Methodenartikel

Een eenvoudige en goedkope Assay voor het meten van Ambulation in muismodellen van spierdystrofie

DOI:

10.3791/56772

⸱

29 december 2017

 , 
1Department of Integrative Biology and Physiology, University of California, 2Center for Duchenne Muscular Dystrophy, University of California, 3Department of Neurology, David Geffen School of Medicine, University of California, 4Molecular Biology Institute, University of California

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een flexibele, voordelige systeem voor het meten van de muis ambulation in een open veld activiteit assay. We laten zien dat een bepaling van de 6 minuten durende ambulation op basis van dit systeem een afname van de vrijwillige beweging in mdx muizen detecteert en nauwkeurig verbetering in een spier-specifieke redding van deze dieren onderscheidt.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het meten van functionele resultaten bij de behandeling van spierdystrofie is een wezenlijk aspect van de preklinische testen. De beoordeling van vrijwillige ambulation in muismodellen is een niet-invasieve en reproduceerbare activiteit-test die is direct analoog aan maatregelen van patiënt ambulation zoals de 6-minuten-test en gerelateerde mobiliteit scores. Vele gemeenschappelijke methoden voor het testen van de muis ambulation snelheid en afstand zijn gebaseerd op het open veldtest, waar het dier vrij verkeer binnen een arena wordt gemeten na verloop van tijd. Een groot nadeel aan deze benadering is dat commerciële software en apparatuur voor hoge resolutie volgen van beweging is duur en mogelijk overbrengen van muizen tot gespecialiseerde faciliteiten voor het testen. Hier beschrijven we een goedkope, video-gebaseerd systeem voor het meten van de muis ambulation dat gebruik maakt van gratis en open-source software. Met behulp van dit protocol, we laten zien dat vrijwillige ambulation in het Dystrofine-lege mdx -muismodel voor Duchenne muscular dystrophy (DMD) is gedaald ten opzichte van de wild-type muis activiteit. In mdx uiting geven aan de utrophin transgenic muizen deze activiteit tekorten niet worden nageleefd en de totale afgelegde afstand is niet te onderscheiden van muizen wild-type. Deze methode is effectief voor het meten van veranderingen in vrijwillige ambulation Dystrofe pathologie is gekoppeld, en biedt een veelzijdig platform dat gemakkelijk kan worden aangepast aan uiteenlopende onderzoek instellingen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Betrouwbare en reproduceerbare metingen van spier functie zijn van cruciaal belang voor de beoordeling van de werkzaamheid van potentiële therapieën voor DMD. DMD is een genetische aandoening veroorzaakt door mutaties in het Dystrofine-gen, leidt tot progressieve spierzwakte, verlies van ambulation, en uiteindelijke Cardiorespiratoire mislukking. De meest gebruikte diermodel van DMD is het Dystrofine-lege mdx -muis. Een batterij van functionele tests opgedoken als routine tests voor de beoordeling van de progressie van de ziekte in de mdx -muis zo goed zoals in soortgelijke dierlijke modellen van andere dystrophie en myopathieën. Veelgebruikte in vivo tests omvatten metingen van de voorpoot grijpkracht, draad, tijd, rotarod maximum, tijd opknoping aan uitputting tijdens loopband uitgevoerd, en motorische activiteit bijhouden. Er is een aanzienlijke inspanning op het gebied op de standaardisering van deze tests, met als doel vermindering van de variabiliteit tussen de preklinische studies en verhogen het translationeel potentieel van therapeutics getest in muizen1,2.

Een belangrijke categorie van preklinische testen is het meten van vrijwillige beweging, een parameter die vaak wordt gewijzigd in lymfkliertest modellen van spierdystrofie. Dit wordt meestal getest door te testen op basis van het open veld Activiteitencontrole, en kan horizontaal (lopen) of verticale (kweek) bewegingen in een loop van minuten of uren2,3,4te evalueren. Een aantal studies is gebleken dat vrijwillige beweging moet worden gewijzigd in mdx muizen, vooral na het sporten, en deze metingen is gebleken te zijn gevoelig voor behandeling en ziekte progressie van de drug. Een belangrijke beperking bij het uitvoeren van deze tests is de behoefte aan gespecialiseerde, hoge kosten apparatuur. Hier, wordt een goedkope methode die tracks muis ambulation met behulp van gemakkelijk beschikbare middelen gepresenteerd.

