Optimale voorbereiding van formaline vaste monsters voor Peptide Matrix gebaseerde bijgestaan Laser desorptie/ionisatie massaspectrometrie Imaging Workflows

Summary

Dit protocol beschrijft een reproduceerbare en betrouwbare methode voor de sublimatie gebaseerde voorbereiding van formaline vaste weefsels die bestemd zijn voor imaging Spectrometrie van de massa.

Abstract

Het gebruik van laser matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie, Spectrometrie van de massa (MALDI MSI) imaging is snel uitgebreid, aangezien deze techniek een schare van biomoleculen van drugs en lipiden aan N-glycanen analyseert. Hoewel verschillende monster voorbereiding technieken bestaan, blijft opsporen van peptiden van formaldehyde weefsels bewaard een van de moeilijkste uitdagingen voor dit soort massaspectrometrische analyse. Om deze reden hebben we gemaakt en geoptimaliseerd een robuuste methodologie, die de ruimtelijke gegevens die deel uitmaakt van het monster, terwijl het opwekken van het grootste aantal ioniseerbare peptiden behouden blijven. We hebben er ook op gericht om dit te bereiken in een voordelige en eenvoudige manier, zodat er geen potentiële bias of het preparaat fout, die zich voordoen kan wanneer met behulp van instrumentatie geautomatiseerde. Het eindresultaat is een reproduceerbare en goedkope protocol.

Introduction

Laser matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie massaspectrometrie imaging (MALDI MSI) heeft gewerkt als een beeld gebaseerde techniek voor twee decennia^1,2, analyseren van een aantal biomoleculen inclusief: lipiden³, peptiden^{2 ,4}, eiwitten^2,5, metabolieten^6,7, N-glycanen⁸en synthetische moleculen zoals therapeutische drugs^9,10. Het aantal publicaties aan te tonen het nut van deze techniek zijn de afgelopen tien jaar^6,11,12,13aanzienlijk toegenomen. Bepaalde moleculen, zoals lipiden, zijn relatief eenvoudig te analyseren via MALDI MSI, zoals zij gemakkelijk te als gevolg van de chemische aard ioniseren en dus weinig voorafgaande voorbereiding^{3 vereisen}. Voor moeilijker doelen zoals peptiden zijn de stappen die nodig zijn om effectief deze moleculen ioniseren echter uitgebreid en over het algemeen ingewikkeld¹⁴. Momenteel zijn er weinig publicaties die gericht zijn op adres of aantonen van reproduceerbaarheid in de methodologieën die werkzaam zijn voor te bereiden op weefsel deze unieke visuele techniek¹⁵. Om deze reden hebben we samengesteld van opmerkingen en geïmplementeerd optimalisaties in één eenvoudig te implementeren, methodologie die weinig tot geen wijziging, voor de analyse van peptides van een formaldehyde moet kruiselings gekoppelde weefsel bron¹⁴.

In dit manuscript, hebben we een gevalideerde, low-cost reproduceerbare methodologie voor de detectie en ruimtelijke toewijzing van peptides, gegenereerd op basis van formaline-vaste bevroren (FFF) en formaline-vaste paraffine-ingebedde (FFPE) weefselsecties beschreven. Deze methodologie niet vereisen of vertrouwen op een gespecialiseerde instrumentatie-³. Specifiek, ingaan we op de vele aspecten van gespecialiseerde monstervoorbereiding noodzakelijk om te analyseren van peptiden; stappen zoals antigeen ophalen¹⁶ en matrix coating. Ons protocol maakt ook gebruik van goedkope apparatuur en reagentia, waardoor deze methode toegankelijk te maken voor een bredere gemeenschap die anders zouden kunnen veroorloven de alternatieve robotic apparaat¹⁷.

De redenering achter de ontwikkeling van een handmatige monster voorbereiding methode was tweeledig: ten eerste, het gebruik van een sublimator maakt een coherente en homogene deklaag van kristallen van de matrix die ~ 1 µm in lengte¹⁸, iets niet haalbaar met de gemeenschappelijkere spuiten technieken. Ten tweede, de relatief kleine set-up kosten: de totale kosten van de aangepaste apparatuur was <$ 1500 AUD. Wij stellen vast, in termen van kosteneffectiviteit, dat de prijs per monster is veel goedkoper als er geen robotachtige machines betrokken. Het gebruik van sublimatie is gemeld eerder, echter tot de beste van onze kennis, stapsgewijze methodologieën die dit proces beschrijven en proef de voorbereiding hebben niet gemeld noch in de literatuur beschreven.

