Methodenartikel

Een geïntegreerd Platform voor het toewijzen van de genoom-brede van chromatine Staten met behulp van High-throughput ChIP-sequencing in Tumor weefsels

DOI:

10.3791/56972

⸱

5 april 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Genomic Medicine, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2The Jackson Laboratory for Genomic Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een geoptimaliseerde high-throughput ChIP-sequencing protocol en computationele analyses pijpleiding voor de bepaling van genoom-brede chromatine staat patronen uit bevroren tumor weefsels en cellijnen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Histon modificaties vormen een belangrijk onderdeel van de epigenome en spelen een belangrijke regelgevende rol bij het bepalen van de transcriptionele status van geassocieerde loci. Daarnaast is de aanwezigheid van specifieke wijzigingen gebruikt om te bepalen van de positie en de identiteit niet-coderende functionele elementen zoals versterkers. In de afgelopen jaren, chromatine immunoprecipitation, gevolgd door sequentiebepaling van volgende generatie (ChIP-seq) uitgegroeid tot een krachtig hulpmiddel bij het bepalen van de genoom-brede profielen van individuele histone modificaties. Echter is het steeds duidelijker dat de combinatorische patronen van chromatine wijzigingen, hierna aangeduid als de chromatine-Staten, de identiteit en aard van de bijbehorende genomic locus bepalen geworden. Daarom, werkstromen bestaande uit robuuste high-throughput methodologieën voor profilering van een aantal Histon wijziging merken, evenals de computationele analyses pijpleidingen staat (HT) behandeling van myriaden ChIP-Seq profiling datasets, nodig zijn voor alomvattende bepaling van epigenomic Staten in groot aantal monsters. De HT-ChIP-Seq werkstroom gepresenteerde bestaat uit twee modules: 1) een experimenteel protocol voor profilering van de verschillende histone modificaties van kleine hoeveelheden tumor monsters en cellijnen in een 96-Wells-formaat; en 2) een computationele data analyse pijpleiding die combineert bestaande instrumenten om te berekenen zowel individueel merk bezetting en combinatorische chromatine staat patronen. Beide modules vergemakkelijken samen gemakkelijk verwerken van honderden ChIP-Seq monsters in een snelle en efficiënte manier. De werkstroom hier gepresenteerd wordt gebruikt voor het afleiden van chromatine staat patronen uit 6 Histon mark profielen in melanoom tumoren en cellijnen. Globaal, presenteren we een uitgebreide ChIP-seq workflow die kan worden toegepast op tientallen menselijke tumor monsters en cellijnen van de kanker te bepalen epigenomic afwijkingen in verschillende maligniteiten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het merendeel van de zoogdieren genoom (98-99%) bestaan uit noncoding opeenvolging, en deze nocoding gebieden bevatten regelgevende elementen bekend om deel te nemen bij het beheersen van genexpressie en1,2van de organisatie van de chromatine. In een normale cel is de specifieke vergadering van genomic DNA in gecomprimeerde chromatine structuur essentieel voor de ruimtelijke organisatie, de regelgeving en de precieze timing van de verschillende DNA-geassocieerde processen3,-4,5. In een kankercel maar kunnen chromatine wijzigingen door aberrant Epigenetische mechanismen leiden tot onjuiste organisatie van de structuur van de chromatine, met inbegrip van toegang tot de regelgevende elementen, chromosomale looping systemen en gen expressie patronen6, 7,8,9,10.

Ondanks de recente vooruitgang, hebben we beperkte begrip van epigenetische veranderingen die gekoppeld aan de progressie van de tumor of therapeutische respons zijn. De epigenome bestaat uit een matrix van wijzigingen, met inbegrip van Histon merken en methylation van DNA, die gezamenlijk een dynamische staat vormen (hierna: chromatine staat) die inbreuk op gen expressie netwerken en andere processen essentieel voor het behoud van maakt cellulaire identiteit. Onlangs, wijzigingen in de versterkers is aangetoond in meerdere maligniteiten door het bestuderen van H3K27Ac profielen11. Hoewel dergelijke studies inzicht geven in de correlatie van geïsoleerde epigenetische merken, meer dan 100 epigenetische aanpassingen geweest geïdentificeerde12,,13 zonder duidelijk begrip van hun biologische rol en onderlinge afhankelijkheid. Bovendien, er is een nog groter aantal mogelijke combinatorische patronen van deze histone en DNA wijzigingen, en het is deze combinatorische patronen - niet afzonderlijke wijzigingen - die epigenetische Staten14 dicteren. Vandaar, is er grote behoefte vast te stellen van wijzigingen in deze Staten chromatine tijdens de progressie van kanker of reacties op therapie. Grondige kennis van epigenome veranderingen in kanker heeft gedeeltelijk is achtergebleven als gevolg van technische (bv . generatie van grootschalige gegevens uit kleine hoeveelheid klinisch materiaal/enkele cellen) en analytische (bijvoorbeeld algoritmen te definiëren Combinatorische Staten) uitdagingen. Daarom is er dringend behoefte voor robuuste hoge gegevensdoorvoer methoden voor profilering groot aantal Histon wijziging merken uit klinisch materiaal en gemakkelijk te implementeren computationele benaderingen te voorspellen combinatorische patronen die zal vergemakkelijken bepaling van de epigenetische staten verschillende stadia van tumorvorming en therapeutische weerstand is gekoppeld. Verder gegevens beschikbaar van recente epigenome profiling studies15,16,17,18,19,20,21, 22,23 in normale weefsels en cellijnen kan worden geïntegreerd met de chromatine profielen van tumoren voor verdere inzichten in epigenome bijdrage aan tumor biologie.

