Generatie van gestandaardiseerde en reproduceerbaar reukkolf-type cerebrale Organoids van mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

Samenvatting

Cerebrale organoids vertegenwoordigen een nieuw modelsysteem voor vroege menselijke hersenen ontwikkeling in vitroonderzoeken. Dit artikel bevat de gedetailleerde methodologie voor het efficiënt genereren van homogene dorsale reukkolf-type organoids van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen met inbegrip van kritische karakterisatie en validatie stappen.

Samenvatting

De menselijke cortex is zeer uitgebreid en vertoont een complexe structuur met specifieke functionele gebieden, bieden hogere hersenfunctie, zoals cognitie. Inspanningen te bestuderen van de menselijke hersenschors ontwikkeling hebben beperkt gebleven door de beschikbaarheid van modelsystemen. Vertalen van de resultaten van knaagdier studies op het menselijke systeem is beperkt door soorten verschillen en studies over primaire weefsels worden belemmerd door een gebrek aan beschikbaarheid van weefsel, alsmede de ethische bezwaren. Recente ontwikkeling in menselijke pluripotente stamcellen (PSC) technologie omvatten de rendering van driedimensionale (3D) zelf-organiserende organotypic cultuur systemen, die aan een bepaalde mate hersenen van de mens-specifieke ontwikkeling in vitrowordt nagebootst. Op dit moment zijn diverse protocollen beschikbaar voor de generatie van hele hersenen of hersenen-regio specifieke organoids. De methode voor het genereren van homogene en reproduceerbaar reukkolf-type organoids van geïnduceerde PSC (iPSC), die we eerder vastgestelde en hier beschrijven, combineert het intrinsieke vermogen van PSC om zelf organiseren met begeleide differentiatie naar de Anterieure neuroectodermal afkomst en matrix insluiten ter ondersteuning van de vorming van een continue neuroepithelium. Meer in het bijzonder, dit protocol omvat: (1) de generatie van iPSC aggregaten, met inbegrip van de conversie van iPSC kolonies naar een cultuur van confluente enkelgelaagde; (2) de inductie van de voorste neuroectoderm; (3) het inbedden van neuroectodermal aggregaten in een matrix steiger; (4) de generatie van reukkolf-achtige organoids van neuroectodermal aggregaten; en (5) de fixatie en validatie van reukkolf-achtige organoids. Als zodanig, biedt dit protocol een gemakkelijk toepasbare systeem voor het genereren van gestandaardiseerde en reproduceerbare iPSC afkomstige corticale weefsel structuren in vitro.

Inleiding

Het menselijk brein is duidelijk een van de meest complexe organen en is verantwoordelijk voor alle menselijke intellectuele capaciteiten. Een dieper begrip van de ontwikkeling van de hersenen van de mens-specifieke is dus een essentiële voorwaarde voor het begrip van menselijke cognitieve capaciteiten. Traditioneel, transgene dieren diende als modelorganismen te bestuderen van de ontwikkeling van de hersenen. Deze modellen verstrekte fundamenteel inzicht in de principes van de ontwikkeling van de hersenen. We weten nu dat een gemeenschappelijk kenmerk van de ontwikkeling van de hersenen bij alle zoogdieren een precieze choreografie van voorlopercellen proliferatie, neurogenese en neuronale migratie is. Er zijn echter aanzienlijke structurele verschillen tussen de hersenen van modelorganismen, zoals knaagdieren en de mens, met name in de neocortex. De primaire mechanismen die zijn voorgesteld om bij te dragen aan de primate corticale evolutie zijn een verhoogde proliferatie van cellen van de stam en voorlopercellen evenals de generatie van buitenste radiale glia cellen (oRGCs), die slechts zeer zelden worden gevonden bij knaagdieren^{1 ,2,3}.

Methoden voor model menselijke hersenschors ontwikkeling omvatten de generatie van telencephalic voorlopercellen PSC-afgeleide en de hersenschors projectie neuronen als enkelgelaagde culturen. Deze differentiatie gestandaardiseerde protocollen replay bepaalde aspecten van de menselijke corticale ontwikkeling zoals de stereotiepe temporele volgorde van corticale neurogenese⁴. Zij, echter tekortschieten als het gaat om de recapitulatie van de ontwikkelings processen van organogenese zoals ruimtelijke patronen en voedselproductie. Recentere ontwikkelingen in stamcelbiologie leidde tot de oprichting van 3D organoid culturen van PSC's, die zijn een revolutie in het onderzoek van in vitro menselijke organogenese. Gebruik makend van de capaciteit van de PSC's zelf indelen in de organotypic structuren, verschillende organoids, die belangrijke structurele en functionele eigenschappen van organen, inclusief die van de nier, darm, het oog en de hersenen weerspiegelen geweest gevestigde⁵. Dergelijke organoids bevatten meerdere orgel-specifieke cellulaire subtypes, die groep samen en ruimtelijk ordenen zeer gelijkaardig aan de ontwikkelende organen in vivo^5,6. Daarnaast onthulden cel samenstelling, lineage relatie, en gene netwerk onderzoeken met behulp van eencellige RNA sequencing dat menselijke cerebrale organoids getrouw belangrijke aspecten van de ontwikkeling van de menselijke foetus neocortex zoals gen expressie programma's recapituleren ^{7 , 8}. een belangrijk nadeel zijn, waardoor hun brede toepassing tot nu toe, was echter groot-charges-variaties en heterogeniteit van de organoid-aan-organoid⁹.

