken van CFSE (zie stap 3.3).
  2. Opwarmen van de staarten van 4-6 week-oude mannelijke C57BL/6 muizen (6 muizen) met een HQI-lamp voor 5-10 min op basis van muis-door-mouse muis staart aderen verwijden.
  3. Grondig meng en CFSE-geëtiketteerden tumorcellen gecombineerd met een spuit van 1 mL (26Gx1/2), het vermijden van alle bubbels in de celsuspensie (met een definitieve celdichtheid van 5 x 106 cellen/mL).
  4. Zorgvuldig injecteren 1 x106 CFSE-geëtiketteerden tumorcellen in 200 µL van DMEM in de muis staart ader, die moet worden ingediend in de afdekking van een muis.
    Opmerking: Tijdens de injectie, als de naald direct in het lumen van de ader van de staart geplaatst wordt, tumorcellen moeten gemakkelijk zonder worden geleverd in de circulatie moeten duwen hard op de spuit. Als het is moeilijk te duwen de tumorcellen via, zijn ze waarschijnlijk ingespoten buiten de staart ader, in de subcutane ruimte.
  5. Verdeel de muizen die intraveneus de CFSE-geëtiketteerden tumorcellen in twee groepen ontvangen: één groep zal ondergaan Long perfusie gevolgd door confocale microscopie en ImageJ kwantificering in de bepaling van de kolonisatie longkanker en de andere blijft alleen voor 4-5 weken in de lange termijn Long kolonisatie assay.
  6. Op 20, 38 of 45 h en 1 x 106 tumorcellen intraveneus geïnjecteerd tijdens een tijd cursus - en dosisafhankelijk titratie, anesthetize tumor-dragende muizen met 50-75 mg/kg zoletil 50, dat een goed aanvaard en goede anesthetizer23 is.
    Opmerking: Gebruik dierenarts zalf op de muizen van ogen om te voorkomen dat droogte terwijl onder verdoving.
  7. Overlangs snijden de huid en de subcutane weefsels uit de buik naar de regio van de borst met een chirurgische schaar. Open de pleurale holte met een chirurgische schaar en pincet volledig bloot het hart en de longen.
    Opmerking: Wees voorzichtig om te voorkomen dat afsnijden van bloedvaten.
  8. Stropdas de superieure vena cava (SVC) en de vena cava inferior (IVC) met steriele chirurgische hechtingen om te voorkomen dat de terugvoer van de oplossing van de perfusie tijdens Long perfusie.
  9. Snijd de wand van de linkerventrikel met een chirurgische schaar te openen een horizontalis (ongeveer 2-4 mm) om de afvoer van de perfusie-oplossing van de longen.
  10. 1 x PBS injecteren in het rechterventrikel met een spuit met 3 mL en verwijder de gedraineerde oplossing met constante zuigkracht tijdens Long perfusie totdat de longen van een roodachtige kleur tot volledig bleke wenden.

5. confocal microscopische beeldvorming en analyse van Long-gekoloniseerd tumorcellen

  1. Verwijder de nu-pale longen uit de pleurale Holte en de vijf lobben scheiden door het weg te snijden van de ligamenten van de luchtpijp en bindweefsel met chirurgische schaar en pincet24.
  2. Bereiden een brancard-achtige Long houder zoals weergegeven in figuur 3B door wikkelen van een nylon hechtdraad rond twee metalen staven om te produceren een reticulate textuur met een spatie tussen de twee staven voor de plaatsing van longkanker lobben. Stel de Long houder in een 6 cm schotel.
    Opmerking: De houder van de Long wordt gebruikt om te stabiliseren van de Long lobben onder het objectief van een confocal microscoop.
  3. Indienen en monteren van de Long lobben op de reticulate textuur van de houder van de longen. Cover en Bevochtig de lobben van de Long met 1 x PBS.
  4. Onder voorbehoud van de cultuur van de 6-cm schotel herbergen de lobben van de longen op de Long houder confocale microscopie fluorescentie beelden opnemen van de tumorcellen Long-koloniseren.