Chromatine profilering is een krachtig hulpmiddel voor de identificatie van de globale bindende patronen van verschillende chromatine wijzigingen15,24geworden. In de afgelopen jaren is de ChIP-seq uitgegroeid tot de "gouden standaard" voor de studie van DNA-eiwit interactie op een wereldwijde schaal25,26,27. Voor elke ChIP-seq-experiment zijn er kritische stappen nodig zijn voor het succes, met inbegrip van de verwerking van het weefsel en scheiding, determing optimale ultrasoonapparaat voorwaarden, determing optimale antilichaam concentratie voor neerslag, bibliotheek voorbereiding, verwerking van de gegevens van de post sequencing en downstream-analyse. Elk van deze stappen bevatten belangrijke kwaliteitscontrole controleposten en wanneer samen genomen, zijn van cruciaal belang voor het correct identificeren van potentiële doelen voor functionele validering. Door middel van innovatie in deze stappen, hebben verschillende voorafgaande studies ontwikkeld methodologieën voor het uitvoeren van ChIP of ChIP-Seq van kleine hoeveelheid weefsels28,29,30,31,32 . Verder, hebben sommige studies voorgesteld protocollen voor high-throughput ChIP experimenten gevolgd door PCR gebaseerd kwantificatie33,34. Tot slot, sommige platformen publiekelijk beschikbaar analyse voor ChIP-Seq gegevens zijn nu beschikbaar, zoals Easeq,35 en36van de Galaxy. Echter, een geïntegreerd platform voor het uitvoeren van ChIP-Seq in een high-throughput mode in combinatie met een computationele pijpleiding voor het uitvoeren van interne mark evenals chromatin staat analyses heeft ontbroken.

Dit protocol beschrijft een complete en uitgebreide ChIP-seq workflow voor genoom-brede toewijzing van chromatine Staten in de weefsels van de tumor en cellijnen, met gemakkelijk te volgen richtsnoeren omvat alle van de stappen die nodig zijn voor een succesvolle experiment. Door het aannemen van een high-throughput methode beschreven door Blecher-Gonen et al. 37, dit protocol op tientallen monsters parallel kan worden uitgevoerd en is met succes toegepast op kanker cellijnen en menselijke tumoren zoals melanoom, dikke darm, prostaat en glioblastoma multiforme. We tonen de methodologie voor zes kern histone modificaties die belangrijke onderdelen van de epigenetische regelgevende landschap in menselijke melanoom cellijnen en tumor monsters vertegenwoordigen. Deze wijzigingen omvatten H3K27ac (enhancers), H3K4me1 (actief en klaar enhancers), H3K4me3 (initiatiefnemers), H3K79me2 (getranscribeerd regio's), H3K27me3 (polycomb onderdrukking), en H3K9me3 (hétérochromatique onderdrukking). Deze merken kunnen alleen of in combinatie worden gebruikt voor identificatie van functioneel verschillende chromatine staten vertegenwoordigt zowel de actieve als de repressieve domeinen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle klinische specimens werden verkregen volgens de richtlijnen van institutionele Review Board.

1. buffer voorbereiding

  1. Breng 200 mL TE buffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) pH 8,0).
  2. Breng 200 mL STE buffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA pH 8.0, 140 mM NaCl).
  3. Breng 200 mL 2.0 M glycine (37.52 g glycine in 200 mL water) en verwarm het tot 65 ° C.
  4. Breng 200 mL 5% natrium deoxycholate (DOC) oplossing (10 g DOC in 200 mL water).
  5. Breng 500 mL ChIP oogst buffer (12 mM Tris-Cl, 0.1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), 6 mM EDTA, 0,5% natrium dodecyl sulfaat (SDS)).
  6. Breng 500 mL ChIP verdunning buffer (10 mM Tris-Cl, 140 mM NaCl, 0,1% DOC, 1% Triton-X, 1 mM EDTA).
  7. Breng 500 mL buffer RIPA-wassen (STE, 1% Triton x-100, 0,1% SDS, 0,1% DOC).
  8. Breng 500 mL RIPA/500 was buffer (buffer RIPA + 360 mM NaCl).
  9. Breng 500 mL LiCL was buffer (TE, 250 mM LiCl, 0,5% NP-40, 0,5% DOC).
  10. Maken van 500 mL voor directe elutie buffer: 10 mM Tris-Cl pH 8.0, 5 mM EDTA, 300 mM NaCl, 0,5% SDS.
  11. Breng 50 mL antilichaam Binding/blokkeren buffer (PBS + 0,1% TWEEN-20 + 0,2% IgG-vrije BSA).

