Imaging retinale weefsel kan informeren eencellige die niet kunnen worden verzameld van traditionele biochemische methoden. Dit protocol beschrijft voorbereiding van retinale segmenten van zebravis confocal imaging. Fluorescerende genetisch gecodeerd sensoren of indicator kleurstoffen toestaan visualisatie van tal van biologische processen in verschillende retinale celtypes.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Voorbereiding verse retinale segmenten van volwassen Zebrafish voor Ex Vivo Imaging experimenten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het netvlies is een complex weefsel dat initieert en integreert de eerste stappen van de visie. Dysfunctie van netvlies cellen is een kenmerk van veel verblindende ziekten en toekomstige therapieën afhangen van fundamentele inzichten over hoe verschillende retinal cellen normaal functioneren. Verkrijgen van dergelijke informatie met de biochemische methoden heeft bewezen moeilijk, omdat de bijdragen van bepaalde celtypen in de retinale cel milieu zijn afgenomen. Live retinale imaging kan bieden een uitzicht op tal van biologische processen op een subcellular niveau, dankzij een groeiend aantal genetisch gecodeerde fluorescerende biosensoren. Deze techniek heeft tot nu toe is echter beperkt tot de kikkervisjes en larven van de zebravis, de buitenste retinale lagen van geïsoleerde netvlies, of lagere resolutie beeldvorming van het netvlies in levende dieren. Hier presenteren we een methode voor het genereren van levende ex vivo retinale segmenten van volwassen zebrafish voor levende imaging via confocale microscopie. Deze voorbereiding levert dwarse segmenten met alle retinale lagen en meeste celtypes zichtbaar zijn voor het uitvoeren van de confocal imaging experimenten met behulp van perfusie. Transgene zebrafish waarin fluorescente proteïnen of biosensoren in specifieke retinale celtypes of organellen zijn eencellige om informatie te extraheren uit een intact netvlies gebruikt. Bovendien kunnen retinale segmenten worden geladen met fluorescerende indicator kleurstoffen, toe te voegen aan veelzijdigheid van de methode. Dit protocol werd ontwikkeld voor imaging Ca2 + binnen zebrafish kegel researchdieren, maar met goede markers kan worden aangepast voor het meten van Ca2 + of metabolieten in Müller cellen, bipolaire en horizontale cellen, microglia, amacrine cellen of retinale ganglion cellen. De retinale pigment epitheel is verwijderd uit segmenten, dus deze methode niet geschikt is voor de studie van dat celtype. Met praktijk is het mogelijk voor het genereren van seriële segmenten van het ene dier voor meerdere experimenten. Deze flexibele techniek biedt een krachtig hulpmiddel voor het beantwoorden van vele vragen over retinale celbiologie, Ca2 +en energie homeostase.
Inleiding
De zebravissen (Danio rerio) is geworden wijd gebruikt in medische en fundamenteel wetenschappelijk onderzoek1, wegens zijn kleine grootte, snelle ontwikkeling en gewervelde orgaansystemen. De natuurlijke transparantie van zebravis larven gecombineerd met gevestigde methodes voor Transgenese hebt ingeschakeld gedetailleerde visualisatie van cellulaire processen in een levend dier. Een aantal genetisch gecodeerde fluorescerende biosensoren zijn doelwit geweest naar specifieke zebrafish cellen om Ca2 + 2, waterstofperoxide3, apoptotic Activering4 en ATP5te detecteren.
In vivo imaging van zebravis larven heeft geleid tot de doorbraken op het gebied van de neurowetenschappen, met inbegrip van de toewijzing van hersenen circuits6 en Geneesmiddelenontwikkeling voor centrale zenuwstelsel aandoeningen7. Zebravis zijn geschikt voor onderzoek van de visie, omdat hun netvlies functie de laminaire structuur en neuron soorten hogere gewervelde dieren, en zij tonen robuuste visuele gedrag8,9. Verschillende soorten retinale degenerations analoog aan ziekten bij de mens zijn gemodelleerd met succes en studeerde in zebrafish10,11, met inbegrip van levende beeldvorming van individuele researchdieren ontaardt in een netvlies2, 12.