  5. Gebruik voor imaging, objectieven (5 X, MPLN, NB: 0.1, WD: 20, lucht).
  6. Draai het wieltje van de filter aan NIBA (excitatie/emissie; 470-495 nm/510-550 nm) en gebruik een 488 nm laser te wekken CFSE, duidelijk visualiseren beelden van fluorescentie stippen in de lobben van de longen.
  7. Draai het wieltje van de filter te R690 (voor MaiTai HP Mussel laser) om te scannen met 2.0 µs/pixel scannen vaart en optimaliseren van de HV, Gain naam module en verschuiving niveaus.
  8. Fotograferen fluorescentie (512 x 512 pixels) met behulp van de Microscoop software met een 10 µs/pixel scansnelheid.
  9. Kwantificeren en de microscopische beelden met behulp van ImageJ en GraphPad software als eerder beschreven21statistisch te analyseren.

6. lange termijn Long kolonisatie testen

Let op: Herhaal stap 4.1 tot 4.5.

  1. De muizen offeren na tumor cel inoculatie voor 4-5 weken en monteren van hun longen met Bouin van vloeibare25 voor 1 tot 2 dagen.
  2. Kwantificeren en de knobbeltjes van de tumor uit de longen van de muizen met software21statistisch te analyseren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voordat u de in-vivo -bepaling van het Long-kolonisatie uitvoert zoals wordt geïllustreerd in figuur 1A om te testen of polyFN op zwevende tumorcellen bemiddelt Long kolonisatie en/of extravasation bij het vergemakkelijken van metastase, we eerst getitreerd verschillende concentraties van CFSE, een fluorescerende stof die cel permeabele covalent conjugaten van intracellulaire amine-bevattende moleculen26,

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Samen met de lange termijn Long kolonisatie testen, korte termijn methodologie we hier gebruikt om te evalueren in vivo Long kolonisatie door CTCs in verre organen duidelijk onthuld en de specifieke rol van polyFN gemonteerd op CTCs in koloniseren gedifferentieerd de longen, wat vervolgens tot de extravasation en metastatische processen18,19,20,21 leidde. Hoewel cellen met lange termij...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedank Dr. Ming-Min Chang en Ms. Ya-Hsin Cheng voor hun technische ondersteuning. Dit werk werd gesteund door het ministerie van wetenschap en de technologie van Taiwan (meeste-103-2325-B-006-009, meeste-104-2325-B-006-001, meeste-105-2325-B-006-001 en MOST-106-2320-B-006-068-MY3) en het ministerie van volksgezondheid en welzijn (MOHW106-TDU-B-211-144004). Wij zijn ook dankbaar voor de steun van het onderzoekslaboratorium van de kern van de College of Medicine, National Cheng Kung University, voor hun multi foton confocal microscoop.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Materiaal
Bovine Serum Albumine (BSA)Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)101-9048-46-8
Bouin's vloeistofMCC(medical chemical corporation)/POISON456-A-1GL
CFSE Proliferatiekleurstofebiosciences65-0850-85Volledige naam: Carboxyfluorescein succinimidyl ester
Dulbecco's aangepast Eagle Media (DMEM) (Gibco)ThermoFisher Scientific12100-061
Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)101-6381-92-6Voor bereide trypsine-EDTA oplossing( Uiteindelijke concentratie: 0.53mM ) 
Fetaal bovien serum (FBS)(Gibco)ThermoFisher Scientific10437-028
Lewis longcarcinoom (LLC)ATCC, Manassas, VA, USACRL-1642
L-Glutamine, USP (Gibco)ThermoFisher Scientific21051-024
Kaliumchloride (KCl)Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)101-7447-40-7Voor bereide 1X PBS ( Uiteindelijke concentratie: 2.7mM )
Kaliumfosfaatmonobasisch (KH2PO4)Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)101-7778-77-0Voor bereide 1X PBS ( Uiteindelijke concentratie: 1.8mM )
Natriumchloride (NaCl)Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)101-7647-14-5Voor bereide 1X PBS ( Uiteindelijke concentratie: 137mM )
Natriumfosfaatdibasisch (Na2HPO4)Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)101-10039-32-4Voor bereide 1X PBS ( Uiteindelijke concentratie: 10mM )
