Eencellige Microfluidic analyse van Bacillus subtilis

Samenvatting

Presenteren we een methode voor de analyse van de microfluidic van afzonderlijke bacteriële cel lineages met behulp van Bacillus subtilis als voorbeeld. De methode overwint tekortkomingen van de traditionele analysemethoden in microbiologie doordat observatie van honderden cel generaties strak controleerbaar en uniforme groei omstandigheden.

Samenvatting

Microfluidic technologie overwint veel van de beperkingen van traditionele analysemethoden in de microbiologie. In tegenstelling tot bulk-kweekmethoden biedt het eencellige resolutie en lange observatie tijden verspreid over honderden generaties; in tegenstelling tot agarose pad gebaseerde microscopie heeft het uniforme groei-omstandigheden die streng gecontroleerd kunnen worden. Omdat de continue stroom van groeimedium isoleert de cellen in een microfluidic-apparaat uit onvoorspelbare variaties in de lokale chemische omgeving veroorzaakt door celgroei en metabolisme, authentieke wijzigingen in genexpressie en celgroei in reactie op specifieke stimuli kunnen meer zelfverzekerd worden waargenomen. Bacillus subtilis wordt gebruikt als een model bacteriesoorten om aan te tonen van een "moeder machine"-methode voor de analyse van de cellulaire typt. We laten zien hoe construeren en plumb een microfluidic apparaat, laad het met cellen leiden microscopische beeldvorming en cellen op een prikkel bloot door het overschakelen van ene groeimedium naar de andere. Een stress-responsieve verslaggever wordt gebruikt als een voorbeeld te onthullen van het type gegevens die door deze methode kunnen worden verkregen. We bespreken ook kort verdere toepassingen van deze methode voor andere soorten experimenten, zoals analyse van bacteriële sporevorming.

Inleiding

Een van de meest opvallende kenmerken van het leven op aarde is haar grote veerkracht en verscheidenheid. Een centrale doelstelling van de moleculaire biologie is te begrijpen van de logica die cellen genen en eiwitten gebruiken om te maximaliseren hun groei en fitness onder een breed scala van milieuomstandigheden. Om dit te bereiken, moeten de wetenschappers kunnen gerust vaststellen hoe afzonderlijke cellen groeien, verdelen en hun genen onder een bepaalde reeks voorwaarden express, merkt hoe de cellen reageren op wijzigingen in hun omgeving. Traditionele analysemethoden in microbiologie echter technische beperkingen die invloed hebben op de soorten vragen die kunnen worden aangepakt. Bijvoorbeeld, bulk cultuur gebaseerde analyses door de jaren heen zeer nuttig zijn geweest, maar zij bieden alleen populatieniveau gegevens die zinvolle cel-naar-cel variaties of het gedrag van de kleinere subpopulatie van cellen in de totale bevolking kunnen maskeren. Eencellige analyses van levende bacteriën op basis van de lichte microscopie van eencellige gedrag onthullen, maar zijn ook technisch beperkt. Bacteriën zijn meestal geïmmobiliseerd op agarose pads met groeimedium, maar cel groei en deling drukte de microscopische weergave en put de beschikbare voedingsstoffen na slechts een paar cel cycli, aanzienlijk beperken de observatie tijd^{1, 2}. Bovendien, de lokale uitputting van voedingsstoffen en de daarmee gepaard gaande opbouw van metabole bijproducten als gevolg van de celgroei voortdurend veranderen de plaatselijke cel groei omgeving op een manier die moeilijk te meten of te voorspellen. Dergelijke veranderingen in het milieu met behulp van agarose pads is een uitdaging voor studies van stationaire gedrag of van cellulaire reacties op specifieke wijzigingen in groei voorwaarden³.

