Hier presenteren we een protocol ter verhoging van de productie van de chimera zonder het gebruik van nieuwe apparatuur. Een verandering van de eenvoudige oriëntatie van het embryo voor injectie kan verhogen van het aantal embryo's geproduceerd, en potentieel het reduceren van de tijdlijn tot germline transmissie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Trans-inner Cell Mass injectie van embryonale stamcellen tot hogere Chimerism tarieven leidt
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
In een poging om het verhogen van de efficiëntie in het creëren van genetisch gemodificeerde muizen via ES cel methodologieën, presenteren wij een aanpassing van het huidige protocol van de injectie van de blastocyst. Wij rapporteren hier dat een eenvoudige rotatie van het embryo, en injectie via Trans-Inner cell mass (TICM) steeg het percentage chimeer muizen van 31% tot 50%, zonder extra apparatuur of verdere gespecialiseerde opleiding. 26 verschillende inteelt klonen, en 35 totaal klonen werden ingespoten over een periode van 9 maanden. Er was geen significant verschil in ofwel zwangerschap tarief of herstel van embryo's tussen traditionele injectie technieken en TICM. Dus, zonder elke belangrijke wijziging in het proces van injectie en een eenvoudige plaatsing van de blastocyst en injecteren via de ICM, het vrijgeven van de ES-cellen in de holte van de blastocoel kan potentieel verbeteren de hoeveelheid chimeer productie en daaropvolgende germline transmissie.
Inleiding
De oprichting van genetisch gerichte muizen is al bijna 25 jaar, een langzaam proces, vaak belemmerd door een knelpunt in het blastocysten ES cel microinjection stadium voor de generatie van germline Chimaera overbrengen. Recente ontwikkelingen, waaronder CRISPR/Cas91,2 in ES-cellen en high-throughput ES targeting generatie consortia zoals GECOMP cel, de generatie/beschikbaarheid van de genetisch gemodificeerde ES-cellen hebben verbeterd. De generatie van germline Chimaera blijft echter een knelpunt in het creëren van genetisch gemodificeerde muizen van deze ES cellen3,4. High-throughput ES cel generatie projecten hebben geteisterd door hoge variabiliteit in ES cel kwaliteit, die is van cruciaal belang voor succesvolle creatie van germline Chimaera. Bovendien zijn enkele van de algemeen gebruikte ES-cellijnen gekend voor hoge aneuploïdie en moeilijk productie van germline bevoegde Chimaera5.
Veel methoden zijn ontwikkeld om muizen te maken met ofwel een hogere hersenschim, of volledig ES cel afgeleid muizen6,7,8,9,10. Terwijl elk van deze systemen zijn eigen merites heeft, hebben ze ook hun tekortkomingen. De generatie van tetraploïde Chimaera, terwijl de muizen, het genereren van 100% ES cel afgeleid is inefficiënt en over het algemeen beperkt tot outbred lijnen 5,6. Nieuwere methoden voor het injecteren van de morula kunnen opleveren hoog percentage Chimaera, bijna 100%, maar over het algemeen vereisen aanzienlijke extra apparatuur (lasers of piezos) en opleiding10,11. In laboratoria waar deze technieken reeds op zijn plaats zijn, kan deze nieuwe methodologie niet nodig zijn.
Doel van deze studie was het vinden van een methode die gemeenschappelijke technieken en gemakkelijk verkrijgbare apparatuur wordt gebruikt om het tempo van de chimera generatie, verhogen de kans op germline transmissie van de mutant allel vast te stellen van de daaropvolgende muis kolonie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle bewerkingen werden gedaan als onderdeel van de normale werking van de faciliteit NIEHS Knock Out muis Core. Alle muizen werden gehouden op een 12:12 h licht: donker cyclus, en waren diervoeders een dieet van NIH-31 en water ad libitum. Alle experimenten werden uitgevoerd overeenkomstig het Animal Care en gebruik Comité van het National Institute of Environmental Health Sciences.