Dit protocol is bedoeld om te helpen van onderzoekers die beschikken over een MALDI-massaspectrometer en wie zijn bedoeling op het genereren van ruimtelijke informatie met betrekking tot een bio-molecule van belang¹⁹. In wezen, is MALDI MSI een vorm van histologische screening die niet afhankelijk is van antilichamen of vlekken².

Protocol

Let op: Alle toepasselijke veiligheidsmaatregelen moeten worden gevolgd bij het uitvoeren van deze procedure, met inbegrip van het gebruik van passende persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) (bijvoorbeeld Labjassen, nitril handschoenen, veiligheidsbril, enz.)

1. bereiding van reagentia en apparatuur

1. Bereiding van de oplossingen
   1. Ter voorbereiding Carnoy van fluid 500 mL, meng 100% ethanol (EtOH), chloroform en ijsazijn in een 6:3:1 v/v/v-verhouding in een schone fles Schott.
   2. Los te maken van vloeibare nitrocellulose (NC), NC membraan (gewoonlijk gebruikt in het westelijke bevlekken) in nette aceton, door zachte agitatie, om een eindconcentratie van 40 mg/mL.
2. Voorbereiding van NC bedekt dia 's
   1. Gebruik een soortgelijk aan die wordt gebruikt voor de bereiding van bloed techniek uitstrijkjes voor histopathologisch onderzoek²⁰ te bereiden NC bedekt dia's.
   2. Pipetteer 40 µL van vloeibare NC op een van de randen van een geleidende indium tin oxide (ITO) microscoopglaasje. Met behulp van een regelmatige glasplaatje Microscoop, Sleep de NC onder oppervlaktespanning over de dia maken een gelijkmatige, dunne film-coating.
   3. Laat de NC te drogen bij kamertemperatuur voor 20 s en vervolgens winkel totdat het nodig is bij kamertemperatuur. Opslag van de monsters onder deze omstandigheden kan onbeperkt zijn, mits de weefsels worden onderhouden en vrij van stof.
      Opmerking: Deze methode van voorbereiding is beter bekend als "thin film" en een uniforme coating die is afhankelijk van de viscositeit van de NC, evenals haar gebrek aan oppervlaktespanning tot zelf niveau op de dia zal produceren. De enige zorg die moet worden gehouden bij het voorbereiden van de dia's is niet bewegen te snel, die tot strepen van NC in plaats van een volledige dekking leiden zal.
      Let op: Zoals vloeibare NC zeer snel droogt, is het essentieel om te snel te werken om te voorkomen dat de oplossing drogen voordat het goed verspreid. Bij behandeling van NC in zijn vloeibare toestand, als het is een zeer energieke verbinding en moet geen contact op met een bron van ontsteking om te voorkomen dat brandbommen explosie moet ook zorg worden gehouden. NC ondergaat ook endotherme overgangen wanneer drogen en koude brandwonden veroorzaken kan als toegestaan om in langdurig contact met de huid of gehandschoende handen te komen. Te minimaliseren alle bijbehorende risico's, alleen kleine hoeveelheden moeten worden voorbereid op elk tijdstip (< 1 mL wordt aanbevolen). Eenmaal droog is het stabiel bij kamertemperatuur. NC kan blijven echter Ontploffingsgevaar bij in grote hoeveelheden aanwezig.
3. Creatie van aangepaste damp kamers
   1. Knip een stukje van dikke vloeipapier met een schaar groot genoeg voor de onderste helft van een standaard plastic petrischaal (94 mm in diameter en 3 mm dik).
   2. Snijdt u het papier, verlaten van een rechthoekig strip in het midden, dezelfde grootte als een microscoopglaasje, genoeg overtollige verlaten zodat het papier haar positie in de petrischaal (aanvullende figuur 1 blijft).