Hier, bieden wij een gedetailleerd protocol voor een eenvoudige en gestandaardiseerde reukkolf-type systeem voor de cultuur van de organoid. Het belangrijkste kenmerk van dit systeem is dat het efficiënt en reproducibly PSC afkomstige organoids van bijna exclusieve dorsale telencephalic identiteit genereert. Het protocol is gebaseerd op de methoden die worden gebruikt in onze recente Rapporten van de cel papier¹⁰. Het combineert de capaciteit van de zelforganisatie van iPSCs met selectieve inductie van corticale neuroepithelium en krachtig homogene culturen van vroege dorsale telencephalic weefsel kan genereren binnen 3 weken. Het protocol is gebaseerd op de eerder gemelde SMAD signalering en de Wnt remming strategie die gidsen van de differentiatie van PVC naar de voorste neuroectodermal lineage^11,12 in combinatie met matrix insluiten, die bevordert de vorming van grote en continu neuroepithelial structuren¹³. We hebben met succes de beschreven methode gebruikt op verschillende lijnen van de iPSC, met verschillende klonen per individu. We toonden dat dit systeem is geschikt voor downstream toepassingen waarin reproduceerbaarheid en homogeniteit belangrijke kwesties zoals de modellering van de ziekte zijn. Wanneer toepassing van het protocol tot iPSCs, is afgeleid van patiënten die lijden aan een ernstige corticale misvorming, konden we recapituleren pathologische kenmerken van de ziekte in vitro en identificeren van nieuwe moleculaire mechanismen die leiden tot de fenotypische Hiermee wijzigt u¹⁰. Wij stellen voor dat het beschreven organoid protocol kan worden gebruikt om de kloof tussen de reductionistische PSC afkomstige corticale enkelgelaagde culturen en in vivo studies, en dat dit een betrouwbare en stabiele cel-gebaseerde modelsysteem te simuleren vroeg menselijke corticale ontwikkeling in gezondheid en ziekte buiten het menselijk lichaam.

Protocol

1. generatie van iPSC aggregaten

1. Generatie van eencellige enkelgelaagde culturen van iPSC kolonies
   1. Een kelder membraan extract (BMT) bekleed 6-well plaat voor te bereiden. BME op ijs bij 4 ° C gedurende 2-3 uur ontdooien, Verdun het met koud Dulbecco van bewerkt Eagle Medium F12 (DMEM-F12; 1:50 verdunning), de afdekplaat met 1 mL/goed van de verdunde oplossing van de BME en opslaan van de plaat 's nachts bij 4 ° C.
   2. Het medium gecombineerd en wassen intact iPSC kolonies van ten minste 2 putjes van de plaat van een 6-well met 0,5 mM EDTA in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) twee keer voordat het broeden van de kolonies met 0,5 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) in PBS gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur (RT). EDTA-oplossing gecombineerd en zachtjes het losmaken van de kolonies door het wassen van de onderkant van de schotel met 5 mL van DMEM-F12 medium. Ze verzamelen in een tube van 15 mL- and -pellet hen door middel van centrifugeren (4 min bij 1.200 x g bij RT).
      Opmerking: iPSCs van verkrijgbare fibroblasten geherprogrammeerd is met succes gebruikt¹⁰.
   3. De bovendrijvende substantie gecombineerd en Incubeer de iPSC kolonies met 500 µL van cel-dissociatie reagens voor 6 min bij 37 ° C.
   4. Pipetteer de celsuspensie meermaals zachtjes op en neer met een 1 mL pipet te breken resterende clusters van de cel in afzonderlijke cellen.
   5. Voeg 4 mL DMEM-F12 tot de celsuspensie om te verdunnen van de cel-dissociatie reagens.
   6. Draai de cellen naar beneden bij 1.200 x g gedurende 4 min op RT.
   7. Resuspendeer de cellen in 2 mL zuiver iPSC medium aangevuld met 5 µM Y-27632 en zaad cellen in één putje van een BMT gecoat 6-well plaat.
      Opmerking: Gebruik het medium van de iPSC opgegeven in de Tabel van materialen voor een eencellige enkelgelaagde iPSC culturen.
   8. Op de volgende dag, door het medium te vervangen door verse iPSC middellange Y-27632 ontbreekt. Vanaf dit punt blijven aan de cultuur van de cellen, het wijzigen van het medium elke dag totdat iPSCs 100% heuvels zijn. Afhankelijk van de cellijn en de confluentie van de startende putten duurt dit tussen de 2-4 dagen.
   9. Eenmaal confluente, passage de iPSCs. Medium gecombineerd en 500 µL van cel-dissociatie reagens toe te passen op de cellen.
   10. Incubeer de cellen gedurende 5-10 minuten bij 37 ° C. Zachtjes rock de plaat als u wilt loskoppelen van de cellen.
   11. Wassen van de cellen uit de put en met behulp van 2 mL DMEM-F12 te verzamelen in een tube van 15 mL. DMEM-F12 toevoegen voor een totaal volume van 5 mL.
   12. Spin down de cellen bij 1.200 x g gedurende 4 min op RT en het supernatant gecombineerd.
   13. Zaad van de cellen in iPSC medium aangevuld met 5 µM gecoat Y-27632 in een 1:2 tot 1:4 verhouding op een BMT 6-well plaat (2 mL/putje van medium).
   14. Blijven de cellen voor 2-5 dagen cultuur en wijzigen van iPSC medium ontbreekt Y-27632 elke dag. Eenmaal confluente, passage iPSCs (stappen 1.1.4-1.1.8).
       Opmerking: De iPSCs voor ten minste 2 passages als een enkelgelaagde in het medium van de iPSC opgegeven in de Tabel van materialen alvorens deze voor de generatie van iPSC aggregaten te gebruiken om de cellen aan te passen aan de kweekomstandigheden cultuur.
2. Gebruik enkelgelaagde iPSC culturen als ze 70-90% heuvels voor de generatie van iPSC aggregaten zijn.
   Opmerking: iPSC aangepast aan de cultuuromstandigheden als afzonderlijke cellen minder gevoelig zijn voor benadrukken dat leidt tot celdood tijdens de procedure dissociatie en aggregatie. Enkelgelaagde iPSC culturen moeten typisch pluripotente morfologie weergeven zonder enig bewijs van differentiatie. Test de culturen op een regelmatige basis voor mycoplasma verontreiniging. Werken alleen met mycoplasma-vrije iPSC culturen.
   1. Het kweekmedium uit een put uit een plaat van 6-well gecombineerd en 500 µL van cel-dissociatie reagens toe te passen op de cellen.
   2. Incubeer de cellen gedurende 5-10 minuten bij 37 ° C. Zachtjes rock de plaat als u wilt loskoppelen van de cellen.
   3. Wassen van cellen uit de put en met behulp van 2 mL DMEM-F12 te verzamelen in een tube van 15 mL. DMEM-F12 toevoegen voor een totaal volume van 10 mL.
   4. Voor het tellen van de cel, nemen 25 µL van de celsuspensie en meng het met 25 µL van trypan blauwe ter gelegenheid van de dode cellen. De levende cellen met behulp van een tellen kamer rekenen.
   5. Verzamel genoeg cellen (4.500 cellen per iPSC statistische) van de celsuspensie in een tube van 15 mL.
   6. Spin down de cellen bij 1.200 x g gedurende 4 min op RT en het supernatant gecombineerd.
   7. Resuspendeer de cellen in een passende hoeveelheid iPSC medium aangevuld met 50 µM Y-27632 verkrijgen van 4.500 levende cellen per 150 µL.
      Opmerking: Met behulp van een hoge concentratie van Y-27632 (50 µM) is van cruciaal belang voor het voortbestaan van de iPSCs.
   8. Plaat met 150 µL in elk goed voor een lage-bijlage 96-Wells U-bodem plaat en plaats deze in de incubator bij 37 ° C en 5% CO₂.
      Opmerking: Bij het genereren van iPSC aggregaten, overwegen dat ten minste 6 organoids nodig zijn voor de kwaliteitscontrole op dag 20 (zie sectie 5).