Microfluidic-technologie, waarin een opgietvloeistof voortdurend via microfabricated apparaten stroomde is, biedt een oplossing voor klassieke experimentele beperkingen. Een microfluidic apparaat kunt afzonderlijke cellen in positie voor live-cel microscopie houden, terwijl de stroom van groeimedium voortdurend cellen met verse voedingsstoffen biedt en metabole bijproducten en overtollige cellen, waardoor een zeer uniforme groei wegspoelt milieu. Onder constante groei omstandigheden, kunnen de cel gedrag los van de invloed van milieufactoren, waardoor een onbelemmerde weergave van de interne logica van cellen worden waargenomen. Naarmate de vloeistofstromen voorkomt dat het apparaat microfluidic steeds vol met cellen, wordt observatie van eencellige lineages voor tientallen of honderden generaties mogelijk^4,5. Zulke momenten van lange observatie toestaan de detectie van anders niet aantoonbaar op lange termijn of zeldzame cel gedrag. Ten slotte, de samenstelling van het medium dat stroomt door het apparaat kunnen worden gewijzigd op zal, waardoor cellen worden waargenomen als ze aan het begin van een stress of aan de invoering of verwijdering van een bepaalde stof reageren.

Microfluidics heeft al genoten van een aantal belangrijke toepassingen. Bijvoorbeeld, is het gebruikt in weefsel-, orgel- of lichaam-on-a-chip apparaten, waarbij meerdere soorten van de menselijke cellen mede gekweekte zijn te simuleren een in vivo voorwaarde⁶; voor de studie van nematode beweging in microstructured omgevingen⁷; te onderzoeken van interacties tussen bacteriële biofilms (b.v., ⁸); en voor de inkapseling en manipulatie van kleine hoeveelheden cellen of chemische stoffen (bijvoorbeeld, ⁹). Microfluidic apparaten zijn ook steeds populairder geworden op het gebied van de microbiologie (voor uitstekende recensies, Zie ¹⁰ en ¹¹), vooral als hun fysieke en flow-eigenschappen zijn goed afgestemd op natuurlijke microbiële niches¹². Bijvoorbeeld, heeft microfluidics onlangs gewerkt door microbiologen voor dergelijke doeleinden als het nauwkeurig meten van cel groei en afdeling^13,14,15, analyseren pathogen verkeer¹⁶, monitoring quorum sensing¹⁷ en¹⁸van de fysiologische overgangen, en tellen voor eiwit¹⁹, onder vele andere voorbeelden. De methode die hier gepresenteerd is speciaal ontworpen voor de analyse van bacteriële eencellige lineages in plaats van combinaties van stammen of soorten. Het microfluidic apparaat hier gedemonstreerd maakt gebruik van een variant van de "moeder machine" design⁴, waarin de cellen één bestand worden gekweekt in een greppel van microfluidic met een gesloten uiteinde en een open einde; celgroei en deling duwt nakomelingen cellen en buiten het open uiteinde in de vloeistofstromen. Onze analyses meestal richten alleen op de "moeder"-cel die is beperkt aan het gesloten einde van de gracht. Wij beschouwen deze methode als een vooruitgang over vorige lichte microscopie gebaseerde eencellige analytische technieken, zoals de cel immobilisatie op agarose pads. Terwijl B. subtilis wordt gebruikt als een model, de methode is ook toepasbaar op andere bacteriesoorten (Escherichia coli is een ander gemeenschappelijk model; voor sommige soorten met verschillende cel maten of morphologies kan nodig de fabricage van nieuwe apparaten met verschillende afmetingen). Het gebruik van fluorescerend verslaggevers om te markeren van cellen en wijzigingen in genexpressie zichtbaar maken vereist het gebruik van genetisch hanteerbare vissoorten; analyses van celgroei en morfologie zijn echter mogelijk zelfs zonder fluorescente markeringen.