2. voorbereiding van weefselsecties

1. FFPE weefsel²¹.
   1. Selecteer de gewenste weefsel blok en de sectie op 12 µm-dikte in een standaard Bank gemonteerde microtoom en float mount op de NC vooraf gecoat ITO dia's.
   2. Onderdompelen van de dia's in verse xyleen te verwijderen van de resterende paraffine gedurende 2 minuten, en herhaal de handeling een tweede keer.
      Opmerking: Als het blok van paraffine vooral alomtegenwoordig is of het weefsel relatief klein vergeleken met het blok van paraffine is, de monsters kunnen worden verwarmd bij 60 ° C te smelten weg de meerderheid vóór wassen in xyleen.
   3. Wassen van de deparaffinized monsters door dompelen de dia's in een gesorteerde reeks van oplosmiddel: 70% v/v EtOH/water, 100% EtOH, Carnoy van vloeistof, 100% EtOH, ultra pure water en 100% EtOH. De duur van elke onderdompeling moet 30 s, met uitzondering van Carnoy van vloeistof, die 2 min duren moet.
      Let op: Carnoy van vloeistof en xyleen moeten worden opgeslagen en gebruikt in een zuurkast, zoals ze zeer giftig zijn inademing.
2. Formaline-vaste bevroren (FFF) weefsel
   Opmerking: Monsters moeten reeds worden bevroren, op de juiste wijze afhankelijk van het type van de steekproef.
   1. Het blok van de weefsel op de bedrijfstemperatuur van de microtoom voor 20 min²²equilibreer.
      Opmerking: Evenwichtsinstelling temperatuur is afhankelijk van het soort weefsel.
   2. Sectie het weefsel gebruikend microtome op 12 µm en dooi mount de secties op een vooraf bereid NC gecoat ITO schuif.
   3. De dia's opslaan in een vacuüm exsiccator op de Bank in het donker.
      Opmerking: Monsters kunnen worden opgeslagen voor enkele weken onder deze omstandigheden.
   4. Wassen van de monsters in een gesorteerde reeks van oplosmiddelen zoals voor FFPE weefsel (2.1.3).
      Opmerking: Er is geen behoefte een xyleen deparaffinisation stap als het monster is niet ingesloten.

3. methyleen dwarslijn hydrolyse

1. Laad de voorbeelddia's (FFF of FFPE) in een plastic dia doos die naar de top is gevuld met 20 mmol tris-HCl (pH 8,8). Verzegel de doos en plaats deze in een waterbad, met 500 mL water, waardoor het vak aan de onderkant raken. Verwarm het vervolgens gedurende 15 minuten op 120 ° C in een snelkookpan die een bedrijfsdruk van 70 kPa bereiken kan.
2. De dia's te verwijderen, laten afkoelen en laat ze drogen bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.

4. de weefsels spijsvertering

1. Zodra gehydrolyseerd, jas van de monsters met 10 µL van trypsine oplossing (1 mg/mL) in ultra pure water, door pipetting 10 µL van de oplossing op de rand van de weefselsectie, gebruik van de dezelfde Pipetteer tip, en sleep vervolgens de druppel over het hele oppervlak van het weefsel onder oppervlakte spanning.
   Opmerking: Vermijd krassen op het oppervlak van het weefsel met de pipet tip en over de verspreiding van het enzym buiten de grenzen van de randen van het weefsel.
2. Toestaan dat de monsters te drogen bij kamertemperatuur.
3. Eenmaal droog, mount de monsters binnen de bovenkant van de eerder gebouwde damp kamer (weefsel naar beneden) met autoclaaf tape op een rand van de dia (aanvullende figuur 2).
4. Pipetteer 600 µL van een oplossing met een mengeling van 1:1 v/v van 100% acetonitril en 50 mM Ammoniumbicarbonaat zorgvuldig op het vloeipapier vinger in het onderste gedeelte van de petrischaal totdat de vinger lijkt te zijn gelijkmatig natte.
5. Plaats de bovenste helft van de zaal van de damp op de onderste helft, zorgen voor de papier-vinger en monster-dia perfect uitgelijnd, en verzegel de kamer rond de evenaar met paraffine film.
6. Laat het monster 's nachts in een incubator 37 ° C om volledige spijsvertering.

