Methodenartikel

Een kinetische fluorescentie gebaseerde Ca2 + mobilisatie Assay te identificeren van G eiwit-gekoppelde Receptor agonisten en antagonisten Allosteric modulatoren

8.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56780

⸱

20 februari 2018

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Virology and Chemotherapy, Department of Microbiology and Immunology, Rega Institute for Medical Research, KU Leuven

In dit artikel

Samenvatting

De beschreven cellulaire assay is ontworpen voor de identificatie van CXC chemokine receptor 4 (CXCR4)-interagerende agenten die remmen of deze te stimuleren, concurrerend of allosterically, de intracellulaire Ca2 + release geïnitieerd door CXCR4 activering.

Samenvatting

G eiwit-gekoppelde receptoren (GPCRs) zijn van groot belang voor de farmaceutische industrie, omdat ze betrokken bij vele ziekten bij de mens zijn en goed gevalideerde streefniveaus voor therapeutische interventie. Ontdekking van loodverbindingen, met inbegrip van kleine synthetische moleculen, die een specifiek remmende werking van de receptor functie, is een belangrijke eerste stap in de Geneesmiddelenontwikkeling en is afhankelijk van robuuste, gevoelige en specifieke cel-gebaseerde testen. Hier beschrijven we een kinetische cellulaire assay met een fluorescerende uitlezing hoofdzakelijk ontworpen om te identificeren specifieke receptor antagonisten die een remmende werking van de intracellulaire Ca2 + release opgeroepen bij de activering van de CXC chemokine receptor 4 (CXCR4) door haar endogene ligand, de CXC chemokine ligand 12 (CXCL12). Een belangrijk voordeel van deze methode is dat ook hierdoor screening van verbindingen begiftigd met intrinsieke agonistic eigenschappen (d.w.z., verbindingen die aanleiding kunnen geven tot een toename van de intracellulaire Ca2 + concentratie in de afwezigheid van CXCL12) of verbindingen moduleren van de receptor functie via interactie met allosteric bandplaatsen (d.w.z., positieve en negatieve allosteric modulatoren (PAMs en NAMs, respectievelijk)). Op de keerzijde, kunnen autofluorescent verbindingen interfereren met de bepaling van uitlezing, waardoor het belemmeren van betrouwbare data interpretatie. Waarschijnlijk kan deze test worden uitgevoerd, met minimale aanpassingen, als een generiek geneesmiddel ontdekking assay voor vele andere GPCRs waarvan de Activering tot een vrijval van intracellulaire Ca2 leidt +.

Inleiding

GPCRs zijn een belangrijke superfamilie van cel-oppervlakte-eiwitten die signaaltransductie cascades van extracellulaire ligand bindende activeren. Zij kunnen worden geactiveerd door een grote verscheidenheid van stimuli met inbegrip van peptiden, eiwit hormonen, biogenic amines en lipiden, wat in de opening van uiteenlopende intracellulaire signaalroutes en uiteindelijk biologische reacties1,2 resulteert . Bovendien GPCRs zijn betrokken bij velen, als niet alle, ontwikkelings- en fysiologische processen en vele ziekten bij de mens worden geassocieerd met disfunctionele GPCR signalering of receptor overexpressie. GPCRs behoren daarom tot de meest gevalideerde farmacologische doelen in geneeskunde1,3.

Meestal begint een GPCR workflow voor de ontdekking van de drug met cellulaire screening tests waarmee de identificatie van stoffen zoals kleine molecules, monoklonale antilichamen en peptiden die de activiteit van een bepaalde GPCR kunnen moduleren. In GPCR drugontdekking vele verschillende soorten tests bestaan om te zoeken naar dergelijke verbindingen, zijn waarvan de meeste compatibel met midden - tot high-throughput screening campagnes. De meest gebruikte tests omvatten receptor bindende experimenten, fluorescentie- of luminescentie gebaseerd testen schommelingen in het niveau van de zogenaamde secundaire boodschappers (b.v., Ca2 +, cyclisch adenosinemonofosfaat (AMP)), fenotypische opsporen screening tests, en de aanwerving van de β-arrestin testen4. De keuze voor een bepaald soort assay kan afhangen van meerdere factoren, maar wordt ook bepaald door voorafgaande kennis omtrent de signalering eigenschappen van een bepaalde GPCR. Agonist binden aan een GPCR induceert een conformationele verandering katalyseren van de uitwisseling van guanidine (III) difosfaat (BBP) voor guanidine trifosfaat (GTP) op de α-subunit van heterotrimeric G eiwitten. Vervolgens de Gα-GTP subeenheid distantieert van de G-βγ -subunit en beide subeenheden signaalroutes verder zal starten. Hydrolyse van de GTP-molecuul en de daaropvolgende hernieuwde vereniging van de G-α- BBP en Gβγ subeenheden zal herstellen het G-eiwit in de inactieve conformatie5,6. Gebaseerd op volgorde gelijkenis van de Gα subeenheid verschillende soorten G eiwitten zijn gedefinieerd (Gs, GikGq, G12/13)7. Signalering via de G-α subeenheid geeft aanleiding tot verschillende typische reacties zoals de verhoging (via Gs) of daling (via Gik) van cyclisch ADENOSINEMONOFOSFAAT productie en intracellulaire Ca2 + mobilisatie (via Gq)5 ,7. Gβγ subeenheden kunnen ook voor het opwekken van intracellulaire effector trajecten. Bijvoorbeeld, na activatie van Gik-gekoppelde GPCRs, Gβγ kunnen direct stimuleren phospholipase C (PLC-β) te produceren inositol trifosfaat (IP-3) die als trigger de vrijlating van Ca2 + van intracellulaire winkels7 fungeert . Na receptor activering, zijn GPCRs phosphorylated door GPCR kinases (GRKs) ter bevordering van de interactie met β-arrestins. Dit proces wordt beëindigd G eiwit signalering en leidt tot receptor desensibilisatie en uiteindelijk internalisering. Β-arrestins kunnen ook multi moleculaire complexen die kunnen leiden tot andere signaalroutes onafhankelijk van signalering van8G-proteïne vormen.