Dit protocol omvat niet het proces van het fabriceren van de meester van de silicon gebruikend fotolithografie, die uitgebreid beschreven elders is⁵; meesters kunnen ook gemakkelijk uitbestede van microfabrication faciliteiten. Het omvat de plinten van een apparaat PDMS van een versterkte silicon meester; verlijmen van het apparaat een stuk cover glas; het monteren van de microfluidic inlaat en uitlaat sanitair, kleppen inclusief snuifje zodat middellange schakelen; passiveren van het apparaat, het voorbereiden van bacteriële cellen, en het laden van de apparaat met bacteriële cellen; het sanitair aan het apparaat koppelen en zo de cellen; en het apparaat op een fluorescentie Microscoop voor afbeeldingen laden. Omdat vele verschillende Beeldacquisitie en verwerking software's kunnen worden gebruikt om te visualiseren en analyseren verschillende gegevens van belang^4,5, voorbeeldafbeeldingen worden weergegeven, maar Fotolader methoden niet in dit protocol opgenomen worden.

Protocol

1. PDMS apparaat gieten

1. In een stofvrije omgeving, meng PDMS polymeer en genezen agent op een 10:1-verhouding en ontgas onder drukvermindering voor minstens 10 min.
2. Plaats een silicium-model (of een epoxy of polyurethaan replica daarvan) op een stuk van ongebroken aluminiumfolie in een polystyreen plaat Petri. Giet het mengsel PDMS ontgaste de meester tot een diepte van ongeveer 5 mm. Degas de Petri-plaat voor ten minste 10 min. gebruik een zachte stroom van lucht te breken van de oppervlakte belletjes.
   Opmerking: De afmetingen van het twee-voudige apparaat gebruikt vindt u in de bijbehorende CAD file⁵ (Zie aanvullende bestand 1). Een plastic replica meester kan gedeeltelijk zweven tijdens ontgassing; Als dit gebeurt, duw de replica met een schone kunststof applicator.
3. PDMS genezen voor ten minste 1 uur in een oven op 60 ° C en afkoelen tot kamertemperatuur. Verwijder de aluminiumfolie met de master en gerookte PDMS van de Petri-plaat. Zorgvuldig afschilferen van de aluminiumfolie vanaf de achterkant van de meester, en vervolgens zorgvuldig schil de PDMS van de meester.
   Opmerking: U kunt ook PDMS kan worden genezen 's nachts bij kamertemperatuur. De relatieve kwetsbaarheid van een silicium-wafer-model kan worden overwonnen met behulp van epoxy lijm obligatie permanent het zegel op een 1/16-inch-dikke aluminium schijf van dezelfde grootte als de wafer.
4. Als een zegel bevat meestal verschillende microfluidic apparaten met verschillende afmetingen (Zie aanvullende bestand 1), snijd een enkel apparaat op maat met behulp van een schone, scherpe scalpel.
   Opmerking: Gebruik voor routine werk van B. subtilis , apparaten met 1.0 µm-bestrijkende cel loopgraven, die zijn gemarkeerd met een C of F in de bijbehorende CAD-bestand.