Terwijl in vivo larvale zebrafish imaging een waardevol instrument is, wordt het meer uitdagend als vissen groeien en ontwikkelen van pigmentatie, en sommige farmacologische behandelingen niet kunnen in een hele dier doordringen. Verder, bepaalde cellulaire processen wijzigen met ontwikkeling en leeftijd, waardoor van latere tijd punten kritiek voor begrip functie en de progressie van de ziekte bij volwassen dieren. Biochemische methoden zoals immunoblot, quantitiative PCR, O2 consumptie en metabolomic analyses kunnen belangrijke aanwijzingen over de biologie van het netvlies als geheel, maar het is moeilijk te onderscheiden van de bijdragen van individuele celtypes beïnvloed door ziekte. Geïsoleerde retinale weefsel ex vivo Imaging omzeilt deze kwesties, en terwijl imaging plat gemonteerd netvlies biedt een uitzicht over de buitenste netvlies13, diepere innerlijke retinale functies zijn verduisterd. Transversale retinal segmenten, zoals vaste immunohistochemische analyses, die worden beschreven in een duidelijk beeld van alle lagen en celtypes inschakelen maar slechts een enkele momentopname van de dynamische processen die betrokken zijn bij normale functie en ziekte bieden.
Hier presenteren we een methode voor het genereren van ex vivo dwarse retinale segmenten van volwassen zebrafish voor imaging. Het is vergelijkbaar met methoden voor amfibieën en zebrafish retinale segmenten voorbereiden elektrofysiologische en morfologische studies14,15, met belangrijke wijzigingen voor time-lapse imaging ex vivo met behulp van de confocal microscopie. Fluorescentie reacties van biosensoren of kleurstoffen in plakjes worden gecontroleerd in real-time met een confocal microscoop terwijl het leveren van farmacologische agenten met perfusie. Terwijl de methode werd ontwikkeld voor imaging-researchdieren, is het mogelijk dat het haalbaar is om het te gebruiken voor het visualiseren van Müller cellen, bipolaire cellen, horizontale cellen, amacrine cellen of retinale peesknoopcellen met passende fluorescente markeringen. Bovendien kunnen segmenten worden geladen met fluorescente cel-permeabele kleurstoffen aan de levensvatbaarheid van de cellen van het verslag, vesiculaire vervoer, mitochondriale functie of redox staat. Deze veelzijdige voorbereiding kunt visualisatie van een breed scala aan subcellular processen in het netvlies, met inbegrip van Ca2 + dynamiek, signaaltransductie en metabole staat.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierproeven zijn goedgekeurd door de Universiteit van Washington institutionele Animal Care en gebruik Comité.
1. voorbereiding van de dieren en materiaal
Opmerking: De retinale pigment epitheel (RPE) is een donkere vel van weefsel rondom de buitenkant van het netvlies waarvan pigmentatie kan verhullen retinale functies en schade aan het weefsel wanneer confocal ex vivoimaging. In duisternis, wordt de RPE van zebravis teruggetrokken uit de buurt van het netvlies; donker passen vis aan toekomstige opheffing vergemakkelijkt van de RPE uit het netvlies voor snijden en beeldvorming.
- Vis overbrengen in een paai tank gevuld met vis water, en vervolgens wikkel de paaitijd tank met donkere stof of plaats het in een donkere kast.
- Donker passen zebrafish gedurende ten minste 1 uur voorafgaand aan de euthanasie toe in de buurt van volledige scheiding van de RPE van het netvlies. 30 min donker-aanpassing is voldoende voor het verwijderen van de meeste RPE, al stukken van het tussenliggende tussen researchdieren kunnen blijven.
- Smelten ~ 15 mL petroleum jelly in een bekerglas van 50 mL op een hete plaat en teken vervolgens 3 mL van de vloeistof in een 3-mL slip tip spuit. Injectiespuit omkeren, plaats in een reageerbuis rack, en laat de vaseline afkoelen.
- Het maken van een herbruikbare snijden kamer op een microscoopglaasje gewoon 7 X 2,5 cm.