2. weefsel/cellen Line verwerking en dwarsbinding

  1. Als er weefsel is flash bevroren, dethaw het op ijs voorafgaand aan dissociatie.
  2. 50 mg van weefsel (~ 8 mg per Histon wijziging antilichaam) in 2 mL van Hanks evenwichtige zout oplossing (HBSS) met behulp van een steriele scheermesje handmatig verbreken. Blad voor het weefsel in 3 tot 4 mm stukken gedurende ongeveer 5 min. in een steriele weefselkweek schotel.
  3. Overdracht van het weefsel en HBSS oplossing in een buis van dissociator en voeg een andere 8 mL HBSS. Verder distantiëren het weefsel met behulp van een dissociator tot gehomogeniseerd.
  4. Voor melanoom tumoren, plaatst u de buizen in een dissociator en voeren de volgende cycli elk één keer in deze volgorde: h_tumor_01.01, h_tumor_02.01, h_tumor_03.01 en m_heart_02.01.
  5. Schraap 21 × 106 cellen in 10 mL medium (~ 3 × 10-6 per histone modificaties en input; het kan worden verlaagd naar 100.000 cellen per merk voor zeldzame populaties) gekweekt in een standaard weefselkweek schotel en verzamelen ze in een conische tube van 15 mL.
    Opmerking: De media die worden gebruikt voor representatieve melanoom cellijn WM115 is DMEM aangevuld met 10% foetale runderserum en 5% penicilline/streptomycine.
  6. Dwarslijn de weefsels/cellen met behulp van een 1% laatste formaldehyde-concentratie door het toevoegen van 200 µL van 16% formaldehyde per 3 mL HBBS voor weefsel (of 3 mL medium voor cellen). Schud het mengsel op 10 rpm met behulp van een mixer gedurende precies 10 minuten bij 37 ° C.
    Let op: Formaldehyde is giftig en moet op een passende zuurkast worden behandeld.
  7. Voeg 200 µL van 2,0 M glycine per 3 mL van het monster en blijven schudden bij 10 t/min voor een ander 5 minuten bij 37 ° C.
    Opmerking: Glycine fungeert als een quencher. Maak frisse glycine oplossing elke maand als de pH-pf die de oplossing heeft de neiging na verloop van tijd.
  8. Draaien van de monsters bij 934 x g gedurende 5 min bij 4 ° C met behulp van een benchtop centrifuge. De bovendrijvende vloeistof verwijderen, voeg 5 mL van ijs koud PBS, de monsters weer op 934 x g centrifugeren en verwijder het supernatant.
  9. Flash bevriezen de pellet en opslaan bij-80 ° C voor verdere verwerking.

3. de weefsels Lysis, ultrasoonapparaat en voorbereiding van het antilichaam

  1. Los 1 tablet van protease inhibitor van de omwenteling per 10 mL ChIP oogst buffer.
  2. Voeg 300 µL van ChIP oogst buffer met proteaseinhibitors per 50 mg van weefsel en laat van 30 min van lysis op ijs.
    Opmerking: Voeg 300 µL van ChIP oogst buffer met proteaseinhibitors per 1 X 10,7 van WM115 melanoom cellijnen.
  3. Terwijl de cellen zijn lysing, zet de de waterbaden disruptor en de bijbehorende koelsysteem en toestaan van temperatuur tot 4 ° C. Plaats de ultrasoonapparaat buizen in de waterbaden disruptor en bewerk ultrasone trillingen ten het melanoom weefsels voor 60 cycli bij 30 s op en 30 s weg te verkrijgen van de chromatine fragmenten van ~ 200-600 basenparen (bp).
    Opmerking: Ultrasoonapparaat tijd weefseltype kan verschillen en moet dienovereenkomstig worden aangepast. Dit is een cruciale stap en moet worden geoptimaliseerd in proefproject alvorens tot immunoprecipitation.
  4. Wassen tijdens ultrasoonapparaat, 20 µL van eiwit G magnetische kralen per antilichaam per monster driemaal met 1000 µL van bindende/blokkeren buffer (PBS + 0,1% TWEEN-20 + 0,2% BSA).
  5. Incubeer voor ~ 8 mg van melanoom weefsel, 3 µg voor elke Histon antilichaam in 100 µL van bindende / blokkeerbuffer gedurende 2 uur bij 4 ° C met rotatie met behulp van een buis revolver. 12 monsters voor een enkelvoud antilichaam bevatten 240 µL van parels, 36 µg van antilichaam en 1200 µL van bindende/blokkeren buffer.
    Opmerking: Voor 3 × 10-6 cellen, gebruikt u 5 µg voor elke antilichaam en 30 µL van eiwit G magnetische kralen per antilichaam. Antilichaam en eiwit-G kralen, moeten worden getitreerd als verschillende hoeveelheid weefsel wordt gebruikt. Dit protocol illustreert immunoprecipitation voorwaarden voor de beschreven zes histone modificaties (Tabel of Materials), echter antilichaam concentraties moeten worden geoptimaliseerd voor andere wijzigingen en transcriptiefactoren.
  6. Bepalen van de grootte van het fragment, het verwijderen van 20 µL van sonciated chromatine oplossing en het toevoegen van een buffer elutie master mix (kamertemperatuur) met 44 µL van directe elutie buffer, 1 µL van RNase (20mg/mL) en 5 µL proteïnase K (20mg/mL) per monster. Incubeer de monsters in een PCR thermische cycler gedurende ten minste 2 uur bij 50 ° C. Het zuiveren van het monster met behulp van een PCR zuivering kit volgens de instructies van de fabrikanten.
  7. Zorgen chromatine is voldoende schuingetrokken door het bepalen van fragment grootte met behulp van een hoge gevoeligheid DNA electropherogram instrument voordat u verdergaat met stap 3.6. Inschakelen van het instrument van de electropherogram.
  8. 2 µL van hoge gevoeligheid buffer reagens in ieder putje van een 8-well optische buis strip laden. Laden 2 µL van hoge gevoeligheid ladder in de eerst goed en 2 µL van gezuiverde monsters in de overige wells.
  9. Leg optische buis caps op buis stips en vortex de monsters bij 2000 rpm voor 1 min. Open het deksel en plaats een nieuwe tape van hoge gevoeligheid scherm en vak laden tips. Verwijder de strip caps en laden van de monsters in electropherogram instrument.
  10. Open analysesoftware, Markeer de eerste dertien ruimten op het scherm-tape en drukt u op het tabblad Start in de bodem juiste hoek. Fragmenten van de chromatine variërend tussen ~ 200-1000 bp zijn geschikt voor ChIP.
  11. Breng de sonicated oplossing over in steriele buizen en draai de buizen op 21,130 x g met behulp van een centrifuge tafelblad voor 15 min bij 4 ° C. Het supernatant overbrengen in nieuwe buizen.
  12. Bepalen van het totale volume van het supernatans dat 10% van de totale oplossing voor Input controle verwijderen en opslaan bij 4 ° C.