1. dierlijke voorbereiding
- Fokken van donor muizen, B6 (Cg)-Tyr < c-2J >/j vrouwelijke muizen op 8-10 weken oud natuurlijk aan B6 (Cg)-Tyr < c-2J >/j mannelijke muizen tussen 8 en 26 weken oud. Selectievakje pluggen visueel de volgende ochtend (E0.5).
- Ontvangende muizen, Zwitserse Webster vrouwelijke muizen tussen 6 en 9 weken oud natuurlijk met vasectomized Zwitserse Webster mannelijke muizen gefokt zijn fokken. Selectievakje pluggen visueel de volgende ochtend (E0.5).
2. ES cel voorbereiding
- Cultuur voor 129-derieved AB2.2 ES cellen, cellen in DMEM aangevuld met 15% FBS, 1% Glutamine, 1% Penn/strep en 0,1% β-mercaptoethanol. Alle andere ES-cellen per ES cel leverancier van instructies, met behulp van hun aanbevolen protocollen van de cultuur.
3. de embryo's worden verzameld
-
Dierlijke dissectie
- Bereiden van verschillende gerechten van 60 mm, ongeveer 1 per 5 muizen plus 3 extra, met 10 mL blast collectie media (BCM) (10% FBS IN DMEM), en een 4 goed schotel met 0,5 mL BCM per putje. Equilibreer bij 37 ° C, 5% CO2.
- Euthanaseren B6 (Cg)-Tyr < c-2J >/j vrouwelijke muizen op E3.5 CO2 verstikking, met een debiet van 10%.
- Na euthanizing, plaats van de muizen in de liggende positie en nat van de buik grondig met 70% ethanol.
- De eerste incisie via de huid slechts, op het middelpunt van de buik, waardoor de opening zo breed mogelijk maken. De volgende keer opent via de buikwand, opnieuw de incisie zo breed mogelijk te maken.
Opmerking: Dit te doen in twee stappen helpt verminderen of elimineren van verontreiniging van de vacht. - Basisgewicht van een eierstok, en houden van het vet pad van het vruchtbeginsel met een botte Tang, verwijder voorzichtig de eierstok, oviduct en baarmoeder, met extra zorg naar het vetweefsel tot een minimum te beperken. De baarmoeder als één enkele eenheid of als individuele hoorns, met geen verandering in de volgende procedure verwijderen.
- Na de verwijdering, de baarmoeder in een schotel van 60 mm met blast collectie media te plaatsen.
-
Verwijdering van de embryo
- Bereiden van een 10 mL spuit gevuld met BCM, en passen met een naald van 25 G.
- Een baarmoeder tegelijk, ze te verwijderen uit het bedrijf schotel van BCM, vlek hen op een weefsel te verwijderen overtollige bloed, en in een schotel van 60 mm onder een lage vergroting ontrafeling van Microscoop.
- Terwijl zorgvuldig en voorzichtig de baarmoeder net onder het distale einde (in de buurt van het oviduct) met het ontleden van pincet, plaats de naald in het midden van de baarmoeder in als parallel een vliegtuig mogelijk. Plaats de naald net voorbij de toppen van de verlostang.
- Sommige druk uitoefenen op de verlostang om te houden van de baarmoeder naar de naald en het verdrijven van ongeveer 1 mL van BCM via de Hoorn van de baarmoeder.
Opmerking: Wees voorzichtig bij deze stap, omdat teveel druk op de spuit zal leiden tot een oncontroleerbare stroom van media, vaak verlaten van de schotel. - Na het spoelen van de baarmoeder, maximaal 5 hele baarmoeders per schotel van 60 mm, zet de schotel terug in de incubator tot collectie.
-
Embryo's worden verzameld
- Met behulp van een hand getekende glazen pipet en een mond Pipetteer apparaat, verzamelen blastocysten onder een ontleden, set à 25 X 35 X. (Figuur 1).