2. de inductie van de voorste Neuroectoderm

1. Nauwlettend morfologie wijzigingen van de iPSC-aggregaten elke dag onder de weefselkweek Microscoop met behulp van een 4 X of 10 X macht lens. Dag 1, cel aggregaten met duidelijke grenzen worden nageleefd. Cultuur iPSC aggregaten in de incubator bij 37 ° C en 5% CO₂blijven.
   Opmerking: Een bepaald aantal dode cellen per putje is normaal en heeft geen invloed op de organoid generatie.
2. Feed de iPSC-aggregaten vanaf dag 2 en verder te gaan met elke andere dag door zachtjes zuigen ongeveer 2/3 van het medium zonder verstoring van de aggregaten van de cel aan de onderkant. Voeg een extra 100 µL van iPSC medium Y-27632 ontbreekt.
   Opmerking: Binnen 4-6 dagen zal de cel aggregaten worden 350-450 µm in diameter en vertonen schermlettertypen bijwerken.
3. In dit stadium, zwembad de cel aggregaten met een gesneden 100 µL pipette uiteinde in een lage-bijlage 6 cm schotel (maximaal 20 aggregaten/schotel) in corticale inductie opslagmedium met DMEM-F12 met N2 supplement (1:200), B27 supplement (1:100), glucose (0,2 mg/mL), cyclische adenosinemonofosfaat (cAMP; 0,15 µg/mL), 0,5% niet-essentiële aminozuren (NEAA), 1% L-alanyl-L-glutamine, heparine (10 µg/mL) en de verbindingen LDN-193189 (180 nM), A83-01 (500 nM), en de Inhibitor van de omwenteling van de Wnt reactie-1 (IWR-1) (10 µg/mL). De cel aggregaten voeden door het veranderen van de corticale inductie medium 3 dagen na het overbrengen van hen naar de 6-cm schotel.
4. Nauwlettend morfologische veranderingen tijdens corticale inductie onder de weefselkweek Microscoop met behulp van een 4 X macht lens.
   Opmerking: Na 4-5 dagen in de corticale inductie medium, moeten randen van de cel aggregaten beginnen te fleuren aan het oppervlak, met vermelding van de differentiatie van de neuroectodermal. In dit stadium, radiale organisatie van een pseudostratified epitheel komt te voorschijn. Ga verder met deel 3 de cel aggregaten insluiten in een BMT-matrix.