4. chromatine Immunoprecipitation

  1. Los 2 tabletten van protease inhibitor van de omwenteling per 20 mL ChIP verdunning buffer.
  2. Na ultrasoonapparaat verdund het resterende monster 5 keer met ChIP verdunning buffer om de niveaus van de SDS tot 0,1%. Verdun 270 µL van resterende supernatans met 1080 µL van ChIP verdunning buffer te verkrijgen van een totale eindvolume van 1350 µL.
  3. Wanneer de incubatie met antilichaam en eiwit G magnetische kralen is voltooid, plaatst u de buis op een magneet en de bovendrijvende vloeistof verwijderen.
  4. Met de buis nog steeds zittend op de magneet, wassen de kralen eenmaal door 750 µL van ChIP verdunning buffer met proteaseinhibitors toe te voegen.
    Opmerking: Het is belangrijk niet te verstoren de kralen of de buizen draaien tijdens deze stap.
  5. Verwijder ChIP verdunning buffer wassen en resuspendeer de kralen in 240 µL van de dezelfde ChIP verdunning buffer. Aliquot 20 µL van kralen in 12 afzonderlijke buizen, die elk voor een aparte weefsel monster wordt gebruikt.
  6. Aliquot het sonicated materiaal gelijkmatig aan eiwit G kralen met specifiek antilichaam en tuimelen met behulp van een buis revolver's nachts bij 4 ° C.

5. wassen en omgekeerde Crosslinking van Immunoprecipitated DNA-eiwitcomplexen

  1. De volgende ochtend na omgekeerde crosslinking, breng de oplossing van de antilichaam-eiwit over een 96-wells-plaat en plaats deze op de magnetische stand. Toestaan dat de kralen te houden voor ten minste 30 s en verwijder de bovendrijvende substantie.
  2. De kralen 5 keer met 150 µL van ijskoud de buffer RIPA wassen met behulp van een meerkanaals Pipetteer wassen. Tijdens de stappen wassen, doen niet Pipetteer de kralen, maar de magneet continu verplaatsen van rechts naar links voor 30 s per wasbeurt.
  3. Wassen van de monsters tweemaal met 150 µL van ijskoude RIPA-500 was buffer.
  4. Wassen van de monsters tweemaal met 150 µL van ijskoude LiCl was buffer.
  5. Wassen van de monsters eenmaal met 150 µL van ijskoud TE wassen buffer en buffer TE onmiddellijk te verwijderen. Deze stap kan worden weggelaten voor lage input toepassingen.
  6. Input besturingselement toevoegen vanaf stap 3.7 in verse putjes van de 96-wells-plaat met de ChIP DNA-monsters.
  7. Na het wassen stappen, een elutie buffer master mix (kamertemperatuur) met 44 µL van directe elutie buffer, 1 µL van RNase (20mg/mL) en 5 µL proteïnase K (20mg/mL) per ChIP en Input monster voor omgekeerde crosslinking toevoegen.
  8. Incubeer de monsters met behulp van een PCR thermische cycler gedurende 4 uur bij 37 ° C, 4 h bij 50 ° C en 8-16 uur bij 65 ° C.