- Met behulp van duidelijke nagellak, verf dunne lijnen maken een rechthoek 3 X 2.5 cm in het midden van de dia, laat het drogen, en voegt een andere laag van nagellak naar de regels.
- Imaging ladders op cover slips te houden segmenten tijdens imaging voor te bereiden. De segmenten zullen vormen de "Sporten" van de ladder.
- Bij statische imaging of injectie experimenten met minimale oplossing stroom, vaseline ladders die bestaat uit twee brede vlakke evenwijdige stroken van vaseline op 18 mm vierkante glazen cover slips te maken. Gebruik de spuit om te passen twee afgevlakt ~ 1 cm lange uitstrijkjes van gekoelde vaseline 0.5 cm uit elkaar op de cover slip.
- Klaar de slicer weefsel.
- Een double edge scheermesje met ethanol schoon en laat ze in de lucht droog. Snijd het in kwartalen met een schaar, eerst in de lengte in twee helften dan opzij elke blade.
- Plaats de segmenteringshulplijnen kamer in het werkgebied voor de slicer weefsel, het horizontaal centreren in het werkgebied en Markeer een lange zijde met permanente marker voor uitlijning.
- Laden van een mes-sectie op de arm van de slicer weefsel, zorgen dat het mes ligt plat en gecentreerd op de dia zonder te raken de nagellak, dan draai zachtjes de blade-apparatuur. Lager de blade arm door het aanpassen van de knop ¼ zet, dan plaats een kladje filtreerpapier in het midden van de beeldvorming kamer en test knippen. Als het papier niet volledig doorsnijden is, remount het mes.
- Met behulp van de spuit, plaatst u een enkele kleine stip van gekoelde vaseline in een petrischaal 10-cm ~ 1,5 cm aan de rechterkant van het centrum. Druk op een imaging ladder in het pincet met de vaseline naar boven. Een andere kleine vaseline dot maken ~ 1 cm vanaf de rand van de inlaat van de beeldvorming kamer.
- Passen de vaseline injectiespuit met een naald van 20g en open het. Houd de naald op de spuit en gebruiken voor het maken van twee lange dunne parallel reepjes van 1 cm van vaseline in de lengte in het midden van de segmenteringshulplijnen kamer. Ruimte van de strips ~ 1 cm uit elkaar.
- Maken van een herbruikbare draad gereedschap voor de lus van de ogen door inwikkeling van het midden van een ~ 4 cm segment van 30 g wolfraam draad rond een paar pincet eenmaal goed gesloten. Aanpassen van de diameter van de lus door de draad boven of beneden de Tang glijden totdat het is meestal iets groter dan een zebravis oog, ~ 2-3 mm. Draai de draaduiteinden en hen veilig aan het einde van een 6-cm houten stok met behulp van laboratorium tape.
- Ringer's oplossing voor te bereiden.
- Ontdooi 50 X supplement stockoplossing (tabel 1) en voeg het vers HEPES-gebufferd, niet-bicarbonaat Ringer's oplossing (tabel 2) de ochtend van het experiment; Verdun 200 µL van de stockoplossing aanvulling in elke 10 mL Ringer's oplossing in een conische centrifugebuis of steriele glazen fles. Statische imaging experimenten, opstellen van ten minste 30 mL Ringer's oplossing per experiment. Het volume van Ringer's oplossing nodig voor perfusie experimenten zal afhangen van de stroomsnelheid en totale experiment tijd.
- Selectievakje dat de pH van de oplossing aangevuld is 7.4 met behulp van een digitale pH sonde of pH-papier, en pas dienovereenkomstig met verdund NaOH of HCl.
- Aangevuld Ringer's solution op ijs zuurstof door borrelen met 100% zuurstof gas voor ten minste 5 min. met behulp van een standaard medische zuurstoftank en regelgever voorzien van een slang, of de optionele gas waskolf variëteit gebruikt voor perfusie. Opslaan van zuurstofrijk Ringer's oplossing op ijs in een verzegelde conische centrifugebuis of steriele glazen fles in de buurt van de dissectie Microscoop; Gebruik deze oplossing voor dissectie, imaging, en om te verdunnen kleurstoffen of farmacologische agenten.