3. inbedding van Neuroectodermal aggregaten in een Matrix-steiger

1. Ontdooi BME op ijs bij 4 ° C gedurende 2-3 h. aliquoot onverdund BME in voldoende hoeveelheden.
2. Een kunststof paraffine film vel voorbereiden op de insluiten procedure. Knip de plastic paraffine film met behulp van steriele schaar in 4 x 4 cm grote stukken, leg een stuk van de plastic film over een lege 100 µL tip lade voor 100 µL tips paraffine, en druk op met een gehandschoende vinger zodat kleine kuiltjes in het kunststof paraffine film blad worden gemaakt (1 di mple/cel statistische nodig). Reinigen van de film van de kunststof paraffine met 70% ethanol en het te bestralen met UV-licht (vermogen: 15 watt, golflengte: 435 nm) onder de gesloten steriele Bank voor 30 min.
3. Elke cel aggregaat overbrengen in een kuiltje van het plastic paraffine film blad een 100 µL gesneden tip met 1.5-2 mm diameter te openen. In het geval dat twee aggregaten cel worden gesmolten, doen ze niet scheiden maar samen overbrengen naar een kuiltje.
4. Zachtjes gecombineerd het medium rond de aggregaten van de cel met behulp van een Onbesneden 100 µL pipette uiteinde.
   Opmerking: Wees voorzichtig niet te zuigen de aggregaten van de cel in de tip, aangezien dit de aggregaten zal beschadigen.
5. Voeg 40 µL van onverdunde BME tot elke cel totaal.
6. Positie elke cel in het midden van de BMT statistische drop met behulp van een Onbesneden 100 µL precisiepipet tip.
   Opmerking: Wees zeer voorzichtig niet te schaden de ontwikkelende neuroepithelium met het uiteinde van de pipet.
7. Zorgvuldig overbrengen van de kunststof paraffine film sheet met steriel pincet in een 10 cm petrischaal (of een andere voldoende cel cultuur schotel) en zet de schotel in de incubator voor 15-20 min om de BMT te stollen.
8. Ondertussen bereiden een lage-bijlage 6 cm schotel met 5 mL van corticale inductie medium.
9. Verwijder na de polymerisatie van BMT, de druppels met de cel aggregaten uit de plastic paraffine film sheet. Zet de plastic paraffine-film over het gebruik van steriel pincet en zachtjes knijp de aggregaten van de cel in de enigszins gekanteld (ongeveer 30 °) laag-bijlage 6 cm schotel totdat de druppels uit het plastic paraffine film blad vallen. Pipetteer een maximum van 16 cel aggregaten in een 6 cm schotel.
10. Blijven broeden de aggregaten van de cel bij 37 ° C.

4. generatie van reukkolf-achtige Organoids van Neuroectodermal aggregaten

1. Een dag na de insluiten in een matrix BME plaats organoid cultuur gerechten op een rockende cel cultuur shaker met een kantelbare hoek van 5 ° en 14 rpm, geïnstalleerd in een cel cultuur incubator.
2. Monitor organoids elke dag. Homogene neuroepithelial lus-achtige structuren ontwikkelen geleidelijk na de insluiten in BME matrix.
3. Wanneer neuroepithelial lus structuren weergegeven worden, wijzigen in het medium organoid differentiatie opslagmedium met DMEM-F12 met N2 supplement (1:200), B27 supplement (1:100), glucose (0,2 mg/mL), cAMP (0,15 µg/mL), 0,5% NEAA, 1% L-alanyl-L-glutamine, insuline (2,5 µg/mL)
4. Vervangen organoid differentiatie medium om 3-4 dagen tot het tijdstip van de gewenste differentiatie wordt bereikt. Dan fix organoids (zie sectie 5).
   Opmerking: Soms kan het weefsel toppen van optisch doorschijnend weefsel zonder lus structuren vertonen. Hoewel dit niet ideaal is, dit is niet van invloed op de ontwikkeling van corticale structuren. De organoids kunnen worden gekweekt in organoid differentiatie medium tot maximaal 40 dagen. Voor uitgebreide cultuur periodes (40-100 dagen) het organoid differentiatie medium kan worden aangevuld met 1:50 BME toe weefsel complexiteit en met BDNF en GDNF toe te staan van neuronale overleving en rijping^14,15.

5. fixatie en validatie van reukkolf-achtige Organoids

1. Verzamelen voor de validatie, 6 organoids op dag 20. Gebruik 3 organoids voor mRNA isolatie en PCR-analyses. De extra 3 organoids overbrengen in een 24-well plaat met PBS met behulp van een gesneden 1 mL pipet tip met een opening van 3-3.5 mm voor fixatie en sequentiële immunocytochemische analyses.
2. Wassen de organoids tweemaal door zorgvuldig de PBS aspirating en vervangen door verse PBS met behulp van een precisiepipet 5 mL. Corrigeer de organoids gedurende 15 minuten in koud 4% paraformaldehyde (PFA) (pH 7.4).
   Let op: Pas op dat PFA een bekend menselijk carcinogeen is. Alles moet gebeuren in een chemische zuurkast nitril handschoenen. Het is aanbevolen om het dragen van veiligheidsbril. Formaldehyde kan leiden tot onherstelbare schade aan het hoornvlies.
3. De PFA zorgvuldig gecombineerd en wassen drie keer met behulp van kamertemperatuur PBS gedurende 10 minuten.
4. De PBS vervangen door een 30% sacharoseoplossing (wt/vol, PBS-gebaseerd) en op te slaan van de monsters bij 4 ° C tot het toestaan van organoids te dehydrateren. Organoids kunnen worden opgeslagen voor tot 7 dagen totdat zij worden verwerkt.
5. Een dag na fixatie, vlek vooraf de gedehydrateerde organoids door toevoeging van trypan blauw aan ongeveer 1:50 voor 10 min om de visualisatie van de organoids tijdens de procedure cryosectioning.
6. Het insluiten medium met 10 gewichtspercenten sacharose, 7,5% gelatine wt/vol in PBS, bereid en warm het tot 75 ° C, tot het gesmolten.
7. 30% sacharoseoplossing vervangen door insluiten medium en transfer van de 24-well-plaat op een bord van de verwarming (60 ° C) voor 15 min naar de organoids equilibreer.
8. Betrekking hebben op de bodem van de insluiten mallen met een laagje insluiten media en plaats ze op het ijs te polymeriseren.
9. Overdracht de organoids van de 24-well plaat aan de inbedding mallen waarin het gepolymeriseerde insluiten medium, voeg extra insluiten medium bovenop zodat de organoids vallen en plaats van de mal snel in een 100% ethanol/droog ijs bad (bevriezing temperatuur moet tussen -30 tot-50 ° C) gedurende ten minste 1 min. naar schok-freeze.
10. Plaats de mal met pincet op droog ijs tijdelijk en beide winkel die ze bij-80 ° C of direct doorgaan met cryosectioning.
11. Cryosection organoids op 20 µm dikte en verzamelen de secties op de dia's de Microscoop, houden bijhouden in de orde van de secties op de dia's (sequentiële opname). Toestaan secties drogen op dia's voor enkele uren, voordat ze bij-80 ° C op te slaan of het rechtstreeks uitvoeren immunocytochemische kleuring.