6. de zuivering en kwantificering van geprecipiteerde DNA

  1. De volgende ochtend, plaats wordt de monsters op de magneet en de overdracht supernatant terug naar een nieuwe 96-Wells PCR plaat waarin de immunoprecipitated van DNA.
  2. 2.3 x paramagnetisch kralen aan de oplossing (115 µL voor 50 µL van oplossing) en zorgvuldig Pipetteer op en neer een meerkanaals Pipetteer met behulp van 25 keer toevoegen. De oplossing wordt homogene als goed gemengd.
  3. Incubeer de oplossing op kamertemperatuur uit de magneet voor 4 min. plaats de monsters terug op de magneet en Incubeer bij kamertemperatuur voor een andere 4 min. negeren het supernatant.
  4. Terwijl het verlaten van de monsters op de magneet, Voeg 150 µL van 70% ethanol (vol/vol) en Incubeer bij kamertemperatuur voor 30 s zonder verstoring van de kralen.
  5. Verwijder de ethanol en herhaal het wassen. Laat de paramagnetisch kralen in de lucht droog aan de magneet voor 5 min.
    Opmerking: Verwijder alle de ethanol na de tweede wash als resterende ethanol met zuivering interfereren zal.
  6. Verwijder de monsters uit de magneet en Voeg 30 µL van 10 mM Tris-Cl pH 8,0. Meng door 25 keer pipetteren en Incubeer de monsters bij kamertemperatuur uit de magneet voor 4 min.
  7. Leg de monsters terug op de magneet en Incubeer bij kamertemperatuur voor een andere 4 min. 20 Transfer µL van elk monster, tot een nieuwe 96-wells-plaat voor de voorbereiding van de bibliotheek. Bewaar de resterende 10 µL van ChIP DNA in geval van potentiële problemen met de generatie van de bibliotheken.
  8. In dit stadium, ChIP DNA te kwantificeren voor de bereiding van de bibliotheek. De DNA-concentratie wordt gemeten met ultragevoelige DNA reagentia. Bepaal de grootteverdeling van geprecipiteerde DNA met een hoge gevoeligheid DNA electropherogram instrument u verdergaat met stap 7.1.

7. bibliotheek generatie met behulp van de NEBNext Ultra II DNA Library voorbereiding Kit

  1. Genereren van bibliotheken voor NGS sequencing met behulp van DNA bibliotheek voorbereiding na het aanbevolen protocol van de fabrikant. Alle reacties worden uitgevoerd in 96-wells-platen en incubations worden uitgevoerd in een PCR thermische cycler met de deksel temperatuur set > 100 ° C en het volume ingesteld op 50 µL.
  2. Voor indexen, worden Multiplex Oligos voor NGS-platform gebruikt. Uitvoeren van een totaal van 10 x cycli voor PCR versterking met behulp van de volgende instellingen: eerste denaturatie bij 98 ° C gedurende 30 s, denaturatie bij 98 ° C gedurende 10 s, gloeien/extensie bij 65 ° C gedurende 30 s (10 x cycli), de laatste uitbreiding 65 ° C gedurende 5 minuten en houd bij 4° C.
    Opmerking: Tabel 1 bevat de inleidingen voor PCR versterking gebruikt.
  3. Na PCR versterking, verwijderen van de monsters en totale volume brengen 100 µL met behulp van de nuclease-gratis water. ' Double-sided paramagnetisch maat keuze (0.55x/0.8x) uitvoeren door eerste toevoegen 55 µL van kralen en meng door pipetteren 25 keer. Incubeer de monsters bij kamertemperatuur uit de magneet voor 4 min.
  4. Leg de monsters terug op een magneet en Incubeer bij kamertemperatuur voor een andere 4 min. Deze stap wordt gebruikt voor het behouden van grote glasscherven op de parels die ongeschikt zijn voor het rangschikken.
  5. Het supernatant overbrengen in een nieuwe 96-Wells PCR plaat. Niet weggeworpen als dit gedeeltelijk gezuiverde DNA bevat.
  6. Voeg een ander 25 µL van paramagnetisch kralen en meng door 25 keer pipetteren en Incubeer bij kamertemperatuur uit de magneet voor 4 min.
  7. Leg monsters terug op de magneet en Incubeer bij kamertemperatuur voor een andere 4 min en verwijder het supernatant. Deze stap wordt gebruikt voor het behouden van fragmenten van ~ 200 tot 600 bp die zal worden gebruikt voor gefinaliseerd bibliotheken.
  8. Terwijl het verlaten van de monsters op de magneet, Voeg 150 µL van 70% ethanol (v/v) en laat het broeden voor 30 s zonder verstoring van de kralen (Verplaats niet terwijl op de magneet). Verwijder de ethanol en herhaal het wassen een tweede keer.
  9. Laat dat de paramagnetisch kralen in de lucht droog aan de magneet voor 5 min. verwijderen alle ethanol na de tweede wash als resterende ethanol met zuivering interfereren zal.
  10. Verwijder de monsters uit de magneet en voeg 25 µL van 10 mM Tris-Cl pH 8,0. Meng door 25 keer pipetteren en Incubeer bij kamertemperatuur uit de magneet voor 4 min. plaats de monsters terug op de magneet en Incubeer bij kamertemperatuur voor een andere 4 min.
  11. Bibliotheken met een hoge gevoeligheid DNA electropherogram instrument voor multiplexing maten worden geschikt voor het rangschikken te kwantificeren. Voltooide bibliotheken variëren tussen 200-600 bp en zijn verstoken van alle inleidingsdimeer.
    Opmerking: Indien nodig, een ander 0.7 x paramagnetisch kraal zuivering wordt uitgevoerd om te verwijderen van ongewenste inleidingsdimeer die aanwezig zijn op ~ 130 bp.
  12. Zwembad de gekwantificeerde DNA gebaseerd op unieke index inleidingen volgens concentratie. Voor een zwembad met zes monsters met concentraties van 1 ng/µL en 6ng/µL, is de verdeling 15 µL van het laagste monster en 2.5 µL van het hoogste monster. Dit is bedoeld om lezen graven zal gelijkmatig worden verdeeld over elke rijstrook van de stroom-cel.