Trypan BlauwSigma AldrichT61460.5 g mengen met 100 mL 1X PBS
TrypsineSigma AldrichT4799Voor bereide trypsine-EDTA oplossing ( Uiteindelijke concentratie: 5g/L )
Zoletil 50VirbacVerdunnen met 1X PBS 
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Apparatuur
Compacte Tafeltop Centrifuge 2420KUBOTA Co.2420
Kweekschaal (6cm)Wuxi NEST Biotechnology Co.705001
Wegwerpspuit (met naald)Perfect Medical Industry Co.24G/3 cm;3 ml & 26G/0.5 cm;1 ml
End over end mixerC.T.I YOUNG CHENNTS-20Voor herstel van geschorste cellen 
FACSCalibur (FACS)BD biosciences
PincetDimeda10.102.14
Forma Direct Heat CO2 incubatorThermo Fisher Scientific Inc.HEPA CLASS 100
Muisbegrenzer (Cylindrische Begrenzer 15-30 gm)Stoelting51338
Multifoton Confocal Microscoop BX61WIOlympusFV1000MPE
Neubauer telkamerMarienfeld-Superior640010
Chirurgische schaarDimeda08.370.11
Chirurgische hechtdraad UNIK SURGICAL SUTURES MFG. CO.NO. 0034Zwarte gevlochten zijde; niet-absorbeerbaar (25YD; U.S.P. 4/0)
1.5 mL microcentrifugebuisWuxi NEST Biotechnology Co.615001
15 mL Greiner buisGreiner bio-one188271

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Massague, J., Obenauf, A. C. Metastatic colonization by circulating tumour cells. Nature. 529 (7586), 298-306 (2016).
  2. Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Emerging Biological Principles of Metastasis. Cell. 168 (4), 670-691 (2017).
  3. Mohme, M., Riethdorf, S., Pantel, K. Circulating and disseminated tumour cells - mechanisms of immune surveillance and escape. Nat Rev Clin Oncol. 14 (3), 155-167 (2017).
  4. Steinert, G., et al. Immune escape and survival mechanisms in circulating tumor cells of colorectal cancer. Cancer Res. 74 (6), 1694-1704 (2014).
  5. Mahauad-Fernandez, W. D., Okeoma, C. M. Cysteine-linked dimerization of BST-2 confers anoikis resistance to breast cancer cells by negating proapoptotic activities to promote tumor cell survival and growth. Cell Death Dis. 8 (3), e2687(2017).
  6. Maheswaran, S., Haber, D. A. Circulating tumor cells: a window into cancer biology and metastasis. Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 96-99 (2010).
  7. Yu, M., et al. RNA sequencing of pancreatic circulating tumour cells implicates WNT signalling in metastasis. Nature. 487 (7408), 510-513 (2012).
  8. Adams, D. L., et al. Mitosis in circulating tumor cells stratifies highly aggressive breast carcinomas. Breast Cancer Res. 18 (1), 44(2016).
  9. Baccelli, I., et al. Identification of a population of blood circulating tumor cells from breast cancer patients that initiates metastasis in a xenograft assay. Nat Biotechnol. 31 (6), 539-544 (2013).
  10. Malladi, S., et al. Metastatic Latency and Immune Evasion through Autocrine Inhibition of WNT. Cell. 165 (1), 45-60 (2016).
  11. Spiegel, A., et al. Neutrophils Suppress Intraluminal NK Cell-Mediated Tumor Cell Clearance and Enhance Extravasation of Disseminated Carcinoma Cells. Cancer Discov. 6 (6), 630-649 (2016).
  12. Pattabiraman, D. R., et al. Activation of PKA leads to mesenchymal-to-epithelial transition and loss of tumor-initiating ability. Science. 351 (6277), aad3680(2016).
  13. van der Weyden, L., et al. Genome-wide in vivo screen identifies novel host regulators of metastatic colonization. Nature. 541 (7636), 233-236 (2017).
  14. Obenauf, A. C., et al. Therapy-induced tumour secretomes promote resistance and tumour progression. Nature. 520 (7547), 368-372 (2015).
  15. Genovese, G., et al. Synthetic vulnerabilities of mesenchymal subpopulations in pancreatic cancer. Nature. 542 (7641), 362-366 (2017).
  16. von Horsten, S., et al. Stereological quantification of carboxyfluorescein-labeled rat lung metastasis: a new method for the assessment of natural killer cell activity and tumor adhesion in vivo and in situ. J Immunol Methods. 239 (1-2), 25-34 (2000).