Binnen de onderfamilie van chemokine receptoren, de Gik-gekoppelde CXCR4 is een GPCR die veel belangstelling heeft opgeworpen als een veelbelovende doelwit voor drugontdekking. Gelet op haar gevestigde rol als een belangrijke co receptor voor humaan immunodeficiëntie virus (HIV-1) 1 werden virale ingang en infectie, verbindingen richten CXCR4 in eerste instantie ontwikkeld als anti-HIV drug kandidaten9. Meer recentelijk, een groeiend lichaam van bewijsmateriaal heeft gewezen op een belangrijke rol voor CXCR4 tumorvorming en kanker uitzaaiingen, waardoor het een goed gevalideerde therapeutisch doel in oncologie evenals10. CXCR4 wordt sterk uitgedrukt in meer dan twintig soorten menselijke kanker en overleving van de cel van de tumor van besturingselementen, proliferatie, en migratie alsmede tumor-gerelateerde angiogenese10. CXCR4 antagonisten van verschillende chemische klassen geweest eerder beschreven11,12, maar alleen het kleine molecuul dat amd3100 is momenteel goedgekeurd voor gebruik in de kliniek als een stamcel mobilisatie agent gebruikt tijdens de behandeling van het lymfoom en myeloom patiënten13,14. Klinische proeven zijn aan de gang om de veiligheid en de werkzaamheid van verschillende andere CXCR4 antagonisten in verschillende ziekten bij de mens, maar met een sterke focus op oncologie12. Gezien de vele mogelijke toepassingen voor CXCR4 antagonisten, is het zoeken naar nieuwe verbindingen met verbeterde farmacokinetische eigenschappen, verbeterde biologische beschikbaarheid of potentieel minder bijwerkingen gerechtvaardigd.

Hierin een kinetische fluorescentie gebaseerde cellulaire assay hoofdzakelijk gebruikt voor scherm voor verbindingen kunnen remmen CXCR4 wordt beschreven. De fluorescerende meting van deze methode is gebaseerd op de tijdelijke verhoging van de intracellulaire Ca2 + concentratie opgeroepen op CXCR4 activering door de endogene agonist, de chemokine ligand CXCL12 (voorheen bekend als stromale cel afgeleide factor 1α) SDF1-α)), en de potentiële inhibitie van deze CXCL12-geïnduceerde Ca2 + reactie door bepaalde verbindingen. In deze test, worden U87 menselijke glioblastoma cellen stabiel uiting van de menselijke CXCR4 receptor gebruikt. Deze cellen missen op hetzelfde moment, endogene uitdrukking van CXCR7, een verwante chemokine receptor die ook CXCL1215,16,17 bindt. CXCR7 is eerder ook aangetoond te kunnen vormen van de heterodimers met CXCR4, waardoor het moduleren van de signalering eigenschappen van deze laatste receptor18. Schommelingen in de hoeveelheid intracellulair Ca2 + gemedieerd door CXCR4 worden gecontroleerd door het laden van de CXCR4+ cellen met fluo-2 acetoxymethyl (AM) ester, een cel-permeabele hoge affiniteit fluorescerende Ca2 +-bindende kleurstof. Fluo-2 AM is een één golflengte fluorescerende molecule die kan worden enthousiast op 490 nm, terwijl de fluorescentie van de emissie is gemeten op 520 nm. Deze emissie-fluorescentie verhoogt op Ca2 + binding, met een groot dynamisch bereik tussen de Ca2 +-gebonden en ongebonden staat. De toename van fluorescent signaal is van voorbijgaande aard, die zich voordoen binnen een tijdspanne van een paar minuten, en daarna zal vergaan. De piekhoogte van de verdere correlaten van fluorescerende emissie met het niveau van de receptor activering. De test zelf wordt uitgevoerd met behulp van een fluorescentie microplate lezer uitgerust met een CCD geïntensiveerd (ICCD) camera die beschikt over een geïntegreerde pipetting systeem waarmee de standaardisatie van de pipetting stappen in de analyse (Zie Tabel van materialen) . Bovendien, is de gelijktijdige meting van het fluorescerende signaal in ieder putje van een microplate een ander belangrijk voordeel van de lezer van de fluorescentie die wordt gebruikt. Tijdens het eerste deel van de bepaling die de verbindingen onderzochte (bijvoorbeeld, een panel van kleine moleculen met een vaste concentratie of in een verdunningsreeks) worden toegevoegd aan de fluo-2 AM geladen CXCR4+ U87 cellen gevolgd door een ~ 10 min incubatietijd tijdens welke de mogelijke agonistic effect van de verbindingen wordt continu gemeten in real-time. Vervolgens de endogene agonist (d.w.z.CXCL12) wordt toegevoegd aan de cellen om te roepen een CXCR4-gemedieerde voorbijgaande verhoging van het niveau van intracellulaire Ca2 +. Tijdens dit deel van de bepaling kan de potentiële antagonistische activiteit van de geteste stoffen worden geëvalueerd. Een schematisch overzicht van de bepaling in de algemene workflow wordt gepresenteerd in Figuur 1.