- Als andere oplossingen worden gebruikt in het experiment, zoals nb+-vrije Ringer's oplossing (tabel 3), herhaalt u stappen 1.9.1.-1.9.3.
- Verzamel petrischalen, pincet, micro-schaar en andere hulpprogramma's in de buurt van de dissectie-Microscoop, en een vis water ijsbad voorbereiden zebrafish euthanasie.
2. voorbereiding van de retinale segmenten (Zie Figuur 1)
- Werken onder rode omgevingslicht om te minimaliseren van licht aanpassing (waardoor de stick RPE meer strak aan het netvlies), euthanaseren zebrafish door onderdompeling in het ijsbad totdat drukpunt is verloren, meestal 1-2 min. de vis overbrengen in een petrischaal en een scalpel te gebruiken cervically ontreddering, maar de vissen niet te onthoofden.
- De draad lus los bindweefsel rond één oog te gebruiken, en dan trekken het oog naar voren voorzichtig met de lus in de ene hand. Met behulp van de micro-schaar in de andere hand, snijd de witte oogzenuw onder het oog, verzorgen niet te knippen van de achterkant van het oog.
- Overdracht van het oog met behulp van de verlostang om een petrischaal van koude Ringer's oplossing op ijs en herhaal dit voor het tweede oog. Houd de ogen in het duister of onder rood licht totdat de RPE wordt verwijderd uit het netvlies.
- Het ontleden van de oculairrubbers onder een Microscoop energiebesparende dissectie in een daling van koude Ringer's oplossing op een vlakte glasplaatje in een petrischaal.
- Het hoornvlies te doorboren met een fijne Tang en deze vervolgens verwijdert voorzichtig stukken van duidelijke, broos hoornvlies en zilverkleurige sclera met Tang of schaar. Verwijderen en verwijderen van de lens en de meeste van de sclera (Zie figuur 1A), en omgaan met de geïsoleerde oogschelp minimaal.
- Stukken vet, kleine stukjes van sclera en zwarte RPE kunnen blijven verbonden met de oogschelp en later verwijderd uit het netvlies. Als het netvlies van de RPE in stap 2.4.1 scheidt, gaat u verder met de zelfde stappen met behulp van extra voorzichtig niet te beschadigen van de gevoelige geïsoleerde netvlies.
- Plaats de open zijde van de oogschelp naar beneden (RPE omhoog) op de dia, en snijd in derde of kwartalen met een scheermesje vers één rand in één beweging (Zie figuur 1B). Gooi de stukjes weefsel die zijn zeer gebogen.
- Platte mount netvlies op filterpapier.
- Een stuk filtreerpapier met Ringer's solution NAT en plaats deze op de dia naast de oogschelp stukken. Gebruik platte pincet bij de behandeling van het intact natte koffiefilter te voorkomen het prikken. Voeg koude Ringer's oplossing ter dekking van zowel het filtreerpapier en weefsel.
- Sleep met pincet in elke hand, zorgvuldig het koffiefilter onder elk oogschelp stuk met de RPE en researchdieren naar boven, dat wil zeggen met de achterkant van het oog naar boven. Plaats de oogschelp stukken in een enkele lijn langs het midden van het koffiefilter (Zie Figuur 1 c). De oogschelp stukken voorzichtig omgaan met fijne pincet alleen in de buurt van een rand of hoek.
- Om te voldoen aan het koffiefilter netvlies, plaats de natte filtreerpapier op een droog papieren handdoek voor 3 s te pit vocht naar beneden, maar niet laten het weefsel droog geworden. Herhaal deze stappen totdat de oogschelp stukken Lig plat op het filtreerpapier. Zachte zuigkracht toe te passen op de onderkant van het koffiefilter helpt afvlakken van het netvlies, maar deze stap is niet noodzakelijk.