2. inrichting voor het ponsen en lijmen

1. Plaats een stukje doorzichtig office tape (Zie Tabel van materialen) over de patroon zijkant van het apparaat om de zichtbaarheid van de patroon functies. De inlaat en uitlaat poorten worden geïdentificeerd als cirkelvormige gebieden op tegenovergestelde uiteinden van de zichtbare fluidic kanalen (Figuur 1). Om hun zichtbaarheid verbeteren wanneer ponsen gaten in het apparaat voor de inlaat en uitlaat pinnen, markeren de inhammen en verkooppunten met stippen met behulp van een schone-tipped markering.
   Opmerking: Om ervoor te zorgen dat de inlaat en uitlaat pinnen niet overvol, elke andere kanaal is geperforeerd, beginnend met het kanaal net onder de alfabetische aanduiding voor het apparaat.
2. Flip het PDMS apparaat zodat de zijde van de patroon is, en het apparaat aan de gemarkeerde punten met behulp van een punch 0,75 mm biopsie; geperforeerd Gooi de punchings weg.
   Opmerking: De apparaten zijn gestanst met de patroon zijde naar beneden omdat het gat dat is gegenereerd door de biopsie punch is meestal iets laaide waar de punch betreedt het polymeer. Het apparaat in een omgekeerde richting ponsen zorgt ervoor dat het gat aan de patroon kant een scherpe rand heeft.
3. Met een stereomicroscoop, ervoor zorgen dat de geponste gaten met de gebieden van het inlaat en uitlaat van het apparaat overlappen. Gebruik een boete-tipped pincet te verwijderen elke vreemde fragmenten van PDMS van de geponste gaten.
4. Gebruik plakband om stof te verwijderen van beide zijden van het apparaat en de plaats in een schone polystyreen plaat Petri. Bereiden van een 22 mm x 40 mm cover glas door bevochtigen met 100% isopropylalcohol en wrijven met een doekje cleanroom; droog met een stroom van stofvrije lucht of stikstof.
5. Plaats de geponste PDMS apparaat functie zijde omhoog samen met de schoongemaakte glazen cover in een zuurstof-plasma reiniger.
   1. Plasma-traktatie het apparaat met de volgende instellingen: vacuüm, 70 mTorr; O₂ druk, 200 mTorr; duur, 15 s; macht, 30 W. onmiddellijk nadat de behandelingsperiode plasma heeft voltooid, verwijder het apparaat en de cover glas uit het plasma.
   2. Omkeren van het PDMS en plaats deze op het midden van het glas cover zodat de patroon kant contact op met het glas; Zorg ervoor dat de voeding kanalen (uitgevoerd tussen de inlaat en uitlaat gebieden) zijn afgestemd op de lengteas van het cover-glas. Druk naar beneden heel voorzichtig om ervoor te zorgen dat de PDMS zeehonden tegen het glas.
6. Bak het gemonteerde apparaat in een oven gedurende ten minste 1 uur bij 60 ° C. Na het bakken, moet u handmatig controleren of dat het PDMS is gebonden aan het glas door zachtjes te duwen op een hoek van het apparaat.
   Opmerking: Zodra het apparaat is verbonden, het moet worden gebruikt binnen de 24u, het polymeer zal naarmate steeds meer hydrofobe met toenemende tijd na plasma behandeling.