Hoewel deze Ca2 + mobilisatie test is vooral gebruikt voor het identificeren en bepalen de remmende potentie van concurrerende CXCR4 antagonisten (d.w.z., verbindingen, waardoor de endogene agonist om te binden en stimuleren de receptor), het ook receptor agonisten kan identificeren en, bovendien, verbindingen die oefenen hun functie door inbinden op allosteric sites (dat wil zeggen, websites die topografisch van de orthosteric binding site bezet door de endogene agonist afwijken). De laatstgenoemde categorie van verbindingen en voorbeelden van allosteric agonisten PAMs en NAMs19,20. Overwegende dat specifieke receptor antagonisten evenals NAMs de CXCL12-geïnduceerde Ca2 + reactie remmen zou, PAMs dit antwoord zou verbeteren (Zie ook bespreking sectie). Hoewel de bepaling hierin specifiek CXCR4 doelen beschreven, wordt verwacht dat deze methode kan worden toegepast op andere GPCRs met minimale optimalisatie inspanning, tenminste als ze het signaal via de vrijlating van intracellulaire Ca2 +.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Opmerking: Alle stappen beschreven onder de punten 1 en 2 worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een laminaire flow kabinet.

1. onderhoud van U87. CD4.hCXCR4 cellen

  1. Het groeien van cellen in T75 cultuur kolven op 37 ° C en 5% CO2 in een bevochtigde incubator.
    Opmerking: De in vitro cellijn gebruikt in dit protocol is een U87 glioblastoma cellijn stabiel uiten cluster van differentiatie 4 (CD4) en mens CXCR4 en is eerder beschreven17. Cel oppervlakte uitdrukking van CD4 en CXCR4 wordt voortdurend gecontroleerd door stroom cytometry en expressie niveaus constant blijven na verloop van tijd (~ 100% CD4+ en ~ 100% CXCR4+ cellen). Een gedetailleerde beschrijving van de generatie van de gebruikte cellijn en de stroom cytometry procedure te onderzoeken receptor expressie niveaus valt niet binnen het toepassingsgebied van dit protocol.
    1. Subcultuur cellen bij 80-85% confluentie. Toestaan dat alle reagentia tot kamertemperatuur (RT) vóór het kweken van de cel.
    2. Verwijderen van de geconditioneerde cultuurmedium van de cellen en wassen van de cel enkelgelaagde eenmaal met 5 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
    3. Voeg 3 mL van 0,25% trypsine-EDTA en gelijkmatig verdelen over de cel enkelgelaagde. Verwijder de overmaat van trypsine-EDTA vervolgens en incubeer tot 5 min. bij 37 ° C tot cellen beginnen om los te maken.
    4. Voeg 10 mL verse volledige groeimedium (Dulbecco van bewerkt Eagle's Medium (DMEM) + 10% foetale boviene Serum (FBS) + 0,01 M HEPES + gewenste agenten). Resuspendeer de cellen door pipetteren zachtjes op en neer. De celsuspensie overbrengen in een steriele 50 mL-buis.
    5. Het aantal levensvatbare cellen met behulp van een methode van keuze. In het geval van U87 glioblastoma cellen, levensvatbaarheid in het algemeen bereikt ~ 100%.
      Opmerking: Cel nummers kan op verschillende manieren worden bepaald. Regelmatig gebruiken we een systeem voor de analyse van geautomatiseerde cel is gebaseerd op trypan blauw kleuring (Zie Tabel van materialen) volgens de norm hanteren van procedures, maar andere manieren moet even goed werken.
    6. 2 x 106 of 3 x 106 (levensvatbare) cellen toevoegen aan een eindvolume van 25 mL vers groeimedium in een maatkolf van T75 cultuur en Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2.
      Opmerking: Als 3 x 106 cellen gebruikt de cellen zal 80-90% confluentie bereiken na 2 dagen. Als 2 x 106 cellen worden gebruikt, zal zij de dezelfde confluentie bereiken na 3 dagen. Het groeitempo op jaarbasis van de cellen moet eerst empirisch worden bepaald als andere cellijnen worden gebruikt.