Resultaten

Het gestandaardiseerde reukkolf-type organoid protocol beschreven hier meestal genereert zeer homogene organoid culturen van bijna uitsluitend dorsale corticale identiteit van menselijke iPSCs binnen 20 dagen na de teelt (protocol uiteengezet in Figuur 1 A). het is aanbevolen om de verschillende stappen van de kwaliteitscontrole uitvoeren in de tijdsverloop van het protocol, gedefinieerd als: 'Ga' (voortzetting van het differentiatie-proces) en 'no-go' (suboptimaal culturen, het is aanbevolen om het beëindigen van de partij) (Figuur 1 ). Het is ook raadzaam om te documenteren elke stap kwaliteitscontrole goed door het nemen van foto's en notities.

De eerste kritieke stap bij het genereren van reukkolf-achtige organoids is om te beginnen met kwalitatief hoogwaardige iPSC culturen. Het is belangrijk dat iPSCs geen grotere breuken van gedifferentieerde cellen bevatten. Gebruik alleen iPSC culturen die presenteren als een homogene enkelgelaagde ongedifferentieerde cellen op de startende bevolking (cijfers 1B, C). Daarnaast, is het cruciaal om te beginnen met het getal van bepaalde cel voor iPSC aggregatie. De eerste gedetailleerde inspectie van de iPSC-aggregaten moet worden uitgevoerd op dag 2. In dit stadium moeten de aggregaten hebben gevormd compacte cel toppen met zachte randen ('go') Overwegende dat onregelmatig verschijnende aggregaten of aggregaten met holtes afgedankte ('no-go') (cijfers 1 d, E moeten). De volgende stap van de kwaliteitscontrole moet worden uitgevoerd op dag 10 van het protocol. Op dit punt van tijd, de cel aggregaten moeten Toon glad en optisch doorschijnend weefsel op het buitenoppervlak vertegenwoordigen inductie van neuroectoderm ('go') Overwegende dat het ontbreken van dergelijke weefsel suboptimaal neurale inductie blijkt ('no-go') (cijfers 1F, G ). Alleen deze aggregaten die een doorzichtig oppervlak (Figuur 1F vertonen) moeten worden ingebed in BME matrix. Een ingesloten Nieuwengels de corticale organoids continu neuroepithelial lus-achtige structuren, die snel zal uitbreiden. De efficiëntie van de corticale inductie op dag 15 en dag 20 wordt geanalyseerd door te onderzoeken of de organoids hebben ontwikkelde gepolariseerde neurale ectoderm, zoals aangetoond in Figuur 1H, J ('go'). Herzien de uitgevoerde kwaliteitscontrole stappen voor probleemoplossing in het geval dat de organoids dergelijke neuroepithelial toppen ('no-go' zoals geïllustreerd in Figuur 1I, K), niet kritisch hebben ontwikkeld. Wanneer strak na het protocol, sterk gestandaardiseerde organoid partijen zal worden gegenereerd (cijfers 2A, B), die zal tonen ≥ 90% homogeniteit in gepolariseerde neurale ectoderm vorming binnen en tussen partijen (Figuur 2C). Een veel voorkomende fout die leidt tot variabele efficiëntie van gepolariseerde neurale ectoderm formatie is het vergroten van het beginnummer van de cel voor iPSC aggregatie, of om te beginnen met lage kwaliteit iPSC culturen zoals mycoplasma verontreinigd culturen of culturen die bevatten gedifferentieerde cellen.