5. matrix Coating via sublimatie

1. Zodra de verteerde, wegen de voorbeelddia op een 5-cijferige microanalytical evenwicht.
2. Monteren van de dia op de koeling vinger van de sublimatie apparatuur en veilig met koperen tape, op dezelfde manier als beschreven voor de damp kamer (aanvullende figuur 3).
   Opmerking: Om ervoor te zorgen dat de dia gelijkmatig is benaderd door de koeling vinger, een laag van koper tape is geplaatst op de bodem van de koeling vinger naar het niveau van het oppervlak. Dit zorgt ervoor dat de dia wordt gelijkmatig gekoeld die leidt tot zelfs afzetting van matrix.
3. 300 mg van α-cyano-4-hydroxycinnamic zuur (CHCA) matrix in een glazen petrischaaltje aan de onderkant van de kamer en verspreiding gelijkmatig voor een dunne laag van matrix kristallen plaatsen.
4. Monteren van de sublimator en het veiligstellen van de twee helften met de hoefijzer klem. Opschorten van de geassembleerde unit 15-20 cm boven een zand bad, voorverwarmd op 220 ° C, door deze te plaatsen in een metalen ring verbonden met de stand van een retort.
5. De zaal verbinden met de vacuüm bron, gaan het vacuüm, en laat ze stabiliseren tot ~ 25 mTorr voor 5 min.
6. Pak de koeling vinger naar de top met ijs en voeg 50 mL water. Laat het apparaat te regelen voor een verdere 5 min voordat u verdergaat.
7. Verlagen van de kamer op het oppervlak van het zand, ervoor te zorgen dat het zand volledig contact met de bodem van de kamer, en laat het gedurende 45 minuten te creëren een ideale coating voor 0,22 mg/cm²
   Let op: Zorg moet worden gehouden wanneer de behandeling van glaswerk op hoog vacuüm, zoals schade aan het apparaat, terwijl geëvacueerd, in katastrofisch mislukking van de glazen kamer resulteren kan.
8. Na 45 min, verwijder de zaal uit het zand bad door het verhogen van de metalen ring en luchten van de kamer.
   Opmerking: Zodra de zaal heeft zijn geventileerd, de dia moet worden verwijderd zeer snel als water in de lucht beginnen zal te condenseren op de bevriezing vinger en monster dia.
9. Verwijderen van de dia en wegen ervoor te zorgen dat de gewenste coating is bereikt.
   Opmerking: Als onvoldoende coating is bereikt, gewoon herhalen de sublimatie proces voor de dia totdat de gewenste laagdikte is bereikt.

6. herkristallisatie

1. Zodra gesublimeerd, mount de voorbeelddia binnen de bovenkant van de eerder gebouwde damp kamer, als beschreven eerdere (weefsel naar beneden).
2. Pipetteer 600 µL van een oplossing met een mengeling van 1:1 (v/v) van 100% acetonitril en 0,1% v/v trifluorazijnzuur in water zorgvuldig op het vloeipapier in het onderste gedeelte van de petrischaal om een gelijke deklaag.
3. Monteren van de zaal, ervoor te zorgen de papier tabblad en Microscoop dia perfect uitgelijnd, en laat in een incubator 37 ° C gedurende 1 uur.
   Let op: Niet het zegel van de kamer.
   Opmerking: Zodra recrystallized, de normaal gesproken gele tint van de matrix moet wijzigen in wit, kijken minder glanzend en zeer zelfs verschijnen. Dit geeft aan dat herkristallisatie correct is uitgevoerd.
4. Het monster is nu klaar voor analyse.

7. instrumentation

1. Scan de dia in een flatbed-scanner om te maken van een digitaal beeld.
2. Het monster in de massaspectrometer laden en vervolgens analyseren met behulp van de juiste softwareplatform.
3. Analyseer de monsters in de positieve ion reflectron modus met een massale aantal 750-3500 Da, met een plek resolutie die geldt voor het gewenste resultaat. In de meeste gevallen, 20-50 µm raster breedte is voldoende, maar zo weinig als 10 µm kunnen gebruikte¹⁵.
   Let op: MALDI UV lasers zijn een bron van ioniserende straling en niet direct moeten worden beschouwd. Zorg ervoor dat de laser uitmaakt instrument afscherming vóór bewerking.