2. het zaaien van de cellen voor de Ca2 + mobilisatie Assay

  1. Bottom (Zie Tabel van materialen) met een 0,1% gelatine oplossing te vergemakkelijken van cel bijlage op de dag van de cel passaging (dag 0), vacht zwart-ommuurde polystyreen 96-wells-platen met clear.
    Opmerking: Coating van de 96-wells-platen met gelatine kan worden weggelaten als vooraf gecoate platen, die commercieel beschikbaar is (Zie Tabel of Materials), worden gebruikt. Het is raadzaam om het gebruik van vooraf gecoate platen in plaats van de handmatige coating voor elke regel van de cel onderzochte voordat u verdergaat met het protocol te evalueren.
    1. Bereid gelatine oplossing door 1 gram gelatine toe te voegen tot 100 mL PBS te verkrijgen van een 1%-oplossing. Verdun door 10 x met PBS voor verder gebruik. Ter verbetering van de oplosbaarheid van gelatine, Verwarm de oplossing tot 37 ° C.
    2. Voeg 100 µL van 0,1%-oplossing van de gelatine per putje van de 96-wells-plaat met een meerkanaalspipet. Incubeer gedurende 2 uur op RT.
  2. In de tussentijd bereidt de cellen voor het zaaien in de gecoate 96-wells-plaat.
    1. Loskoppelen van de cellen uit de cultuur-kolf, resuspendeer hen in verse groeimedium, en ze tellen met behulp van trypan blauw kleuring methode.
    2. Spin down de cellen in een tube van 50 mL voor 5 min bij 400 x g bij RT.
    3. Resuspendeer de cellen in verse groeimedium (DMEM + 10% FBS + 1% HEPES, geen antibiotica) te verkrijgen van een celdichtheid van 0.1 x 106 (haalbaar) cellen/mL.
  3. Verwijder de gelatine oplossing aan de zwart-ommuurde platen met duidelijke bodem door flipping via de plaat en drogen op een weefsel. Voeg toe 200 µL per putje PBS flip-over de plaat weer te verwijderen overtollige gelatine.
  4. Afzien van de celsuspensie (overeenkomend met 0,2 x 105 cellen) 200 µL per putje in de gelatine beklede 96-wells-plaat (vanaf nu een deze plaat zal worden verder genoemd de "meting plaat").
  5. Incubeer de plaat 's nachts bij 37 ° C en 5% CO2.

3. laden van de cellen met een fluorescerende Ca2 + -gevoelige kleurstof

  1. Uitvoeren op dag 1 de werkelijke Ca2 + mobilisatie assay, beginnend met het laden van de geplaatste cellen met de fluorescerende Ca2 +-bindende kleurstof fluo-2 AM.
    1. Assay buffer te bereiden door toevoeging van 40 mL HEPES (1 M) op 200 mL Henks evenwichtig zoutoplossing (HBSS, 10 x, geen fenol rood, geen natriumbicarbonaat). Voeg ultrazuiver water voor het verkrijgen van een eindvolume van 2 L en 4 g bovien serumalbumine (BSA) toevoegen. Los van de BSA via magnetische roeren. Breng de pH op 7.4 (met NaOH) en filtreer de oplossing.
      Opmerking: Tijdens alle volgende stappen de dezelfde buffer, hierna aangeduid als "assay buffer", wordt gebruikt.
    2. Bereiden van een stamoplossing (4 mM in dimethylsulfoxide (DMSO)) van de fluorescerende Ca2 +-gevoelige kleurstof fluo-2 AM. Vermijd overmatige blootstelling aan licht. Los 1 mg fluo-2 AM (moleculair gewicht: 1,061 g/mol) in 235.6 µL DMSO.
    3. Bereid een werkende oplossing van fluo-2 AM. Voor een bepaling van de 96-wells-plaat Meng 12,5 µL van fluo-2 AM stockoplossing (4 mM) en 12,5 µL nonionic oppervlakteactieve stof polyol (bijvoorbeeld, pluronic f-127) oplossing (20% gewicht/volume in DMSO, Zie Tabel van materialen). 22 µL van dit mengsel aan 11 mL assay buffer in een tube van 15 mL toevoegen. De uiteindelijke concentratie van fluo-2 AM is 4 µM.
      Opmerking: De nonionic oppervlakteactieve stof wordt gebruikt als een agent van de spreiding te verbeteren van de oplosbaarheid in water van fluo-2 AM en gevolg, ter verbetering van de cel laden. Als u wilt solubilize oppervlakteactieve stof in DMSO, verwarm het monster bij 37 ° C en meng regelmatig te verkrijgen van een homogene oplossing.
    4. Verwijder het groeimedium uit de eerder geplaatste cellen in de meting van de 96-wells-plaat door flipping via de plaat en drogen op een keukenrol.
    5. Voeg 100 µL van het laden kleurstof oplossing per putje met behulp van een meerkanaalspipet en incubeer gedurende 45 min. op RT in het donker.

4. voorbereiding van polypropyleen 96-wells-platen bevattende de Chemokine Ligand-CXCL12 of de verbindingen onderzochte

  1. Ronde bodem polypropyleen (PP) 96-wells-platen (Zie Tabel van materialen) te verkrijgen.
    1. Toestaan dat de stockoplossing van CXCL12 (1 mg/mL) en de stockoplossing van de verbindingen onderzochte aan equilibreer op RT.
      Opmerking: De stockoplossing van CXCL12 wordt bereid in ultrazuiver water aangevuld met 0,01% Tween20 en als eenmalig gebruik aliquots bij-20 ° C is opgeslagen.
    2. Bereiden van een 5 x geconcentreerde oplossing van CXCL12 in assay buffer (250 ng/mL die gelijk is aan 31,25 nM) en een 5 x geconcentreerd verdunning van elke verbinding (in assay buffer).
    3. Afzien van de voorraadoplossingen in de passende 96-wells-plaat volgens een vooraf gedefinieerde plaat lay-out. Afzien van 75 µL per putje in de plaat met CXCL12 (de "chemokine plate"), afzien van 50 µL per putje in de plaat met de verbindingen (de "samengestelde plaat").
      Opmerking: Beide verbindingen en CXCL12 zal uiteindelijk worden verdund 5 x op de verstrekking in de meting plaat. Het is ook belangrijk op te nemen van negatieve controleputjes met alleen assay buffer in zowel de samengestelde plaat evenals de chemokine plaat. Ook positieve controleputjes moeten worden opgenomen (dat wil zeggen, met CXCL12 in de chemokine plaat, maar met assay buffer in de overeenkomstige putjes van de samengestelde plaat wells).