- Als zwarte vellen RPE op de oogschelp stukken blijven, fijne pincet gebruiken schil zachtjes het weg vanaf een hoek (Zie Figuur 1 d) terwijl het weefsel in een druppel Ringer's oplossing zit. Het netvlies moet til van het koffiefilter, herhaal de wicking stap in 2.5.3. Het netvlies lijkt roze als gevolg van ongebleekte visuele pigmenten.
- Herhaal netvlies dissectie, vlakke montage stappen in 2.4-2.6 voor het tweede oog, indien gewenst, houden de eerste flat gemonteerde netvlies ondergedompeld in koude Ringer's oplossing. Om te stroomlijnen de segmenteringshulplijnen procedure, mogen stukken van beide netvlies worden gebracht op een filtreerpapier. Zodra de RPE is verwijderd, kan het protocol worden uitgevoerd onder normale kamer licht tenzij experimenten noodzakelijk duisternis.
- Breng het filter op een dia en knippen in een rechthoek met een enkele rand scheermesje, verlaten ~ 0.5 cm filtreerpapier aan beide zijden van de lijn van het netvlies. Het koffiefilter naar de bereid snijden kamer, duw de lange filtreerpapier randen in de dunne vaseline regels in met een pincet en onderdompelen van het netvlies in 3-4 druppels koude Ringer's oplossing.
Opmerking: Sommige pigmenten, zoals lipofiele kleurstoffen, best in geladen vlakke beugels in dit stadium vóór het snijden. Deze kunnen worden geladen, wicked weg met een tissue en gewassen in de segmenteringshulplijnen zaal. Bijvoorbeeld, C12 558/568 BODIPY intens vlekken retinale cel membranen en buitenste segmenten fotoreceptor (Zie figuur 4A) wanneer geladen op ~ 5 µg/mL gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (meestal 23-27 ° C), gevolgd door een wassen in overmaat Ringer's oplossing . - De segmenteringshulplijnen zaal overbrengen in de fase van de slicer weefsel, plaats de lange zijde langs de duidelijke lijn en beveiligen van de uiteinden van de kamer naar het werkgebied met laboratorium tape. Beginnen aan de ene kant, snij het netvlies en filterpapier gebruik stevige, zachte druk op de segmenteringshulplijnen arm. Controleer of het eerste segment werd gesneden volledig, gebruik dan de micrometer te snijden ~ 400 µm segmenten.
- Monteer de imaging ladder.
- Plaats de segmenteringshulplijnen kamer met gesneden retinale secties in de petrischaal uit stap 1.7 grenzend aan de beeldvorming ladder (Zie figuur 1E). Vul de schotel met koude Ringer's oplossing voor het onderdompelen van de inhoud ervan.
- Met behulp van Tang en segmenten ondergedompeld te houden, zachtjes overdracht reepjes filtreerpapier en netvlies naar de ladder door te schuiven van de petrischaal van links naar rechts. Wees voorzichtig niet te netvlies direct raken. De segmenten roteren 90° en de randen van het filtreerpapier begraven in vaseline.
- Netvlies segmenten fijn in de ladder worden verplaatst met een tang zodat retinale lagen duidelijk zichtbaar onder de Microscoop dissectie zijn (Zie figuur 1G). Segmenten aan beide uiteinden van de ladder, te waarborgen dat het weefsel naar binnen is naar de richting van de andere segmenten om te minimaliseren van de beweging van het weefsel tijdens de injectie of stroom. Gooi alle retinale segmenten die niet goed vastgehouden aan het koffiefilter (Zie figuur 2A).
- Indien gewenst, kleurstoffen in netvlies segmenten te laden in dit stadium en wassen in overmaat Ringer's oplossing vóór imaging.
Opmerking: Propidium jodide (PI) en Hoechst 33342 krachtig vlek kernen van doden en alle cellen, respectievelijk (Zie figuur 2B), wanneer met retinal segmenten bij 5 µg/mL gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Tetramethylrhodamine (TMRM) accumuleert in actief respiring mitochondriën in het netvlies wanneer geïncubeerd bij 1 nM gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. - Terwijl de segmenten zijn kleuring, bereiden de imaging kamer en injectie apparatuur. Gebruik de spuit om te spoelen van de buis met Ringer's solution purge bubbels, hechten het open uiteinde van de buis aan de inlaat van de beeldvorming kamer en sluit de afsluiter. Verwijder de spuit en vul deze met reagent(s) voor injectie, dan weer aan de buis.