Een gedetailleerde validatie van de dorsale telencephalic identiteit van de gegenereerde organoids moet worden uitgevoerd op dag 20. Te dien einde moet 3 organoids worden vastgesteld en gebruikt voor analyses van de immunofluorescentie. Gestratificeerde neuroepithelial lussen (Figuur 3A) express de neurale stamcellen markering Sox2 (Figuur 3B, D), de reukkolf markers Pax6 en Otx2 (cijfers 3 c, E), en de dorsale corticale markering Emx1 (Figuur 3 F). deze corticale loops zijn verder gekenmerkt door een apicaal lokalisatie van N-cadherine en ZO-1 (cijfers 3 g, H), ventriculaire zone radiale glia cellen (vRGC)-afgeleid van microtubuli, die van de apicale naar de basale zijde van de structuren omvat ( Figuur 3 ik), en apicaal gelegen delen van cellen die vlek positief voor gefosforyleerd vimentin (p-Vimentin, Figuur 3J). Celdood misschien wel aanwezig is in de structuren van de organoid. Centrale apoptosis is normaal en heeft geen invloed op de ontwikkeling van corticale weefsel. Bovendien moet 3 organoids worden gebruikt ter beoordeling van de homogeniteit van het protocol door gen expressie analyses. Reukkolf-type organoids Toon expressie van de dorsale reukkolf markers (FoxG1, Otx2, Emx1), terwijl de uitdrukking van de veroorzaakt (FoxA2, Pax5) en de markeringen van hindbrain (HoxB2, HoxA4, HoxB4, HoxB6) is niet aantoonbaar (Figuur 3K).

Batches van organoids kwaliteit gecontroleerd kunnen worden gebruikt voor verschillende toepassingen zoals de analyses van het vliegtuig van de divisie van apicale radiale gliacellen. Te dien einde is het aangeraden uitvoeren dubbele kleuring gebruikt antilichamen tegen p-Vimentin en Tpx2 (Figuur 3J). P-Vimentin is tijdens de mitose phosphorylated door CDK1 en is gelegen in de kern, dus alle kernen in de mitotische fase¹⁶markering. Tpx2 is een microtubulus-geassocieerde proteïne dat de mitotische spindel en de apicale processen tijdens interkinetic nucleaire migratie^{17,18 visualiseren kunt}. Met behulp van deze markers, drie aspecten van vRGC divisie kunnen in principe worden geanalyseerd: (I) of cel divisie vindt plaats aan de apicale zijde, (II) of het vliegtuig divisie is uitgelijnde verticale (met vermelding symmetrische celdeling), () horizontale of schuine met vermelding van Asymmetrische celdeling) de apicale oppervlak, en (III) normaal of microtubulus organiseren centra worden gevormd.

Organoids kan verder worden gedifferentieerd in meer complexe structuren van de georganiseerde en gestratificeerd corticale weefsel. Corticale structuren binnen dag 35 ± 2 organoids bestaan uit een ventriculaire zone (VZ)-, een binnenste en buitenste subventriculaire zone (SVZ), evenals een corticale plaat (CP) - als gebied. Binnen de VZ en de binnenste en buitenste SVZ, kunnen vRGCs, tussenliggende progenitoren (IPs) en cellen die doet denken aan oRGCs worden geïdentificeerd. Bovendien, de initiële vorming van een gelaagde cortex kan worden waargenomen in de CP-achtige ruimte met diep corticale neuronen Tbr1 en Ctip2 binnen en hogere corticale neuronen uiten van Satb2, evenals basisch-uiting geven aan cellen in de buitenste regio's¹⁰.

Figuur 1 : Schematisch overzicht van het organoid-protocol en de illustratie van de 'go' en 'no-go' criteria. (A) schematisch overzicht van het protocol. CI medium: corticale inductie drager wordt vastgelegd; CD: corticale differentiatie medium. (B-C) Afbeelding van een optimale 90% confluente iPSC enkelgelaagde (B) en een niet-geschikte iPSC cultuur exposeren differentiatie (C). (D--E) Een optimale in formaat, de celdichtheid; en de oppervlakte weergave (D) iPSC-aggregaat en twee 'no-go' cel aggregaten tentoonstellen of cel spaart Holten (E, bovenste aggregaat) of onregelmatige randen (E, lagere aggregaat) twee dagen volgende cel aggregatie. (F--G) Cel aggregaten exposeren doorschijnend en gladde randen (F) en cel aggregaten ontbreekt optische wissen (G). De gele lijn is het visualiseren van het interessegebied. (H--K) Een optimale organoid met continu neuroepithelial lussen (H, J) en een organoid dat verzuimd te ontwikkelen radiaal georganiseerd neuroectoderm (ik, K) beeld op dag 15 en dag 20, respectievelijk. Schaal bars, B-C 500 µm; D-K 200 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2 : Homogeniteit en reproduceerbaarheid van het reukkolf-type organoid protocol. (A-B) Representatieve helder-veld beelden van organoids van één partij op dag 15 (A) en dag 26 (B). (C) kwantitatieve analyses van organoids op dag 20. Organoids die weer op het buitenoppervlak van een neuroepithelium, herkenbaar in helder-veld als optisch duidelijk oppervlakkige weefsel met een duidelijke grens en bewijs van radiale het cellulaire platform werden gekwantificeerd (n = 3 per iPSC lijn met ten minste 16 organoids per experiment). Schaal bars, A-B: 500 µm. Error bars ± SD. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3 : Validatie van reukkolf-achtige organoids op dag 20. (A-J) Immunocytochemische karakterisatie van organoids. Organoids organiseren in meerdere neuroepithelial lusjes (A, counterstained met DAPI). Gelaagde georganiseerde cellen binnen het neuroepithelial lussen express de neurale stamcellen markering Sox2 (B, D), de reukkolf markers Pax6 (C, D) en Otx2 (E), alsmede de markering van de dorsale reukkolf Emx1 (F). Corticale lus structuren tentoongesteld een fijne aanhangend junction gordel hooguit apicale zijde met de accumulatie van N-cadherine (G) en zona occludens eiwit 1 (ZO-1; H). ventriculaire RGCs microtubulus netwerken (gekleurd door geacetyleerd α-tubuline, Ac-Tub) uit te na de apicale naar de basale zijde van de lus-structuren (ik breiden). Delende cellen uiten van p-vimentin (p-Vim) bevinden zich in de apicale oppervlak. Mitotische spindels worden gekleurd door Tpx2. representatieve hogere vergroting afbeelding van een verticale en een horizontale opdeling vliegtuig worden weergegeven aan de rechterkant (J). (K) RT-PCR analyse voor de land / regiospecifieke transcriptiefactoren op dag 20 van twee onafhankelijke sets van organoids afgeleid van 2 verschillende iPSC lijnen. FB: foetale hersenen controle; AB: volwassen hersenen controle. Schaal bars, A-D 200 µm; E-I 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Epitoop	Verdunning
Sox2	1 - 300
Pax6	1 - 500
Otx2	1 - 500
Emx1	1 - 50
N-cadherine	1 - 500
ZO-1	1 - 100
P-Vimentin	1 - 1000
Tpx2	1 - 500
Geacetyleerd α-tubuline	1 - 500
Alexa488 anti-ms	1 - 1000
Alexa488 anti rb	1 - 1000
Alexa555 anti-ms	1 - 1000
Alexa555 anti rb	1 - 1000