Opmerking: Mond Pipetteer apparaat bestaat uit 30-40 cm van de flexibele slang, onder 5 mm ID invoegen een 1, 000 µL pipette uiteinde, wijs eerst één uiteinde, en brengt de glazen pipet in het. Een spuit-filter toevoegen aan de andere kant, met een bijgevoegde 1 cc injectieampul, geen zuiger, om te fungeren als een mondstuk. - Het verwijderen van gerechten uit de incubator, en met behulp van een rasterpatroon onderzoeken elk deel van de schotel voor embryo's. Embryo's worden geplukt individueel omhoog en plaats op de daling van de BCM in een secundaire schotel.
- Na het verzamelen van alle gerechten, wassen van de embryo's eens te meer in een druppel verse BCM en plaats dan in de 4 goed schotel af te wachten van de injectie.
- Met behulp van een hand getekende glazen pipet en een mond Pipetteer apparaat, verzamelen blastocysten onder een ontleden, set à 25 X 35 X. (Figuur 1).
4. embryo injectie
- Pick-up ES-cellen individueel met de naald van de injectie gebaseerd op bevestiging.
- Een injectie schotel te bereiden door toevoeging van 5-7 mL injectie media (DMEM, 10% FBS en 20 mM HEPES) naar een glazen bodem injectie schotel. Injecties worden uitgevoerd bij kamertemperatuur.
- Met lucht of olie microinjector, toepassen vacuüm op de injectie naald ES-cellen om in te trekken. Zorg zo weinig ruimte tussen cellen mogelijk te houden. De ES-cellen tellen hier, of bij de injectie-stap.
- Selecteer ES-cellen die middelgrote tot klein in omvang in vergelijking met de algemene bevolking van cellen, met een glad oppervlak en zonder klaarblijkelijke tekortkomingen zoals Vacuolen zijn.
Opmerking: ES cel populaties variëren sterk in morfologische kwaliteit en de gehanteerde zult moeten aanpassen met hen.
- Injecteren embryo's met ongeveer 15 ES-cellen (Figuur 1).
- Hechten van een bedrijf-pipet tip om een tweede microinjector van de lucht, en de positie van een embryo in de buurt van de opening van de houder. Vacuüm om het embryo aan de houder van de toepassing.
- Voor de z-as aanpassen door de pipet bedrijf omhoog of omlaag verplaatsen zodat het embryo is slechts het aanraken van de dia, gevolgd door fijn te focussen op de zona. Vervolgens past de Z-as van de injectie naald zodat ES cellen dicht bij de penpunt in focus zijn.
- Pas nu het embryo door zachtjes duwen van de injectie naald op de boven- of onderkant, draaien om de ICM in de gewenste positie.
- Plaats de injectie naald door de zona, en de ICM of de trofoblast, met behulp van een stevige, maar beheerste push. Een lichte druk uitoefenen op de microinjector van de naald van de injectie te houden van de blastocoel instort.
- Zodra de naald doorgedrongen de blastocoel tot is, druk van toepassing vanaf de microinjector ES-cellen overbrengen naar de blastocoel van het embryo. Pauze kort als de schuine kant van de naald begint om af te sluiten van het embryo, zodat de druk in het embryo terug te keren naar normaal, met behoud van de cellen.
Opmerking: Referentie groep ES cellen normaal waren geïnjecteerd, na een traditionele ES cel injectie protocol9, verzorgen niet te raken de ICM. ES-cellen werden ook geïnjecteerd door de ICM, duwen de naald direct via de ICM (TICM) (Figuur 2aanvullende film).
5. overdracht van eEmbryos
- Embryo's overbrengen in Zwitserse Webster muizen op E2.5, met behulp van een niet-chirurgische embryo transfer apparaat, per de vervaardiging's procedures. Deze niet-chirurgische procedure vereist geen verdoving of speciale postoperatieve zorg. Huis muizen individueel na de overdracht van embryo's, en door middel van levering en de daaropvolgende spenen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Behandeling van cel-lijn als de willekeurige effect, werd een lineair model van gemengde effecten gebruikt voor het analyseren van de gegevens in de software (bijvoorbeeld SAS (versie 9.2)). Elke analyse voor het aantal embryo's overgebracht en de cellijn gecontroleerd. De tweede analyse ook gecontroleerd voor het aantal pups dat overleefde.