5. protocolinstellingen op de fluorescentie Microplate lezer

Opmerking: De fluorescentie microplate lezer gebruikt in dit protocol wordt aangeduid in de Tabel van materialen.

  1. Zet eerst de koeler unit van de fluorescentie-afleesapparaat, en schakel over op de fluorescentie-lezer zelf. Laat voor een paar minuten starten en openen van de systeemsoftware.
  2. Maken van de test-protocol met behulp van de drag-and-drop-menu dat bestaat uit de volgende stappen:
    1. Selecteer in het vak "Instellingen", 'Read_Mode' met excitatie golflengte: 470-495 nM; emissie golflengte: 515-575 nM.
      Opmerking: De geselecteerde golflengten zijn geschikt voor gebruik met de Ca2 +-gevoelige kleurstof fluo2.
    2. Het vak "Mix met TF" (overdracht vloeistof) automatische menging van de verbindingen in de samengestelde plaat, die zullen worden gebracht op de bron 2-positie van het apparaat omvatten (zie stap 6.4). Selecteer 15 µL van oplossing in elk putje te worden automatisch aanzuiging gemengd driemaal. De hoogte van de uiteinden van de pipet op 20 µL onder het vloeistofoppervlak aangepast. Stel de snelheid van aspiratie en verstrekking op 50 µL/s.
      Opmerking: De hoogte van de pipet tips verwijst naar het volume dat is links onder de uiteinden van de pipet. Bijvoorbeeld, als de putjes van de plaat in een samengestelde 50 µL bevat, een hoogte van 30 µL komt overeen met 20 µL onder het vloeistofoppervlak. Het volume van samengestelde oplossing genomen te mengen, de snelheid van het mixen, de positie van de pipet tips tijdens het mengen, en het aantal cycli mengen kan alles worden aangepast met behulp van de software.
    3. Definieer in het vak "Fluid Transfer" dat 20 µL van elk goed van de samengestelde plaat zal worden overgebracht in de meting plaat. Plaats de pipet tips op 20 µL oppervlak dat wil zeggen, op hoogte 30 µL tijdens aspiratie van de verbindingen en hoogte 60 µL tijdens de verstrekking in de meting plaat onder de vloeistof. Stel de snelheid van aspiratie bij 50 µL/s en de snelheid van de verstrekking van 25 µL/s.
      Opmerking: De samengestelde plaat bevat 50 µL per putje oplossing (zie stap 4.1.3), dus een hoogte van 30 µL correspondeert met een positie 20 µL onder het vloeistofoppervlak. De meting plaat bevat 80 µL van assay buffer per putje (zie stap 6.3), dus een hoogte van 60 µL correspondeert met een vergelijkbare positie van de tips.
    4. Selecteer de knop "Read met TF". Selecteer tijdens het eerste interval, 60 leest (fluorescerende metingen) met een lees intervaltijd van 1 s. definiëren die 10 leest worden opgenomen vóór de verstrekking van de verbindingen in de meting plaat, en 50 leest daarna. Definiëren van het tweede interval met een lees intervaltijd van 30 s en 18 leest.
      Opmerking: Tijdens deze stap fluorescentie zal worden gemeten kinetisch (met tussenpozen de gedefinieerde tijd) voor ~ 10 min in totaal.
    5. Drie keer de "Wash Tips" knop in het protocol opnemen. Binnen elke wassen stap, selecteer het vloeibaar type: vloeistof een (ultrazuiver water) of vloeistof B (70% ethanol), het aantal wassen cycli (1), de pomp snelheid (snel), en het aantal slagen (5) tijdens elk wassen stap.
      Opmerking: Tijdens de eerste en laatste wassen stap vloeistof A wordt gebruikt, tijdens de tweede wassen stap vloeistof die b wordt gebruikt.
    6. De functie "Pauze pipet" opnemen. Instellen van de pipet om te pauzeren voor 300 s.
      Opmerking: Door deze stap in het protocol, het hoofd van de pipet, die is geïntegreerd in de fluorescentie plaat lezersapparaat, zal pauzeren gedurende 5 minuten voordat u doorgaat het protocol.
    7. Het vak "Mix met TF" zodat automatische mengen van de oplossing van de CXCL12 in de chemokine plaat, die zal worden geplaatst op de bron 3-positie van het apparaat omvatten (zie stap 6.4). Selecteer 15 µL van oplossing in elk putje te worden automatisch aanzuiging gemengd driemaal. Plaats de pipet tips 20 µL onder het vloeistofoppervlak tijdens aspiratie en mengen. De snelheid van aspiratie en verstrekking is vastgesteld op 50 µL/s.
      Opmerking: Net wat stap 5.2.2, deze parameters kunnen worden aangepast.
    8. In het volgende vak "Fluid Transfer" definiëren dat 25 µL van elk goed voor de chemokine plaat zal worden overgebracht in de meting plaat. Positie 20 µL tips hieronder de vloeistof oppervlak dat wil zeggen, op hoogte 55 µL tijdens aspiratie van de chemokine plaat waarin 75 µL per putje (zie stap 4.1.3), en op hoogte 80 µL tijdens de verstrekking in de meting plaat. Stel de snelheid van aspiratie bij 50 µL/s en de snelheid van de verstrekking van 25 µL/s.
    9. Voeg de "Lezen met TF" button. Selecteer tijdens het eerste interval, 145 leest met een lees intervaltijd van 1 s. definiëren die 5 leest worden opgenomen vóór de verstrekking van CXCL12 in de meting plaat, en 140 leest daarna. Definiëren van het tweede interval met een lees intervaltijd van 6 s en selecteer 20 leest.
      Opmerking: Tezamen, gedurende het gehele protocol 243 leest (fluorescerende metingen) worden geregistreerd: 78 bij stap 5.2.4 en 165 tijdens stap 5.2.9.
    10. Vergelijkbaar met de stap van 5.2.5, zijn voorzien van de knop "Wassen tips" driemaal in het protocol.
      Opmerking: Met inbegrip van deze stap aan het eind van het protocol maakt het mogelijk dat de tips opnieuw kunnen worden gebruikt voor het uitvoeren van een andere bepaling zonder te wijzigen de tips.
  3. De temperatuur van het apparaat bij 37 ° C instellen door op de "Set fase temperatuur" knop te klikken en te selecteren van de 37 ° C.