Tabel 1: Antistoffen voor kwaliteitscontrole van organoids op dag 20.

Primer	Volgorde
Otx2 vooruit	tgcaggggttcttctgtgat
Omgekeerde Otx2	agggtcagagcaattgacca
FoxG1 vooruit	ccctcccatttctgtacgttt
Omgekeerde FoxG1	ctggcggctcttagagat
Emx1 vooruit	agacgcaggtgaaggtgtgg
Omgekeerde Emx1	caggcaggcaggctctcc
FoxA2 vooruit	ccaccaccaaccccacaaaatg
Omgekeerde FoxA2	tgcaacaccgtctccccaaagt
Pax5 vooruit	aggatgccgctgatggagtac
Omgekeerde Pax5	tggaggagtgaatcagcttgg
HoxB2 vooruit	tttagccgttcgcttagagg
Omgekeerde HoxB2	cggatagctggagacaggag
HoxA4 vooruit	ttcagcaaaatgccctctct
Omgekeerde HoxA4	taggccagctccacagttct
HoxB4 vooruit	acacccgctaacaaatgagg
Omgekeerde HoxB4	gcacgaaagatgagggagag
HoxB6 vooruit	gaactgaggagcggactcac
Omgekeerde HoxB6	ctgggatcagggagtcttca
18s vooruit	ttccttggaccggcgcaag
18s omgekeerde	gccgcatcgccggtcgg

Tabel 2: Primer en primer reeksen genexpressie profiel.

Discussie

Hersenen organoids vertegenwoordigen een krachtig hulpmiddel voor de studie van menselijke hersenen ontwikkeling in vitro als ze de achtergrond van de betrokken soort en de complexe 3D rangschikking van cellen in een context van weefsel bieden. Met dat, zijn ze de kloof tussen de niet-menselijke diermodellen en reductionistische menselijke tweedimensionale enkelgelaagde cel cultuur technieken. Hun toepassingen zijn, echter belemmerd door een gebrek aan reproduceerbaarheid⁹. Wij hebben een reukkolf-type organoid protocol, waarbij de grote variabiliteit van de monster-naar-sample overwint door het combineren van de zelf-organiserende capaciteit van iPSC met hun inschikkelijkheid naar patronen van factoren ontwikkeld. Specifiek, iPSCs werden samengevoegd ter bevordering van zelf-organisatie en vervolgens remmen TGF-ß/SMAD signalering ter bevordering van de dorsale cortex differentiatie door bloot te leggen van de culturen naar een BMP (LDN-193189) en een TGF-β controletype I receptor remmer (A83-01). Bovendien, werd een samengestelde remming van de Wnt (IWR) om te voorkomen dat posteriorization toegepast. In tegenstelling tot de 'intrinsieke' cerebrale organoid protocollen¹⁹, die zijn gebaseerd op zelf-assemblage zonder externe controle die aanleiding geven tot nogal heterogene hersenen organoids en vertonen grote batch variaties (gemeten door de efficiëntie van gepolariseerd neurale ectoderm vorming¹⁵), het protocol beschreven hier reproducibly genereert homogene reukkolf-specifieke organoids van menselijke iPSCs.