3. Microfluidic sanitair voorbereiding

1. Gesneden lengtes van polymeer buizen (binnendiameter (ID) 0,02 inch, buitendiameter (OD) 0.06 inch) naar de juiste lengte te bereiken vanaf de spuitpomp op de switch apparatuur (indien gebruikt) en het apparaat wanneer gemonteerd op de Microscoop. Snij zoveel lengtes als er microfluidic rijstroken.
2. Y kruispunten voor snuifje kleppen monteren (als u) door uitsnijden en bijvoegen van 2 cm lengtes van flexibel siliconen slangen (0.03 inch ID, 0.065 inch OD) naar de hoogste weerhaken van de 'J' en 1-cm lengtes van silicone buis aan de onderkant Berber van de 'Y'.
3. Knip 10-cm (of passende) lengtes van polymer buis; Sluit ze aan de ene kant naar de kruising van de schakelaar door het invoegen van hen in de 1-cm silicone slangen segmenten aan de onderkant Berber van de 'Y'. Sluit ze aan het andere einde 21G naalden die zijn verwijderd uit hun kunststof spuit adapters en gebogen ongeveer 90 ° ongeveer 9 mm vanaf het einde van de naald.
4. 21G botte naalden verbinden met één uiteinde van de buis-segmenten die door het invoegen van de naalden in de buis van de spuiten naar het apparaat schakelaar loopt. De andere uiteinden van elke lengte van de buis in de silicone slangen segmenten aan de weerhaken van de inlaat van de Y-kruispunten invoegen.
   Opmerking: Gebruik een soort apparaat te houden van de snuifje kleppen en kruispunten in plaats; Dit kan gemakkelijk worden gemaakt uit een micropipet tip doos (figuur 2D).
5. Gesneden lengtes van polymeer slang te voeren afvalstoffen uit de uitlaat van het apparaat naar een bekerglas van afval. Sluit ze aan het ene uiteinde aan gebogen 21G naalden bereid zoals hierboven beschreven. Tape van het andere uiteinde van de buizen in een bekerglas van afval.
6. Voorbereiding van de passende hoeveelheid media met 0,1 mg/mL bovien serumalbumine (BSA) en vul de gewenste grootte en het aantal spuiten. De BSA-geladen spuiten verbinden met de bereid 21G naalden gekoppeld aan de inlaat van de buis en belasting spuiten in injectiespuit pompen.
   Opmerking: voor typische experimenten 5 kanalen van het apparaat worden gebruikt, elk met een 20-mL spuit. Een experiment waarin het medium wordt overgeschakeld vergt 2 banken van elk 5 spuiten. Hier, de pomp met de eerste bank wordt aangeduid als de fase-1 pomp en de pomp met de tweede bank, met de post schakelaar medium, wordt aangeduid als de fase-2-pomp.
7. Zuiveren van lucht van de inlaat sanitair door het uitvoeren van de injectiespuit pompen aan een hoog stroomtarief (> 500 µL/min), begin door de injectiespuit pompen verticaal oriënteren en tik op de spuiten om luchtbellen naar de top. Zodra de lucht heeft zijn verwijderd uit de spuiten, plaats de spuitpomp horizontaal en geleidelijk tik of de lijnen van het polymeer van het spuiten van doorbladeren met het apparaat schakelaar te verjagen en verwijderen van luchtbellen. Herhaal dit proces voor de tweede bank van spuiten (als overschakelt media).
8. Nadat de luchtbellen zijn verwijderd, stelt de fase-2-spuitpomp (dat wil zeggen, met het medium dat gebruikt zal worden tweede, na de schakeloptie) naar 1,5 µL/min, dan onderbreken de stroom. Kleine bindmiddel clips op de segmenten van de flexibele slang op de tak van de Y-kruispunten overeenkomt met de tweede fase van de middelgrote plaatsen. Blijven lopen de fase-1-spuitpomp op een bescheiden debiet (bijv, 10 µL/min) voor minstens 30 min voor het zuiveren van het tweede medium van de inlaat buizen stroomafwaarts van de Y-kruising.