6. het uitvoeren van de bepaling van de fluorescentie

  1. Na de meting heeft de plaat geïncubeerd met het laden van de buffer voor 45 min (zie stap 3.1.5), verwijderen van de buffer door flipping via de plaat en het droog op een weefsel.
  2. Wassen van de geplaatste cellen door toevoeging van 150 µL per putje van assay buffer en incubeer gedurende 2 min.
  3. Verwijder de buffer weer door flipping via de plaat. Voeg 80 µL per putje van assay buffer met een meerkanaalspipet.
  4. Alle platen in het apparaat op hun juiste positie gebracht: de samengestelde plaat op de bron 2 positie, de chemokine plaat op de bron 3-positie, en de plaat van de meting op de Lees positie. Zetten een doos van zwarte tips bij de bron 1 tips positie. Deur van het apparaat en incubeer gedurende 5 min voordat u doorgaat het protocol.
  5. Selecteer de knop "Protocol signaal test" om de achtergrond relatief licht eenheden (RLUs) en fluorescentie variantie over de plaat. Een nieuw venster zal verschijnen. Selecteer "Test signaal".
    Opmerking: Tijdens deze stap achtergrond RLUs worden bepaald door de ICCD camera, die is geïntegreerd in het compartiment van de optica van de fluorescentie lezersapparaat. Deze RLUs het gevolg zijn van de excitatie van de Ca2 +-gevoelige kleurstof (fluo-2) door lichtemitterende diodes (LEDs) (LED uitgang golflengte 470-495 nm). Waarden van 8.000-10.000 RLUs zijn geschikt voor deze toepassing. RLUs kan, indien nodig, worden aangepast door de excitatie-intensiteit (Selecteer excl. intensiteit), of de camera poort (Selecteer poort Open) te wijzigen. De afwijking over de plaat moet idealiter minder dan 7,5%.
  6. Kies "Update" als achtergrondwaarden van 8.000-10.000 RLUs worden verkregen. Het belangrijkste protocol opslaan door op Opslaan te klikken.
    Opmerking: Door dit te doen, de instellingen van de protocol signaal test zal worden overgedragen naar het belangrijkste protocol.
  7. Uitvoeren van de bepaling door de "RUN"-knop te drukken.