8. post verwerking van de gegevens van de ChIP-seq

  1. Een pijpleiding die is gebaseerd op de snakemake38,39 wordt gebruikt om proces van alle van de volgende stappen in één opdracht. Nog belangrijker is, worden elk van deze stappen afzonderlijk besproken met bijbehorende opdrachten.
  2. Bepalen van de kwaliteit van ruwe fastq sequencing leest met behulp van FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/): openen van unix-terminal en wisseling woninggids (cd) naar de map met de bestanden van de rauwe fastq voor elk van de zes histone modificaties. In unix-terminaltype, fastqc *fastq.gz en druk op [ENTER]. Statistieken van de kwaliteitscontrole wordt uitgevoerd op alle fastq bestanden in de map.
  3. Uitlijnen van kwaliteit leest aan het genoom van de verwijzing en duplicaten voordat compressie naar bam bestanden verwijderen. Dit wordt uitgevoerd met behulp van bowtie versie 1.1.239, SAMBLASTER versie 0.1.2140en SAMTOOLS versie 1.3.141: In de unix type terminal, bowtie -m 1 - n 1--beste--strata -S - q /path_to/hg19 histone1.fastq.gz | samblaster - removeDups | samtools bekijken -Sb - > histone1.bam en druk op [ENTER].
    Opmerking: path_to geeft de map met de vergadering van het menselijk genoom hg19. Dit zal veranderen afhankelijk van het organisme van belang.
  4. Bam bestanden SAMTOOLS met de volgende opdracht sorteren: samtools sorteert In het terminaltype unix, histone1.bam -m 2G-@ 5 -T histone1.temp -o histone1.sorted en druk op [ENTER].
  5. Index van de bestanden van de bam SAMTOOLS met de volgende opdracht: In het type van de unix-terminal, samtools index histone1.sorted.bam histone1.sorted.bam.bai en druk op [ENTER].
  6. Bepalen van uniek toegewezen en unaligned leest SAMTOOLS flagstat met de volgende opdracht: In unix terminaltype, samtools flagstat histone1.sorted.bam en druk op [ENTER].
  7. Normaliseren van bam-bestanden per Lees graven door het uitvoeren van steekproeven met de volgende opdracht: In het type van de unix-terminal, sambamba -f bam bekijken-subsampling-zaad 3 -s 0.X histone1.sorted.bam = | samtools sorteren -m 2G-@ 5 -T histone1.downsample.temp -o histone1.downsample.sorted.bam en druk op [ENTER].
  8. Index van de bestanden van de bam SAMTOOLS weer met de volgende opdracht: In het type van de unix-terminal, samtools index histone.downsample.sorted.bam histone.downsample.sorted.bam.bai en druk op [ENTER].
  9. Om te visualiseren van ChIP-seq bibliotheken op een genoom browser (dwz. UCSC of IGV), genereren kopstuk bestanden met behulp van deepTools versie 2.4.040 door schalen van de bam bestanden leest per kilobase per miljoen (RPKM). Dit kan worden uitgevoerd met behulp van de volgende opdrachten:
    1. Voor standaard kopstuk bestanden: In het terminaltype unix, bamCoverage -b histone1. Downsample.sorted.BAM--normalizeUsingRPKM--binSize 30--smoothLength 300--extendReads 200 -o histone1.bw en druk op {RETURN].
    2. Invoerfilter afgetrokken kopstuk bestanden: In het terminaltype unix, bamCompare--bamfile1 histone1.downsample.sorted.bam--bamfile2 input1.downsample.sorted.bam--normalizeUsingRPKM--verhouding aftrekken--binSize 30--smoothLength 300--extendReads 200 -o histone1.subtracted.BW en druk op [ENTER].
  10. Het identificeren van ChIP-seq signaal verrijking over 'Input' achtergrond met behulp van Model gebaseerde analyse van ChIP-seq (MACS) versie 1.4.225,26 en versie 2.1.0. Gebruik macs1 voor "puntbron" factoren, H3K4me3, H3K4me1 en H3K27ac en macs2 voor "brede bron" factoren, H3K79me2, H3K27me3 en H3K9me3. Dit wordt uitgevoerd met behulp van de volgende opdrachten:
    1. Voor puntbronnen: In de unix type terminal, macs14 -t histone1.downsample.sorted.bam - c input1.downsample.sorted.bam -g hs -f BAM -p 1e-5--nomodel--houden-dup alle - n histone1.file en druk op [ENTER].
    2. Voor brede Bron: In het terminaltype unix, macs2 callpeak -t histone1.downsample.sorted.bam - c input1.downsample.sorted.bam -g hs -f 6-BAM -p 1e--brede--breed-cutoff 1e-6--houden-dup alle--nomodel - n histone1.file en druk op [ENTER].
  11. Gebruik ChromHMM24 combinatorische chromatine staat patronen identificeren op basis van de wijzigingen van de Histon bestudeerd met behulp van de volgende opdrachten:
    1. In de unix-terminal Typ cd/path_to/ChromHMM_folder, en druk op [ENTER].
    2. Eenmaal in het type van de map ChromHMM, java-mx2G-jar ChromHMM.jar BinarizeBam -b 1000 hg19.txt/path_to/bam_directory /path_to/CellMarkFile.txt/path_to/BinarizeBam_output en druk op [ENTER].
    3. Type, java-mx2G-jar ChromHMM.jar LearnModel -b 1000/path_to/BinarizeBam/path_to/uitvoer_directory 15 hg19 en druk op [ENTER].