De 6 minuten lopen afstand is een statistiek die vaak gebruikt als een instrument van de klinische beoordeling bij personen met Duchenne spierdystrofie5,6. Wijzigingen van deze maatregel hebben zijn gebruikt ter beoordeling van de resultaten in diermodellen voor Duchenne, met inbegrip van mdx muizen7 en golden retriever spierdystrofie (GRMD) honden8. In deze studie registreren wij vrijwillige open veld beweging in de 6 minuten direct na een milde oefening uitdaging. Ambulation afstand werd vervolgens berekend op basis van vrije open-source software voor het meten van horizontale beweging na verloop van tijd.

Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat de dieren kunnen worden getest in een scala aan instellingen zonder speciale apparatuur of hoge kosten commerciële software voor analyse. Een belangrijk aspect van deze analyse is dat het kan worden uitgevoerd in een omgeving van basic Labor zonder te verplaatsen of muizen uit de vivarium overbrengen in een gespecialiseerde core-faciliteit. Het protocol van de video-tracking hier beschreven kan is geschikt voor de beoordeling van de ambulation gedurende een relatief korte tijd-periode en detecteren activiteit verschillen tussen wild-type en mdx muizen, evenals onthullen functionele verbetering in een redding model van DMD.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hier beschreven methoden werden goedgekeurd door het institutionele Animal Care en gebruik Comité bij de University of California, Los Angeles. Wild-type (C57BL/6J) en mdx muizen (C57Bl/10ScSn achtergrond) werden gekocht van een commerciële bron. MDX: utrophin-Tg muizen waren een geschenk van James Ervasti, met toestemming van Kay Davies, en werden onderhouden op de mdx -achtergrond. Ambulation tests werden uitgevoerd op mannelijke muizen op 6 maanden oud. Muizen werden onderhouden in het Terasaki Life Sciences Vivarium na door de institutionele Animal Care vastgestelde richtsnoeren en gebruik Comité bij de Universiteit van Californië, Los Angeles (goedkeuring #2000-029-43) en goedkeuring voor deze studies werd verleend door de UCLA Animal Welfare Assurance (goedkeuring #A3196-01).

1. voorbereiding van de kamer

  1. Verzamelen van gegevens in een rustige, temperatuur gecontroleerde kamer in een consistente tijd van dag9uitvoeren Voer de tests verblind tot het genotype en de behandeling van de muis wordt getest.
  2. Aanpassen elk open veld kamer systeem voor deze analyse.
    Opmerking: In deze studie gebruiken we een goedkoop en gemakkelijk te vervoeren opname kamer opgebouwd uit een grote prullenbak. De arena van het open veld is een lade instellen op een kooi of soortgelijke verhoogde platform.
  3. Plaats de camera op een gaas boven de kamer opnemen over de volledige arena.
  4. Reinig de zaal van de opname met een ontsmettingsmiddel voor elk afzonderlijk experiment.

2. vooraf oefening Protocol en gegevensverzameling

  1. U kunt desgewenst onmiddellijk voorafgaand aan de opname van de activiteit, daag elke muis met een spier activering protocol.
    Opmerking: Dit is optioneel maar aanbevolen in experimenten met mdx muizen.
    1. Laat de muis greep de pull-bar van een digitale kracht meten en trek voorzichtig terug tot de pull-bar wordt vrijgegeven. Herhaal deze procedure vijfmaal per proef.
    2. Record piek spanning (N) voor elk afzonderlijk experiment.
      Opmerking: Naast de uitdaging van een oefening voor de ambulation assay bijeenkomen, de kracht uitgeoefend door het behandelde dier tijdens deze greep kracht test kan worden gebruikt als een extra functionele uitkomst maatregel2,10.
    3. Vijf totale proeven voor elke muis met 1 min van rust tussen elke proef uitvoeren.
  2. Onmiddellijk na de bepaling van de sterkte greep of andere oefening protocol, plaatst u de muisaanwijzer in de zaal van de activiteit.
  3. Start de video-opname van alle bewegingen van de muis in de arena van de kamer. Laat de muis om te vrij verkennen voor 6 min.
  4. Stop de opname op 6 min en de muis terug naar haar kooi.