Deze reukkolf-type organoids kan worden gebruikt voor een verscheidenheid van toepassingen zoals neurologische onderzoeken, evolutionaire onderzoeken gene functie studies, inclusief modellering van de ziekte en, potentieel, drug testen en therapeutische doeleinden. Het protocol is het meest geschikt om vroege aspecten van de menselijke ontwikkeling van de corticale te onderzoeken. Bijvoorbeeld hebben we de reukkolf-type organoids gebruikt om mens-specifieke aspecten van vRGC gedrag te onderzoeken. Meer in het bijzonder, pathofysiologische veranderingen die zijn gekoppeld aan een ernstige vorm van lissencefalie, een menselijke corticale misvorming gekenmerkt door een in de omgeving van afwezigheid van corticale vouwen, werd behandeld. Slechts bepaalde aspecten van deze ziekte kunnen worden gemodelleerd in muizen als het brein van de muis natuurlijk lissencephalic is. Bij de toepassing van het organoid systeem op lissencefalie patiënt afkomstige iPSCs, kunnen we betrouwbaar recapituleren mens-specifieke aspecten van de ziekte en onderliggende mechanismen te identificeren. Meer in het bijzonder, kunnen we laten zien dat patiënt afkomstige organoids een significante vermindering van grootte veroorzaakt door een schakelaar van symmetrische aan asymmetrische celdeling van vRGCs vertonen. Deze schakeloptie werd geassocieerd met veranderingen in de organisatie van vRGCs microtubulus netwerk, een verstoring van de architectuur van de VZ niche en expressie van celadhesie-moleculen, wat leidt tot een verminderde activatie van de N-cadherine/β-catenine gewijzigd signalering as¹⁰. Van de nota: regulering van de β-catenine-afhankelijk van de vRGC divisie modi werd voorgesteld als mens-specifieke zoals overexpressie van β-catenine in muizen tot uitbreiding van de tangentiële cortex leidt en vervolgens corticale²⁰vouwen. Onze gegevens markeren dus, dat de reukkolf-type organoid systeem vertegenwoordigt een veelbelovend instrument om te studeren in een meetbare wijze de mens-specifieke aspecten van vroege corticale ontwikkeling in vitro.

Een grote uitdaging voor de toekomst is het handhaven van de homogeniteit van de organoids over langere tijd met het oog op een meer volwassen neuronale fenotypen. Dit kan worden gerealiseerd door een of meer van de volgende handelingen: toepassing van drijvende steigers kweken de organoids in een bioreactor systeem¹⁴,¹⁵, ter aanvulling van het medium van de differentiatie met neurale groei of neuronale overleving factoren. Tot slot, een beheerste stijging van de hersenen complexiteit kan worden bereikt door het smelten van het reukkolf-type organoids met cerebrale organoids van verschillende regionale identiteit^21,22.

Samen genomen, biedt het reukkolf-type organoid protocol hier gepresenteerd een eenvoudig toepassing en betrouwbaar instrument voor de generatie van vroege corticale structuren in vitro. Het protocol geeft aanleiding tot zeer homogene vroege corticale weefsel verdeeld over meerdere iPSC regels en kunnen worden gebruikt om op betrouwbare wijze genereren speciale corticale weefsel. Het systeem is dus bijzonder geschikt voor toepassingen waarvoor een hoge mate van homogeniteit en reproduceerbaarheid zoals ziekte modellering.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
A83-01	StemGent	130-106-274	500 nM
B27 Supplement	Gibco	17504-044	1 tot 100
Basement membrane extract (bijv. Geltrex)	Gibco	A14132-02
Cyclische adenosine monofosfaat (cAMP)	Sigma-Aldrich	A9501	0,15 µg/mL
Celdissociatie reagens (TrypLE Express)	Gibco	12605028
Tellkamer e.g. Fuchs-Rosenthal	Karl Hecht	40449001
D-Glucose	Carl Roth	HN06.3	0,2 mg/mL
DMEM-F12 L-Glutamine	Gibco	11320033
Inbedding mallen (Tissue-Tek Cryomold)	Sakura Finetek	4565
Ethyleendiaminetetra-azijnzuur	Sigma-Aldrich	E6511	0,5 mM
Gelatine	Sigma-Aldrich	G1890
Heparine	Sigma-Aldrich	H3149-25KU	10 ug/mL
Remmer van WNT-respons (IWR-1)	Enzo Life Science	BML-WN103-0005	10 ug/mL
Insulin	Sigma-Aldrich	91077C	2,5 µg/mL
IPSC medium voor monolaag culturen (Pluripro)	Cell Guidance Systems	MK01
L-alanyl-L-glutamine (GlutaMax)	Gibco	35050038	1%
Laag-adhesieve 6 cm platen	Labomedic	2081646L
Laag-adhesieve 10 cm platen	Labomedic	2081646O
LDN-193189	Miltenyi Biotec	130-104-171	180 nM
N2 Supplement	Gibco	17502-048	1 tot 200
Niet-essentiële aminozuren	Gibco	11140035	0,50%
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	4,00%
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)	Gibco	14190144
Kunststof paraffine film (Parafilm)	BRAND GMBH + CO KG	701606
ROCK-remmer Y-27632	Cell Guidance Systems	SM02-100	5 µM of 50 µM
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
Buisjes 15 mL	Corning Life Sciences	734-0451
Microscoopglaasjes e.g. Superfrost Plus Microscoopglaasjes	Thermo Scientific	4951PLUS4
Weefselkweek 6 wel plate	Falcon	734-0019
Weefselkweek 24 wel plate	Falcon	734-0949
Trypanblauw kleurstof	Gibco	15250-061
Ultra-laag-bindende 96 wel lipidure-coat plate A-U96	Amsbio	AMS.51011610
Antilichamen
Sox2	R&D Systems	MAB2018
Pax6	Covance	PRB-278P-100
Otx2	R&D Systems	ab9566
Emx1	Sigma	HPA006421
N-cadherine	BD	610921
ZO-1	Life Tech	61-7300
P-Vimentin	Biozol	D076-3
Tpx2	Novus Biologicals	NB500-179
Acetyleren α-tubulin	NEB/CS	5335
Alexa488 anti ms	Invitrogen	A11001
Alexa488 anti rb	Invitrogen	A11008
Alexa555 anti ms	Invitrogen	A21424
Alexa555 anti rb	Invitrogen	A21429