7. de gegevensanalyse en kwaliteit

  1. Nadat de test is voltooid, opent u het "Analyse" in software van het systeem.
    1. Ga naar "correcties configureren" en kies "reactie over base line". Define base line 1 om te starten bij meting 1 en eind meting 5; de gemiddelde fluorescentie worden berekend in elk putje tussen meting 1 en 5.
      Opmerking: Alle verdere metingen uit een bijzonder goed zijn gedeeld door deze goed-specifieke basislijn 1.
      1. Define base line 2 om te beginnen bij meting 78 tot meting 83 (CXCL12 wordt aangeboden na meting 83; opnieuw de gemiddelde fluorescentie is berekend in elk goed tussen meting 78 en 83 en deze correctiefactor wordt toegepast op alle metingen na meting 83).
    2. Activeren van de aankruisen "weergeven als percentage" en "aftrekken achtergrond".
    3. Ga naar "Configure kinetische vermindering". Kies om te beoordelen het remmende effect van verbindingen op de CXCL12-geïnduceerde Ca2 + reactie, Max-Min vanaf meting 84 (dat wil zeggen, de eerste meting na die CXCL12 wordt aangeboden) tot 243 (dat wil zeggen, de laatste meting).
      Opmerking: Door te kiezen voor Max-Min het verschil tussen de minimale en maximale respons over basislijn tussen meten 84 en meting 243 wordt gemeld. Als de Max-Min is gekozen starten tussen 11 meting en meting 78, wordt het verschil tussen de minimale en maximale respons over basislijn ten opzichte van de basislijn 1 gemeld. Deze waarde kan worden gebruikt voor het analyseren van de potentiële agonistic activiteit van de verbindingen, Zie discussie).
    4. De gegevens zullen worden gevisualiseerd in de software van het systeem. Indien nodig, de ruwe gegevens exporteren voor aanvullende analyse en visualisatie in andere gemeenschappelijke analyse softwarepakketten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het effect van CXCL12 stimulatie op de intracellulaire Ca2 + mobilisatie in U87. CD4.CXCR4+ en U87. CD4-cellen werd geëvalueerd met de Ca2 + mobilisatie test. In plaats van 20 µL van teststof die normaal zou worden toegevoegd tijdens de eerste pipetting stap van het protocol (Figuur 1), assay buffer is toegevoegd aan de fluo-2 AM geladen U87. CD4.CXCR4+ cellen in de meting plaat. Tijdens de tweede stap van de verstr...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De Ca2 +-mobilisatie assay hierin beschreven eerder blijkt te zijn een waardevol instrument te identificeren en te karakteriseren receptorantagonisten targeting CXCR417. Verwacht wordt, echter dat deze methode worden meer in het algemeen op een grote groep van andere GPCRs die leiden een cytosolische Ca2 + release op hun activering, toegepast kan tot zoals geïllustreerd voor de verwante chemokine receptor CCR5. Overwegende dat bij CCR5 precies dezelfde experimentele omstandig...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs bedank Eric Fonteyn en Geert Schoofs voor uitstekende technische bijstand. Dit werk werd ondersteund door de KU Leuven (verlenen neen. PF/10/018), het Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO, neen verlenen. G.485.08), en de Fondation chalets Vaduz.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Fluo-2 AMAbcamab142775fluorescent Ca2+ gevoelige kleurstof
Pluronic F-127SigmaP2443-250Gpluronzuur
GelatineSigmaG9391
AMD3100SigmaA5602-5 mgspecifieke CXCR4-antagonist
Maravirocvriendelijk aangeboden door AnorMedantiretroviraal medicijn, CCR5-antagonist
Chemokine ligand CXCL12PeproTech300-28A
Chemokine ligand CCL5PeproTech300-06
Fetaal Runderserum (FBS)Gibco (Life Technologies)10270-106
Rundsersalbumine (BSA)SigmaA1933-25G
Dulbecco's Gemodificeerd Eagles Medium (DMEM)Gibco (Life Technologies)41965-039
HBSS (10 x), calcium, magnesium, geen fenolroodGibco (Life Technologies)14065-049
HEPES (1 M)Gibco (Life Technologies)15630-056
Trypsine-EDTA (0,25 %), fenolroodGibco (Life Technologies)25200-056
Dulbecco's Fosfaat Buffered Saline (DPBS)Gibco (Life Technologies)14190-094
Falconbuisjes, 50 mLGreiner Bio-One227 261
Weefselkweekkolf (T75)Corning353024
Zwarte plaat, 96-putjes, heldere bodem, met dekselCostar/Fisher Scientific10530753assayplaat (96-putjes), voor celzaaien
Polypropyleen (PP) platenThermo Scientific (VWR)732-2661platen gebruikt voor het voorbereiden van de compound platen en chemokine platen, ronde bodem
FLIPR Tetra hoge doorvoer celscreening systeemMolecular DevicesFluorescente plate reader met geïntegreerde pipetkop en ICCD-camera
FLIPR Tetra LED Module 470 - 495 nmMolecular Devices0200-6128Lichtemitterende diodes voor excitatie van de fluorescente Ca2+ gevoelige kleurstof
FLIPR Tetra Emissiefilter 515 - 575 nmMolecular Devices0200-6203emissiefilter compatibel met de fluorescente kleurstof
FLIPR Tetra 96 HoofdMolecular Devices0310-453696-putjes pipetkop, geïntegreerd in de fluorescente plate reader
ScreenWorksMolecular Devicessoftwarepakket gebruikt voor data-analyse en visualisatie op de FLIPR Tetra
Vi-CELLBeckman Coultercellevensvatbaarheidsanalysator
Corning CellBIND 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates, met Deksel, SterileCorning3340Vooraf gecoate 96-putjes assayplaten die een alternatief kunnen zijn voor handmatig coaten van de assayplaat.