  17. Reymond, N., et al. Cdc42 promotes transendothelial migration of cancer cells through beta1 integrin. J Cell Biol. 199 (4), 653-668 (2012).
  18. Cheng, H. C., Abdel-Ghany, M., Elble, R. C., Pauli, B. U. Lung endothelial dipeptidyl peptidase IV promotes adhesion and metastasis of rat breast cancer cells via tumor cell surface-associated fibronectin. J Biol Chem. 273 (37), 24207-24215 (1998).
  19. Huang, L., et al. Protein kinase Cepsilon mediates polymeric fibronectin assembly on the surface of blood-borne rat breast cancer cells to promote pulmonary metastasis. J Biol Chem. 283 (12), 7616-7627 (2008).
  20. Chang, Y. H., et al. Secretomic analysis identifies alpha-1 antitrypsin (A1AT) as a required protein in cancer cell migration, invasion, and pericellular fibronectin assembly for facilitating lung colonization of lung adenocarcinoma cells. Mol Cell Proteomics. 11 (11), 1320-1339 (2012).
  21. Wang, Y. J., et al. Pterostilbene prevents AKT-ERK axis-mediated polymerization of surface fibronectin on suspended lung cancer cells independently of apoptosis and suppresses metastasis. J Hematol Oncol. 10 (1), 72(2017).
  22. Cheng, H. C., Abdel-Ghany, M., Pauli, B. U. A novel consensus motif in fibronectin mediates dipeptidyl peptidase IV adhesion and metastasis. J Biol Chem. 278 (27), 24600-24607 (2003).
  23. Hsu, Y. Y., et al. Thrombomodulin is an ezrin-interacting protein that controls epithelial morphology and promotes collective cell migration. FASEB J. 26 (8), 3440-3452 (2012).
  24. Arlt, M. J., Born, W., Fuchs, B. Improved visualization of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ perfusion of lung tissue and X-Gal staining of lacZ-tagged tumor cells. J Vis Exp. (66), e4162(2012).
  25. Shi, Y., Parhar, R. S., Zou, M., Al-Mohanna, F. A., Paterson, M. C. Gene therapy of melanoma pulmonary metastasis by intramuscular injection of plasmid DNA encoding tissue inhibitor of metalloproteinases-1. Cancer Gene Ther. 9 (2), 126-132 (2002).
  26. Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).
  27. Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2 (9), 2049-2056 (2007).
  28. Migone, F. F., et al. In vivo imaging reveals an essential role of vasoconstriction in rupture of the ovarian follicle at ovulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 2294-2299 (2016).
  29. Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
  30. Jiang, M., Qin, C., Han, M. Primary breast cancer induces pulmonary vascular hyperpermeability and promotes metastasis via the VEGF-PKC pathway. Mol Carcinog. 55 (6), 1087-1095 (2016).
  31. Aceto, N., et al. Circulating tumor cell clusters are oligoclonal precursors of breast cancer metastasis. Cell. 158 (5), 1110-1122 (2014).
  32. Zheng, Y., et al. Expression of beta-globin by cancer cells promotes cell survival during blood-borne dissemination. Nat Commun. 8, 14344(2017).
  33. Chen, X., et al. Retinoic acid facilitates inactivated transmissible gastroenteritis virus induction of CD8(+) T-cell migration to the porcine gut. Sci Rep. 6, 24152(2016).
  34. Saranchova, I., et al. Discovery of a Metastatic Immune Escape Mechanism Initiated by the Loss of Expression of the Tumour Biomarker Interleukin-33. Sci Rep. 6, 30555(2016).
  35. Ahmed, M., et al. An Osteopontin/CD44 Axis in RhoGDI2-Mediated Metastasis Suppression. Cancer Cell. 30 (3), 432-443 (2016).
  36. Hoffman, R. M. In vivo imaging of metastatic cancer with fluorescent proteins. Cell Death Differ. 9 (8), 786-789 (2002).
  37. Mendoza, A., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
  38. Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
  39. Wagenblast, E., et al. A model of breast cancer heterogeneity reveals vascular mimicry as a driver of metastasis. Nature. 520 (7547), 358-362 (2015).