4. cel cultuur voorbereiding

1. 'S nachts, een preculture van de stam van belang in het gewenste medium aan de stationaire fase groeien. De bacteriële stam moet bevatten een mutatie die de cellen onbeweeglijk, maakt zodat de cellen niet uit de kanalen van het apparaat zwemmen doen.
   Opmerking: In dit protocol, de bacteriële stam is B. subtilis 3610 een hag_A233V vervangen (deze mutatie veroorzaakt het flagellum worden rechtstreeks in plaats van de beweeglijkheid van de spiraalvormige, voorkomen mobiele), met een P-_rsbV- mNeonGreen verslaggever voor cel stress, en een constitutief P_hyperspank- mNeptune (rood) verslaggever cellen markeren. LB Lennox voedingsbodem wordt gebruikt in het voorbeeld-protocol. Typische stammen voor microfluidics experimenten bevatten een of meer fluorescerende transcriptionele verslaggevers en een constitutively geproduceerd, cytoplasmatische fluorescent proteïne om geautomatiseerde detectie van cellen. Groei gebreken niet zijn nageleefd wanneer LB Lennox rijk medium werd gebruikt, maar B. subtilis groei in minimale media onder microfluidic omstandigheden kan worden geremd omdat uitgescheiden siderophores zijn weggewassen door de volumestroom medium. Onder dergelijke omstandigheden kan groei worden hersteld door de toevoeging van Natriumcitraat en ferrichloride aan het medium, zoals gemeld voor S7₅₀ middellange¹¹.
2. De ochtend van het experiment, Verdun de B. subtilis cellen 1:50 in een verbijsterd maatkolf van 250 mL met 25 mL groeimedium. Groeien de cellen gedurende 5-6 uur in cultuur schudden bij 37 ° C tot een optische dichtheid van meer dan 1.
   Opmerking: Een dichte celcultuur is beter omdat de stationaire fase B. subtilis zijn kleiner en minder vaak gevonden in cel cellen kettingen, vergemakkelijking van apparaat laden. Verschillende bacteriesoorten wellicht andere medium of groei omstandigheden voor optimale laden.
3. Met behulp van een injectiespuit voorzien van een 5-µm poriegrootte filter, filtreer ongeveer 15 mL celcultuur in een buis 15 mL conische verwijderen van B. subtilis cel ketens (het is niet nodig voor E. coli en wellicht niet nodig met andere soorten).
   Opmerking: Relatief weinig cellen moeten worden weggenomen; het filtraat moet troebel.
4. Centrifugeer de gefilterde cultuur gedurende 10 minuten bij 4000 x g bij kamertemperatuur. Giet af het supernatant en resuspendeer de pellet van de cel in de resterende bovenstaande vloeistof in de buis, ongeveer 500 µL van verse medium toe te voegen als nodig is om de celsuspensie pipetteren blijft.

5. apparaat laden

1. Voorzichtig plaats leeg dunne gel-laden micropipet (Zie Tabel van materialen) tips in de gaten van de uitgang van het apparaat microfluidic.
2. Met behulp van dunne gel-laden tips met een P200-micropipet, passivate het apparaat door het injecteren van medium met 1 mg/mL BSA in de inlaat gaten, observeren de tips in de outlet gaatjes vullen van de microfluidic kanalen (figuur 2A) controleren. Incubeer het apparaat bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 5 minuten.
   Opmerking: BSA wordt vaak gebruikt als een blokkeren of passivering agent die wordt gebonden aan de hydrofobe oppervlak van het PDMS polymeer, verhoging van de hydrophilicity en het verminderen van de afhankelijkheid van andere proteïnen of cellen (via de cel-oppervlakte molecules).
3. Met behulp van dunne gel-laden tips, belasting elk kanaal met de geresuspendeerde cellen (van sectie 4), met behulp van de tips in het outlet-kanaal om de voortgang van de cellen via het apparaat (figuur 2B).
   Opmerking: Laden wordt vergemakkelijkt door de P200-micropipet op het maximale 200-µL volume en vervolgens een kussen van lucht aspirating vóór het aspirating een kleine hoeveelheid (ongeveer een halve het volume van de dunne sectie van het uiteinde van de pipet) cellen. Het volume van de geresuspendeerde cellen hoeft niet te worden nauwkeurig, aangezien het volume van het PDMS apparaat klein is ten opzichte van dat van de micropipet. Wij kennen geen bovengrens aan de dichtheid van de geresuspendeerde cellen, zolang de celsuspensie kan worden pipetted in het apparaat. Cel bosjes het apparaat kunnen verstoppen en moeten worden vermeden door grondige pipetteren en/of vortex mengen.
4. De gel-laden tips uit de afvoer gaten, werken één filter tegelijk ter voorkoming van schade aan het apparaat voorzichtig te verwijderen.
5. Centrifugeer het apparaat in een bench-top microcentrifuge in een passende rotor adapter bij ongeveer 6.000 x g gedurende 10 minuten (figuur 2C).
   Opmerking: Een aangepaste-gefreesd aluminium rotor-adapter die is ontworpen om te passen in een microcentrifuge rotor (figuur 2C) werd gebruikt; verschillende centrifuge modellen kunnen worden gebruikt met passende rotor adapters. De belangrijke functie van de adapter is dat het laterale kracht in de richting van de gesloten uiteinden van de loopgraven van de cel, waardoor cellen gedwongen in de zijde-kanalen.
6. Verifiëren van de succesvolle laden onder de Microscoop (Figuur 3) maar zonder het aanbrengen van het apparaat naar de dia houder/fase invoegen.
   Opmerking: In dit protocol, een 60 X 1.4 Ph3 nb olie-immersie doelstelling wordt gebruikt voor zowel verificatie in dit stadium en voor latere imaging.