Results

Als correct gevolgd, produceert dit protocol beelden die duidelijk de bruto morfologie van het weefsel zonder krassen of andere vervormingen (Figuur 1 vertegenwoordigen). De ideale validatie voor een correct uitgevoerde monstervoorbereiding, is de mogelijkheid om het onderscheid maken tussen verschillende fysieke structuren door het veranderen van het molecuul wordt bekeken (Figuur 2).

Discussion

Dit protocol werd ontworpen om te maximaliseren van de generatie van ioniseerbare moleculaire soorten terwijl het elimineren van de verplaatsing van de analyten. De belangrijkste factoren betrekken met behulp van hetzelfde overkoepelende principe bij de toepassing van de matrix, het verteren van het monster, of recrystallizing na sublimatie²⁴; namelijk, dat een zelfs afzetting van damp, matrix of anders moet worden gemaakt en onderhouden. Pipetteren oplosmiddel wast voor herkristallisatie en spijs...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cryo Microtome	Leica	CM3050	Voor de voorbereiding en doorsnede van weefsel.
Indium Tin Oxide Microscope slides	Bruker	8237001	Voor de voorbereiding en doorsnede van weefsel.
Coplin Jars	Sigma Aldrich	S5516	Voor de voorbereiding en doorsnede van weefsel.
Pressure Cooker	Kambrook	KPR620BSS	Voor de voorbereiding en doorsnede van weefsel.
Sublimator	Chem Glass	NA	Voor sublimatieprocedure. Vergelijkbaar in ontwerp met de CG-3038, maar werd op maat gemaakt
Sand bath	NA	NA	Voor sublimatieprocedure. Fijne rivierzand in gevouwen aluminiumfolie, afkomstig van buiten, niet van een specifiek bedrijf
Glass Petri Dish	Sigma Aldrich	CLS70165100	Voor sublimatieprocedure.
Vacuum Pump	NA	NA	Voor sublimatieprocedure. Aangeschaft als reserveonderdeel van een oude massaspectrometer
Cold trap	Chem Glass	CG-4510-02	Voor sublimatieprocedure.
Hot Plate	John Morris	EW-15956-32.	Voor sublimatieprocedure.
Plastic petri dish	Sigma Aldrich	Z717223	Voor sublimatieprocedure.
37 °C incubator	NA	NA	Voor sublimatieprocedure. Niet van toepassing, incubator is niet steriel en meer dan 30 jaar oud
Blotting paper	Sigma Aldrich	P7796	Voor sublimatieprocedure.
Nitrocellulose	Sigma Aldrich	N8395	Voor het wassen van slides.
Acetone	Sigma Aldrich	650501	Voor het wassen van slides.
Xylene	Sigma Aldrich	214736	Voor het wassen van slides.
100% EtOH	Sigma Aldrich	1.02428	Voor het wassen van slides.
70% EtOH	Sigma Aldrich	NA	Voor het wassen van slides. Gemaakt in lab vanuit 95% stock ethanol
Chloroform	Sigma Aldrich	C2432	Voor het wassen van slides.
Glacial Acetic Acid	Sigma Aldrich	ARK2183	Voor het wassen van slides.
Tris HCL pH 8.8	Sigma Aldrich	TRIS-RO	Voor proteolytische splitsing. Poeder gemaakt tot 1M gevolgd door evenwichtstelling met 32% HCl tot PH 8.8
Milli Q Ultra-Pure Water	Sigma Aldrich	NA	Voor proteolytische splitsing. Zuivering uitgevoerd in huis door sartorious waterzuiveringssysteem
Ammonium Bircarbonate	Sigma Aldrich	A6141	Voor proteolytische splitsing.
Trypsin	Sigma Aldrich	T0303	Voor proteolytische splitsing.
CHCA Matrix	Sigma Aldrich	C2020	Voor rekristallisatie.
Acetonitrile	Sigma Aldrich	1.00029	Voor rekristallisatie.
Trifluoroacetic Acid (TFA)	Sigma Aldrich	302031	Voor rekristallisatie.