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol staat de immunoprecipitation van bevroren tumor weefsels en cellijnen die op tientallen monsters in parallel met een hoge gegevensdoorvoer methode (figuur 1A)kunnen worden uitgevoerd. Chromatine fragmenten moeten variëren tussen ~ 200-1000 bps voor optimale immunoprecipitation. We hebben gemerkt dat de tijd die nodig is om dezelfde schuintrekken lengte verschilt voor verschillende weefsel en celtypes. Het succes van ChIP van klei...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een complete en uitgebreide high-throughput ChIP-seq module voor genoom-brede toewijzing van chromatine Staten in menselijke tumor weefsels en cellijnen. In een ChIP-seq-protocol is een van de belangrijkste stappen antilichamenspecificiteit. Hier, illustreert deze methode immunoprecipitation voorwaarden voor de beschreven zes histone modificaties, die allemaal zijn ChIP-rang en eerder zijn gevalideerd in onze en andere laboratoria42,44

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Auteurs verklaren geen conflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken Marcus Coyle, Curtis Gumbs, SMF kern op MDACC voor sequencing ondersteuning. Het werk in dit artikel beschreven werd gesteund door subsidies van de NIH grant (CA016672) aan SMF Core en NCI awards (1K99CA160578 en R00CA160578) aan K. R.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
ChIP-grade H3K4me1 antibodyAbcamab8895
ChIP-grade H3K27ac antibodyAbcamab4729
ChIP-grade H3K4me3 antibodyAbcamab8580
ChIP-grade H3K79me2 antibodyAbcamab3594
ChIP-grade H3K27me3 antibodyAbcamab6002
ChIP-grade H3K9me3 antibodyAbcamab8898
1M Tris HCl, pH 8.0TeknovaT1080
EDTASigma-AldrichE9884
NaClSigma-AldrichS7653
GlycineSigma-AldrichG8898
Sodium deoxycholateSigma-Aldrich30970
DPBSSigma - Life SciencesD8537-500ML
SDSSigma-Aldrich74255
Triton-XSigma-AldrichX100-100ML
LiClSigma-Aldrich746460
NP-40Calbiochem492016-100ML
1% TWEEN-20Fisher BioreagentsBP337-500
BSA - IgG-freeSigma - Life SciencesA2058-5G
HBSSGibo14025092
GentleMACS C tubeGentleMACS120-008-466disassociation tube
16% FormaldehydePeierce28906
miniProtease inhibitor Roche Diagnostics11836153001protease inhibitor tablets
Dynabeads Protein G Invitrogen10009D
Bioruptor NGS tubes 0.65 mLDiagenodeC30010011sonication tubes
DynaMag - 96 Side SkirtedInvitrogen120.2796-well magnetic stand
TE bufferPromegaV6231
RNase AInvitrogen12091021
Proteinase KInvitrogen100005393
AMPure XP beadsBeckman CoulterA63882paramagnetic beads
EthanolSigma-AldrichE7023
Qubit ds DNA High Sensitivity Assay KitInvitrogenQ32854high sensitivity DNA reagents
NEBNext Ultra II DNA Library Prep KitNew England BioLabsE7645LDNA Library Prep Kit
Nuclease-free waterAmbionAM9932
High sensitivity D1000 ScreenTapeAgilent Technologies5067-5584high sensitivity DNA reagents
High sensitivity D1000 reagentsAgilent Technologies5067-5585high sensitivity DNA reagents
Multiplex Oligos (Index primers- Set 1)New England BioLabsE7335LMultiplex Oligos 
Multiplex Oligos (Index primers- Set 2)New England BioLabsE7500LMultiplex Oligos 
TapeStation 4200Agilent TechnologiesG2991AAhigh sensitivity DNA electropherogram instrument
Bioruptor Pico sonication device DiagenodeB01060001water bath disruputor
MixerNutator421105
Bio-Rad C1000 Touch Thermal CyclerBio-Rad1851196PCR Thermal cycler
Water BathFisher Scientific2322
Multichannel PipetDenville1003123
Tube RevolverThermo-Scientific88881001
96-Well Skirted PlateEppendorf47744-110
Allegra X-12R Centrifuge Beckman CoulterA99464benchtop centrifuge
Centrifuge 5424Eppendorf22620461tabletop centrifuge
Optical tube strips (8x Strip)Agilent Technologies401428
Optical tube strip caps (8x strip)Agilent Technologies401425
Loading Tips, 10 PkAgilent Technologies5067-5599
IKA MS3 vortexIKA3617000vortex