  40. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
  41. Ragelle, H., et al. Chitosan nanoparticles for siRNA delivery: optimizing formulation to increase stability and efficiency. J Control Release. 176, 54-63 (2014).
  42. Chu, V. T., et al. Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells. Nat Biotechnol. 33 (5), 543-548 (2015).
  43. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nat Rev Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
  44. Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9 (4), 239-252 (2009).
  45. Sanchez-Laorden, B., et al. BRAF inhibitors induce metastasis in RAS mutant or inhibitor-resistant melanoma cells by reactivating MEK and ERK signaling. Sci Signal. 7 (318), ra30(2014).
  46. Torchiaro, E., et al. Peritoneal and hematogenous metastases of ovarian cancer cells are both controlled by the p90RSK through a self-reinforcing cell autonomous mechanism. Oncotarget. 7 (1), 712-728 (2016).
  47. Wan, J., et al. Establishment of monoclonal HCC cell lines with organ site-specific tropisms. BMC Cancer. 15, 678(2015).
  48. Ye, Y., Liu, S., Wu, C., Sun, Z. TGFbeta modulates inflammatory cytokines and growth factors to create premetastatic microenvironment and stimulate lung metastasis. J Mol Histol. 46 (4-5), 365-375 (2015).
  49. Morales, M., et al. RARRES3 suppresses breast cancer lung metastasis by regulating adhesion and differentiation. EMBO Mol Med. 6 (7), 865-881 (2014).
  50. Stone, J. P., et al. Mechanical removal of dendritic cell-generating non-classical monocytes via ex vivo lung perfusion. J Heart Lung Transplant. 33 (8), 864-869 (2014).
  51. Vettorazzi, S., et al. Glucocorticoids limit acute lung inflammation in concert with inflammatory stimuli by induction of SphK1. Nat Commun. 6, 7796(2015).
  52. Urade, Y., Yoshida, R., Kitamura, H., Hayaishi, O. Induction of indoleamine 2,3-dioxygenase in alveolar interstitial cells of mouse lung by bacterial lipopolysaccharide. J Biol Chem. 258 (10), 6621-6627 (1983).
  53. Hong, G., et al. Through-skull fluorescence imaging of the brain in a new near-infrared window. Nat Photonics. 8 (9), 723-730 (2014).
  54. Liu, Q., Guo, B., Rao, Z., Zhang, B., Gong, J. R. Strong two-photon-induced fluorescence from photostable, biocompatible nitrogen-doped graphene quantum dots for cellular and deep-tissue imaging. Nano Lett. 13 (6), 2436-2441 (2013).
  55. Peti-Peterdi, J., Burford, J. L., Hackl, M. J. The first decade of using multiphoton microscopy for high-power kidney imaging. Am J Physiol Renal Physiol. 302 (2), F227-F233 (2012).
  56. Duda, D. G., et al. Malignant cells facilitate lung metastasis by bringing their own soil. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21677-21682 (2010).
  57. Gupta, G. P., et al. Mediators of vascular remodelling co-opted for sequential steps in lung metastasis. Nature. 446 (7137), 765-770 (2007).
  58. Kosaka, N., et al. Neutral sphingomyelinase 2 (nSMase2)-dependent exosomal transfer of angiogenic microRNAs regulate cancer cell metastasis. J Biol Chem. 288 (15), 10849-10859 (2013).
  59. Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
  60. Jaskelioff, M., et al. Telomerase deficiency and telomere dysfunction inhibit mammary tumors induced by polyomavirus middle T oncogene. Oncogene. 28 (48), 4225-4236 (2009).
  61. Si, L. L., Lv, L., Zhou, W. H., Hu, W. D. Establishment and identification of human primary lung cancer cell culture in vitro. Int J Clin Exp Pathol. 8 (6), 6540-6546 (2015).
  62. Weng, D., et al. Metastasis is an early event in mouse mammary carcinomas and is associated with cells bearing stem cell markers. Breast Cancer Res. 14 (1), R18(2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Cirkulerende tumorcellenCFSE labelinglongperfusieconfocale microscopiefibronectine assemblageLewis longcarcinoomintraveneuze inoculatieC57BL 6 muizenfluorescentie imaging

Gerelateerde artikelen