6. apparaat vergadering, evenwichtsinstelling en montage

1. Mount zorgvuldig het geladen apparaat op een etappe invoegen door taping van de cover glas aan beide zijden van het PDMS naar de onderkant van de etappe invoegen (d.w.z., het omkeren van de etappe invoegen voordat u het apparaat). Omkeren van de vergadering van de etappe invoegen-apparaat, zodat het PDMS boven ligt en plaats op een zachte ondergrond, zoals een stofvrije veeg (figuur 2D).
2. Aanpassen van het debiet van de spuitpomp van de fase-1 om 35 µL/min. werken met één rijstrook tegelijk, invoegen de inlaat naald, waarna de naald van de uitlaat (dat wil zeggen, waarop wordt uitgevoerd naar het afval bekerglas; Figuur 2E).
3. Veeg weg elk overtollige medium met een doekje schoon stofvrije en Inspecteer visueel of het apparaat op lekkage. Onderzoeken van de uitlaat slang voor de verschijning van overtollige cellen (meestal verschijnt als een troebel streep) en de middellange meniscus, die gaan langzaam richting het afval bekerglas.
4. Het apparaat draaien op 35 µL/min gedurende ongeveer 15-30 minuten, totdat alle aangesloten rijstroken zijn drainage in het bekerglas van afval laten maken.
5. De fase-1-spuitpomp ingesteld op 1,5 µL/min en de stroom te onderbreken. De hele pomp en apparaat apparaten brengen naar de Microscoop (dit proces wordt geholpen door het plaatsen van het allemaal op een glooiende kar) en herstarten van de fase-1 volumestroom medium op 1,5 µL/min. mount zorgvuldig de etappe invoegen met het apparaat op een omgekeerde fluorescentie Microscoop, met behulp van tape als dit nodig is voor het routeren van de inlaat en uitlaat buizen.
6. Ga naar de gewenste positie op het apparaat voor imaging en beginnen beeldvorming zoals gewenst. Merk op dat cellen meestal een paar uur (ongeveer 10 generaties vereisen) te bereiken van de stationaire fase-exponentiële groei, en het begin van Beeldacquisitie vertraging als oplopen kan gewenst zodat imaging na de periode van evenwichtsinstelling begint.
   Opmerking: De steady-state groei van cellen gehouden in exponentiële fase moet worden geverifieerd tijdens latere beeldanalyse door celdeling tijden bijhouden en ervoor te zorgen dat ze een constante minimale waarde hebben bereikt.

7. middelgrote schakelen

1. Tussen de opeenvolgende rondes voor imaging, onderbreken de stroom van de fase-1-spuitpomp. Zorgvuldig unclip het bindmiddel clips van de fase-2-silicone slangen, bewegende elk aan de silicone slang op de fase-1 tak van de Y-kruising. VN-pauze de stroom van de fase-2-spuitpomp (dat was ingesteld op 1,5 µL/min in stap 3.8) en blijven imaging.
   Opmerking: op 1,5 µm/min met een 10-cm lengte van het polymeer buizen stroomafwaarts van de Y-kruispunten, het medium van de tweede fase bereikt het apparaat in ongeveer 50 min. De tijd om het apparaat kan empirisch worden getest met behulp van de media die fluorescerende tracer deeltjes bevatten.