3. video-analyse

  1. U kunt desgewenst voorbereiden video analyse door het verminderen van de framerate. Ter beperking van de framesnelheid voor het bijhouden van de analyse, het volgende protocol gebruiken in een video-editing software (b.v., iMovie of een soortgelijk programma) te decimeren de videoframesnelheid met een factor 2.
    Opmerking: Afhankelijk van de lengte en de frame rate van de video, het wellicht nuttig om de video framerate vóór de analyse. In deze studie, werd video opgenomen op 30 frames/s (6 min opnemen, ongeveer 10,800 frames totaal).
    1. Het laden van de video in de software.
    2. Selecteer onder het menu 'Speed', ' snelheid: snel ' en zet snelheid naar 2 x.
    3. Exporteer de gedecimeerd video in MP4-indeling voor het bijhouden van de analyse.
  2. Open de video voor analyse in het softwareprogramma. Stel de kalibratie voor de video-opname met behulp van het hulpmiddel lijn. Teken een lijn langs een kant van de kamer. Klik met de rechtermuisknop op de regel en selecteer "Kalibreren maatregel..." Geef de werkelijke grootte van de kant van de kamer in centimeters.
  3. Om te beginnen met semi-automatische bijhouden van de muispositie, klik op de 'move'-cursor.
    Vanaf het eerste frame in de video, klik met de rechtermuisknop op het punt worden bijgehouden; het punt van de tracking is gemarkeerd met een blauwe cirkel.
    Opmerking: In de huidige studie, de positie van elk dier werd gevolgd door het traceren van de basis van de staart.
  4. Verder het frame door te klikken op de pijl-rechts op het toetsenbord; het bijhouden van punt moet automatisch worden verplaatst op basis betreffende de positie van de staart base.
    1. Als de positie van de tracking is niet afgestemd op het punt van belang in een bepaald frame, handmatig uitlijnen de blauwe cirkel aan de basis van de staart.
      Opmerking: Afhankelijk van de kwaliteit van de video en de snelheid van de muis, de tracking kan vereisen verschillende niveaus van de input van de gebruiker om de aanpassing aan het punt van belang. Het pad van de muis moet gaan doorheen de cursus van de video.
  5. Wanneer volgen van de volledige video voltooid is, slaat u de video- en tracing-overlay. Exporteer de positionele gegevens van de tracering door het selectievakje 'Exporteren naar werkblad'.

4. de gegevensanalyse

  1. De positionele gegevens openen in een spreadsheetprogramma van de software. De software van de analyse van het verkeer meldt dat de X, Y-coördinaat van de positie van de muis in elk frame.
  2. Wilt berekenen afstand reisde door frame, gebruikt u de volgende vergelijking (waar positie in frame een is x1, y1 en frame twee is x2, y2):
    figure-protocol-1
    Opmerking: Cumulatieve afstand na verloop van tijd kan worden berekend door de afgelegde tussen elk frame toe te voegen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Variaties van het open veld test is gebleken dat een effectieve methode voor het testen van de progressie van de ziekte in modellen van spierdystrofie. Hier tonen we een veelzijdige video tracking methode voor de analyse van tweedimensionale muisbeweging met behulp van gemakkelijk beschikbare opname-apparatuur en open bronsoftware (figuur 1A-B). Consistent met resultaten gemeld uit soortgelijke testen, we laten zien dat m...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het open veld assay biedt een effectieve en niet-invasieve manier om te testen motor functie in muismodellen van spier ziekte, en variaties van deze bepaling kunnen dienen als een waardevolle eindpunt maatregel voor pre-klinische studies. Een belangrijke beperking met dit type van test is de hoge kosten en beperkte toegankelijkheid van activiteit bewakingssystemen. In deze studie tonen we een systeem van de goedkope p.a. open veld activiteit die vergelijkbare resultaten aan bestaande commerciële software en apparatuur ku...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gesteund door subsidies van de National Institutes of Health [R01 AR048179 en R01 HL126204 R.C.W, T32 AR059033 en F32 AR069469to E.M.G] en de spierdystrofie vereniging VS [274143 en 416364 naar R.C.W.].