Referenties

  1. Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
  2. Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints. Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).
  3. Lappano, R., Maggiolini, M. G protein-coupled receptors: novel targets for drug discovery in cancer. Nat Rev Drug Discov. 10, 47-60 (2011).
  4. Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacol Sin. 33, 372-384 (2012).
  5. Milligan, G., Kostenis, E. Heterotrimeric G-proteins: a short history. Br J Pharmacol. 147, Suppl 1. S46-S55 (2006).
  6. Tuteja, N. Signaling through G protein coupled receptors. Plant Signal Behav. 4, 942-947 (2009).
  7. Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. G protein pathways. Science. 296, 1636-1639 (2002).
  8. Smith, J. S., Rajagopal, S. The beta-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors. J Biol Chem. 291, 8969-8977 (2016).
  9. Zhang, H., et al. Discovery of non-peptide small molecular CXCR4 antagonists as anti-HIV agents: Recent advances and future opportunities. Eur J Med Chem. 114, 65-78 (2016).
  10. Chatterjee, S., Behnam Azad, B., Nimmagadda, S. The intricate role of CXCR4 in cancer. Adv Cancer Res. 124, 31-82 (2014).
  11. Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A., Neamati, N. Small molecule inhibitors of CXCR4. Theranostics. 3, 47-75 (2013).
  12. Tsou, L. K., et al. Harnessing CXCR4 antagonists in stem cell mobilization, HIV infection, ischemic diseases, and oncology. Med Res Rev. , (2017).
  13. Keating, G. M. Plerixafor: a review of its use in stem-cell mobilization in patients with lymphoma or multiple myeloma. Drugs. 71, 1623-1647 (2011).
  14. DiPersio, J. F., et al. Phase III prospective randomized double-blind placebo-controlled trial of plerixafor plus granulocyte colony-stimulating factor compared with placebo plus granulocyte colony-stimulating factor for autologous stem-cell mobilization and transplantation for patients with non-Hodgkin's lymphoma. J Clin Oncol. 27, 4767-4773 (2009).
  15. Balabanian, K., et al. The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes. J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).
  16. Burns, J. M., et al. A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development. J Exp Med. 203, 2201-2213 (2006).
  17. Van Hout, A., D'Huys, T., Oeyen, M., Schols, D., Van Loy, T. Comparison of cell-based assays for the identification and evaluation of competitive CXCR4 inhibitors. PLoS One. 12, e0176057(2017).
  18. Levoye, A., Balabanian, K., Baleux, F., Bachelerie, F., Lagane, B. CXCR7 heterodimerizes with CXCR4 and regulates CXCL12-mediated G protein signaling. Blood. 113, 6085-6093 (2009).
  19. Wootten, D., Christopoulos, A., Sexton, P. M. Emerging paradigms in GPCR allostery: implications for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 12, 630-644 (2013).
  20. Burford, N. T., Watson, J., Bertekap, R., Alt, A. Strategies for the identification of allosteric modulators of G-protein-coupled receptors. Biochem Pharmacol. 81, 691-702 (2011).
  21. Hendrix, C. W., et al. Safety, pharmacokinetics, and antiviral activity of AMD3100, a selective CXCR4 receptor inhibitor, in HIV-1 infection. J Acquir Immune Defic Syndr. 37, 1253-1262 (2004).
  22. Schols, D., Este, J. A., Henson, G., De Clercq, E. Bicyclams, a class of potent anti-HIV agents, are targeted at the HIV coreceptor fusin/CXCR-4. Antiviral Res. 35, 147-156 (1997).
  23. Perry, C. M. Maraviroc: a review of its use in the management of CCR5-tropic HIV-1 infection. Drugs. 70, 1189-1213 (2010).
  24. Mehlin, C., Crittenden, C., Andreyka, J. No-wash dyes for calcium flux measurement. Biotechniques. 34, 164-166 (2003).
  25. Zhao, H., et al. CXCR4 over-expression and survival in cancer: a system review and meta-analysis. Oncotarget. 6, 5022-5040 (2015).
  26. De Clercq, E. The AMD3100 story: the path to the discovery of a stem cell mobilizer (Mozobil). Biochem Pharmacol. 77, 1655-1664 (2009).
  27. Milligan, G. Constitutive activity and inverse agonists of G protein-coupled receptors: a current perspective. Mol Pharmacol. 64, 1271-1276 (2003).
  28. Kenakin, T., Miller, L. J. Seven transmembrane receptors as shapeshifting proteins: the impact of allosteric modulation and functional selectivity on new drug discovery. Pharmacol Rev. 62, 265-304 (2010).
  29. Conn, P. J., Christopoulos, A., Lindsley, C. W. Allosteric modulators of GPCRs: a novel approach for the treatment of CNS disorders. Nat Rev Drug Discov. 8, 41-54 (2009).
  30. Burford, N. T., et al. Discovery of positive allosteric modulators and silent allosteric modulators of the mu-opioid receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10830-10835 (2013).
  31. Bartfai, T., Wang, M. W. Positive allosteric modulators to peptide GPCRs: a promising class of drugs. Acta Pharmacol Sin. 34, 880-885 (2013).
  32. Hatse, S., et al. Fluorescent CXCL12AF647 as a novel probe for nonradioactive CXCL12/CXCR4 cellular interaction studies. Cytometry A. 61, 178-188 (2004).
  33. Seifert, R., Wenzel-Seifert, K. Constitutive activity of G-protein-coupled receptors: cause of disease and common property of wild-type receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 366, 381-416 (2002).
  34. Zhang, W. B., et al. A point mutation that confers constitutive activity to CXCR4 reveals that T140 is an inverse agonist and that AMD3100 and ALX40-4C are weak partial agonists. J Biol Chem. 277, 24515-24521 (2002).
  35. Tamamura, H., et al. A low-molecular-weight inhibitor against the chemokine receptor CXCR4: a strong anti-HIV peptide T140. Biochem Biophys Res Commun. 253, 877-882 (1998).
  36. Wang, Z. -x, et al. Chemokine Biology - Basic Research and Clinical Application: Volume II: Pathophysiology of Chemokines. Neote, K., Letts, G. L., Moser, B. , Birkhäuser Basel. 61-77 (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

GPCR assaycalciummobilisatiefluorescentie gebaseerde assayCXCR4 antagonist screeningGPCR geneesmiddelenontwikkelingkinetische fluorescentie assayintracellulaire calciumvrijgavedetectie van allosterische modulatorenidentificatie van agonisten en antagonistenCXCL12 stimulatie

Gerelateerde artikelen