Resultaten

Succesvolle eerste cel laden, zoals beoordeeld door fase contrast microscopie voordat u het microfluidic sanitair aan het apparaat koppelt zou worden beschouwd aangezien alle of bijna alle van de microfluidic kant kanalen met een of meer bacteriële cellen ( Figuur 3A). Optimale laden meerdere cellen in elk kanaal zou weergeven, maar kanalen zal toch vullen met cellen als gevolg van de celgroei tijdens de periode van evenwichtsinstelling (...

Discussie

Dit protocol microfluidics is flexibel in dat vele van deze stappen kunnen worden gewijzigd voor het optimaliseren van het gebruik ervan met een bepaalde soort of stam of voor een bepaald doel. Inderdaad, in dit protocol hebben wij wijzigingen aan de oorspronkelijke "moeder machine" concept⁴ voor het optimaliseren van het gebruik ervan met B. subtilis. De loopgraven waarin de cellen worden beperkt vormen vaak een enkellaags functie, overwegende dat de in dit protocol gebruiken we twee-laa...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	(240)4019862	Dit wordt PDMS genoemd in het protocol. Er zijn 2 componenten die worden gemengd in een 10:1-verhouding
0.75-mm biopsie punch	World Precision Instruments	504529
22 x 40 mm Nr. 1.5 dekglaas	VWR	48393 172
Plasma Etch PE-50	Plasma Etch Inc.	PE-50	Instrument gebruikt om PDMS aan glas te hechten met behulp van zuurstofplasmabehandeling
Tygon flexibele slang ID 0,02", OD 0,06"	Saint-Gobain PPL Corp.	AAD04103	Voor het hoofddeel van de slang, b.v. bevestigd aan de naalden
Siliconen slang, 0,04" ID, 0,085" OD	HelixMark Standaard Siliconen Slang	60-795-05	Voor knijpventielen en Y-verbinding
Bos Serum Albumine	Sigma-Aldrich	A7906-100G	Gebruikt als passivatiemiddel
ART Gel Pipet Tips (P200)	Molecular BioProducts	2155	Voor het laden van het apparaat met medium en cellen
Acrodisc 32-mm spuitfilter met 5-μm Supor-membraan	Pall Life Sciences	4560	Voor het filteren van culturen vóór het laden van het apparaat
21-ga stompe naalden, 1"	McMaster-Carr	75165A681
Y-connector met 200-serie stekels, 1/16" ID slang, polypropyleen	Nordson Medical	Y210-6005	Het bedrijf is ook bekend als Value Plastics
Eclipse Ti-E omgekeerde microscoop	Nikon		Dit apparaat is door de fabrikant uit productie genomen en vervangen door de Ti 2 E.
LB Lennox	Sigma-Aldrich	L3022
Microfuge 18	Beckman Coulter	367160
Bacillus subtilis stam NCIB3610	Bacillus Genetic Stock Center	3A1	wild-type ouderlijke stam gemodificeerd voor gebruik in de experimenten die in dit protocol worden getoond
Zwaartekrachtconvectieoven	VWR	414005-106	voor het uitharden van PDMS en het bakken van geassembleerde apparaten
Scotch-Weld Epoxy Kit	3M	2216 B/A	kan worden gebruikt om een siliconen wafer aan een aluminium achterplaat te hechten
Scotch Magic tape, 3/4" breedte	3M		om stof van PDMS-apparaten te verwijderen en om over functies te plaatsen om de zichtbaarheid te verhogen (aangeduid als "kantoortape" of "kleefband" in protocol)
Stereomicroscoop	Nikon	SMZ800N	hier vermeld als voorbeeld; bijna elke stereomicroscoop is voldoende
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	W292907	Om het dekglaas schoon te maken
Spuitpomp, 6 kanalen	New Era Pump Systems Inc.	NE-1600
Kimwipes	Kimberly-Clark	34120	een merk van stofvrije doekjes