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
VideocameraApple Inc.ME553LL/AVoor het opnemen van ambulatievideo, iPhone 5S Plus (of gelijkwaardig)
Kinovea software (versie 0.8.15)Kinovea AssociationOpen source video-analysesoftware. Gratis te downloaden, compatibel met pc (versie 0.8.15, www.kinovea.org)
iMovie (versie 10.0.6)Apple Inc.Elke vergelijkbare software kan worden gebruikt om de framesnelheid van video te verlagen (optioneel)
Roughneck 32 Gallon Black Ronde Vuilnisbak (Open veldkamer)Rubbermaid# 1778013Elk open veldkamersysteem kan worden aangepast voor opname. Dit onderzoek gebruikt een opnamekamer gebouwd uit een bak op een platform, op de bodem van een grote vuilnisbak.
Avant Wit Plastic Bak 15"B x 10"D x 1.45"H (Open veldkamer)US Acrylic, LLCElk open veldkamersysteem kan worden aangepast voor opname. Dit onderzoek gebruikt een opnamekamer gebouwd uit een bak op een platform, op de bodem van een grote vuilnisbak.
C57BL/6JJackson Laboratory#000664Mannelijke 6 maanden oude muizen
C57BL/10ScSn-Dmd/J (mdx)Jackson Laboratory#001801Mannelijke 6 maanden oude muizen
mdx: utrophin-Tg (fiona)Gift van James Ervasti, met toestemming van Kay DaviesMannelijke 6 maanden oude muizen

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nagaraju, K., Carlson, G., De Luca, A. Behavioral and locomotor measurements using open field animal activity monitoring system. TREAT-NMD SOP Number M2.1.002. 2. 2, (2010).
  2. Tatem, K. S., et al. Behavioral and locomotor measurements using an open field activity monitoring system for skeletal muscle diseases. J Vis Exp. (91), e51785(2014).
  3. Kobayashi, Y. M., et al. Sarcolemma-localized nNOS is required to maintain activity after mild exercise. Nature. 456 (7221), 511-515 (2008).
  4. Belanto, J. J., et al. Microtubule binding distinguishes dystrophin from utrophin. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5723-5728 (2014).
  5. McDonald, C. M., et al. The 6-minute walk test in Duchenne/Becker muscular dystrophy: longitudinal observations. Muscle Nerve. 42 (6), 966-974 (2010).
  6. Mazzone, E., et al. Star Ambulatory Assessment, 6-minute walk test and timed items in ambulant boys with Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 20 (11), 712-716 (2010).
  7. Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies. Neuromuscul Disord. 22 (1), 34-42 (2012).
  8. Acosta, A. R., et al. Use of the six-minute walk test to characterize golden retriever muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 26 (12), 865-872 (2016).
  9. Sousa, N., Almeida, O. F., Wotjak, C. T. A hitchhiker's guide to behavioral analysis in laboratory rodents. Genes Brain Behav. 5, Suppl 2. 5-24 (2006).
  10. Gibbs, E. M., et al. High levels of sarcospan are well tolerated and act as a sarcolemmal stabilizer to address skeletal muscle and pulmonary dysfunction in DMD. Hum Mol Genet. 25 (24), 5395-5406 (2016).
  11. Gillis, J. M. Multivariate evaluation of the functional recovery obtained by the overexpression of utrophin in skeletal muscles of the mdx mouse. Neuromuscul Disord. 12, Suppl 1. S90-S94 (2002).
  12. Tinsley, J., et al. Expression of full-length utrophin prevents muscular dystrophy in mdx mice. Nat Med. 4 (12), 1441-1444 (1998).
  13. Song, Y., et al. Suite of clinically relevant functional assays to address therapeutic efficacy and disease mechanism in the dystrophic mdx mouse. J Appl Physiol. 122 (3), 593-602 (2017).
  14. Bolivar, V. J. Intrasession and intersession habituation in mice: from inbred strain variability to linkage analysis. Neurobiol Learn Mem. 92 (2), 206-214 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

MuislocomotieOpen Field testvrijwillige bewegingvideotrackinggripkrachtmetingMdx muismodelutrofine transgeenDuchenne spierdystrofie

Gerelateerde artikelen