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rao, S. S., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  2. Hnisz, D., Day, D. S., Young, R. A. Insulated Neighborhoods: Structural and Functional Units of Mammalian Gene Control. Cell. 167 (5), 1188-1200 (2016).
  3. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
  4. Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. The long-range interaction landscape of gene promoters. Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).
  5. Wang, X., et al. SMARCB1-mediated SWI/SNF complex function is essential for enhancer regulation. Nat Genet. 49 (2), 289-295 (2017).
  6. Hnisz, D., et al. Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods. Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).
  7. Jäger, R., et al. Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci. Nat Commun. 6, 6178(2015).
  8. Krijger, P. H., de Laat, W. Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (12), 771-782 (2016).
  9. Mansour, M. R., et al. Oncogene regulation. An oncogenic super-enhancer formed through somatic mutation of a noncoding intergenic element. Science. 346 (6215), 1373-1377 (2014).
  10. Weischenfeldt, J., et al. Pan-cancer analysis of somatic copy-number alterations implicates IRS4 and IGF2 in enhancer hijacking. Nat Genet. 49 (1), 65-74 (2017).
  11. Herz, H. M., Hu, D., Shilatifard, A. Enhancer malfunction in cancer. Mol Cell. 53 (6), 859-866 (2014).
  12. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
  13. Tan, M., et al. Identification of 67 histone marks and histone lysine crotonylation as a new type of histone modification. Cell. 146 (6), 1016-1028 (2011).
  14. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
  15. Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
  16. Consortium, E. P., et al. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  17. Rivera, C. M., Ren, B. Mapping human epigenomes. Cell. 155 (1), 39-55 (2013).
  18. Stergachis, A. B., et al. Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes. Cell. 154 (4), 888-903 (2013).
  19. Xie, W., et al. Epigenomic analysis of multilineage differentiation of human embryonic stem cells. Cell. 153 (5), 1134-1148 (2013).
  20. Chen, L., et al. Transcriptional diversity during lineage commitment of human blood progenitors. Science. 345 (6204), 1251033(2014).
  21. Saeed, S., et al. Epigenetic programming of monocyte-to-macrophage differentiation and trained innate immunity. Science. 345 (6204), 1251086(2014).
  22. Bernstein, B. E., et al. The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium. Nat Biotechnol. 28 (10), 1045-1048 (2010).
  23. Roadmap Epigenomics, C., et al. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  24. Ernst, J., Kellis, M. ChromHMM: automating chromatin-state discovery and characterization. Nat Methods. 9 (3), 215-216 (2012).
  25. Feng, J., Liu, T., Qin, B., Zhang, Y., Liu, X. S. Identifying ChIP-seq enrichment using MACS. Nat Protoc. 7 (9), 1728-1740 (2012).
  26. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137(2008).
  27. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  28. O'Neill, L. P., VerMilyea, M. D., Turner, B. M. Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations. Nat Genet. 38 (7), 835-841 (2006).
  29. Dahl, J. A., Collas, P. Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells. Stem Cells. 25 (4), 1037-1046 (2007).
  30. Zhang, B., et al. Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development. Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).
  31. Dahl, J. A., et al. Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition. Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).
  32. Shen, J., et al. H3K4me3 epigenomic landscape derived from ChIP-Seq of 1,000 mouse early embryonic cells. Cell Res. 25 (1), 143-147 (2015).
  33. Flanagin, S., Nelson, J. D., Castner, D. G., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Microplate-based chromatin immunoprecipitation method, Matrix ChIP: a platform to study signaling of complex genomic events. Nucleic Acids Res. 36 (3), e17(2008).
  34. Nelson, J. D., Denisenko, O., Sova, P., Bomsztyk, K. Fast chromatin immunoprecipitation assay. Nucleic Acids Res. 34 (1), e2(2006).
  35. Lerdrup, M., Johansen, J. V., Agrawal-Singh, S., Hansen, K. An interactive environment for agile analysis and visualization of ChIP-sequencing data. Nat Struct Mol Biol. 23 (4), 349-357 (2016).
  36. Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Res. 44 (W1), W3-W10 (2016).
  37. Blecher-Gonen, R., et al. High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states. Nat Protoc. 8 (3), 539-554 (2013).
  38. Tang, M. pyflow-ChIPseq: a snakemake based ChIP-seq pipeline. Zenodo. , (2017).
  39. Koster, J., Rahmann, S. Snakemake--a scalable bioinformatics workflow engine. Bioinformatics. 28 (19), 2520-2522 (2012).
  40. Ramirez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. 44 (W1), W160-W165 (2016).
  41. Bailey, T., et al. Practical guidelines for the comprehensive analysis of ChIP-seq data. PLoS Comput Biol. 9 (11), e1003326(2013).
  42. Fiziev, P., et al. Systematic Epigenomic Analysis Reveals Chromatin States Associated with Melanoma Progression. Cell Rep. 19 (4), 875-889 (2017).
  43. Liu, T., et al. Broad chromosomal domains of histone modification patterns in C. elegans. Genome Res. 21 (2), 227-236 (2011).
  44. Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
  45. Rai, K., et al. Dual Roles of RNF2 in Melanoma Progression. Cancer Discov. , (2015).
  46. Cotney, J. L., Noonan, J. P. Chromatin immunoprecipitation with fixed animal tissues and preparation for high-throughput sequencing. Cold Spring Harb Protoc. (2), 191-199 (2015).
  47. Cejas, P., et al. Chromatin immunoprecipitation from fixed clinical tissues reveals tumor-specific enhancer profiles. Nat Med. 22 (6), 685-691 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Histonmodificatieshigh throughput ChIP seqtumorweefselanalysechromatine immunoprecipitatiecomputationele data analyseChromHMM analysenext generation sequencingepigenomische profilering

Gerelateerde artikelen