Voor deze studie, elke ES cellijn en kloon was zowel met traditionele geïnjecteerd en TI...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het is lang gedacht dat verstoringen van de ICM zou kunnen tot sterfte, in feite leiden, huidige blastocyst microinjection protocollen nog waarschuwen voor dit12,13. Wat we hier hebben aangetoond is dat microinjection via de ICM is niet schadelijk is voor het embryo en verhoogt het rendement van chimaera.
Het exacte mechanisme voor dit effect niet geïdentificeerd. Echter moet de mechanische verstoring van de ICM, en de bijbehorende hyp...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen concurrerende belangen openbaar te maken.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd [deels] gesteund door de intramurale Research Program van het NIH, National Institute of Environmental Health Sciences. Speciale dank aan Shyamal Peddada voor statistische analyse. Wij willen ook Humphrey Yao, Gary Bird en Yuki Arao bedanken voor de herziening van dit manuscript, en Franco DeMayo voor zijn niet aflatende steun en advies.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| ES Cell injectienaald | Humagen | MSC-20-0 | |
| NSET apparaat | Paratechs | 60010 | |
| DMEM | Gibco (life technologies) | 11965-092 | |
| FBS | Gibco (life technologies) | 10439-024 | Lots moeten individueel worden getest op compatibiliteit met ES Cell. |
| HEPES | Sigma | H0887 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Micro manipulator | Leica | Micro manipulator | |
| micro injector | Eppendorf AG | Cell Tram Air 5176 | |
| Microscoop | Leica | DM IRB | |
| 4 well dish | Thermo Scientific | 176740 | |
| 60 mm dish | Sarstedt | 83.3901 | |
| B6(Cg)-Tyr<c-2J>/J | Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA | 000058 | |
| Swiss Webster muizen | Taconic, USA | Tac:SW | |
| Injectie Dish | MatTek Corp. | P50G-0-30-F |
Referenties
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6), 823-826 (2013).
- Friedel, R., Seisenberger, C., Kaloff, C., Wurst, W. EUCOMM the European Conditional Mouse Mutagenesis Program. Brief Funct Genomic Proteomic. 6 (3), 180-185 (2007).
- Austin, C. P., et al. The knockout mouse project. Nat Genet. 36 (9), 921-924 (2004).
- Coleman, J. L., Brennan, K., Ngo, T., Balaji, P., Graham, R. M., Smith, N. J. Rapid Knockout and Reporter Mouse Line Generation and Breeding Colony Establishment Using EUCOMM Conditional-Ready Embryonic Stem Cells: A Case Study. Front Endocrinol (Lausanne). 30, 105(2015).
- Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).
- Eggan, K., et al. Male and female mice derived from the same embryonic stem cell clone by tetraploid embryo complementation. Nat Biotechnol. 20 (5), 455-459 (2002).
- Eggan, K., et al. Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (11), 6209-6214 (2001).
- Eakin, G. S., Hadjantonakis, A. K., Papaioannou, V. E., Behringer, R. R. Developmental potential and behavior of tetraploid cells in the mouse embryo. Dev Biol. 288 (1), 150-159 (2005).
- Huang, J., et al. Efficient production of mice from embryonic stem cells injected into four- or eight-cell embryos by piezo micromanipulation. Stem Cells. 26 (7), 1883-1890 (2008).
- Poueymirou, W. T., et al. F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nat Biotechnol. 25 (1), 91-99 (2007).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Manipulating the Mouse embryo. , 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2014).
- Pease, S., Saunders, T. L. Advanced Protocols for Animal Transgenesis. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (2011).
- Young, M. K., et al. Effects of mechanical stimulation on the reprogramming of somatic cells into human-induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res Ther. 8 (1), 139(2017).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