- Pincet gebruiken voor het overbrengen van het dekglaasje aan met retinal segmenten in de beeldvorming vergaderzaal, op het dekglaasje aan in de stip van vaseline in de buurt van de rand van de inlaat van de beeldvorming kamer te drukken (Zie Figuur 1 H). Vul de imaging kamer met Ringer's oplossing ter dekking van de segmenten.
3. beeldvorming retinale segmenten
- Plaats de gevulde imaging zaal met het toestel verbonden injectie in het werkgebied van een rechtop confocal microscoop voorzien van een 20 of 40 X water dompelen lens. Beveilig de imaging zaal met podium clips.
- Verlaag de dompelen lens over de ladder en zich richten op een segment aan het ene uiteinde van de ladder onder dim trans verlichte licht. Het onderzoeken van elk segment voor transversale oriëntatie, aanwezigheid van fotoreceptor buitenste segmenten, en veilige hechting op het filtreerpapier.
- Selecteer de beste segment voor time lapse beeldvorming en configureer de Microscoop software voor time lapse Beeldacquisitie. Tabel 4 schetst imaging standaardinstellingen voor verschillende fluorescente markeringen en kleurstoffen.
Opmerking: Het aantal Beeldacquisitie zal variëren afhankelijk van de Microscoop, fluorescerende marker(s) en biologisch proces bestudeerd. Gebruik bijvoorbeeld 800 x 800 pixelresolutie, de snelheid van de scan 2 µs/pixel en een beeldfrequentie van 10 s voor imaging-calcium dynamiek in researchdieren met GCaMP3 en een rode kleurstof.- Indien beschikbaar, kunt u de software gebruiken voor het traceren van fysieke monumenten in het segment (fotoreceptor buitenste segmenten, cel organen, kernen) om te helpen potentiële heroriëntatie tijdens de tijdspanne. Ook instellen naar de software om te controleren van real-time fluorescentie in het segment.
- Begin beeldvorming en monitor basislijn fluorescentie. Wanneer fluorescentie in het segment stabiliseert (meestal binnen 2-5 min), gaat u verder met het experiment. Voor injectie, open de afsluiter van de spuit, vervolgens langzaam drukken en trek u terug op de plunjer tweemaal om te helpen met het mengen.
Opmerking: schaffen bijvoorbeeld mitochondriale functie door het injecteren van een geconcentreerde oplossing van de protonophore CCCP te bereiken een eindconcentratie van 1 µM in de beeldvorming zaal. Dit induceert een robuuste Ca2 + barsten in fotoreceptor cytosol gerapporteerd door GCaMP, vervolgens een gestage afname van de Mitochondriale membraanpotentiaal gemeld door TMRM. - Monitoren van segmenten voor drift tijdens het experiment, en de software gebruiken voor het maken van micro-aanpassingen volgens fysieke monumenten. Meestal in de Z-richting te drijven tijdens de injectie of perfusie is < 5 µm.
4. imaging retinale segmenten tijdens perfusie experimenten waar oplossingen zijn veranderd of stroomde continu
Opmerking: Imaging retinal plakjes tijdens perfusie experimenten waar oplossingen worden gewijzigd of continu stroomde is vergelijkbaar met de setup voor statische imaging of injectie experimenten, met de volgende wijzigingen.
- In plaats van vaseline ladders in stap 1.4 beschreven, gebruik u steviger wax ladders te houden retinale segmenten stabiel tijdens oplossing stroom.
- Plaats twee kleine parallelle cilinders van zonder tandheelkundige wax ~ 0.5 cm uit elkaar op een dekglaasje aan. Gebruik op een vlakke ondergrond, een duim te drukken elke cilinder neer en uit naar de parallelle rand van het dekglaasje aan. Score van beide afgevlakte cilinders horizontaal met een dekglaasje #1 aan (Zie figuur 1E, rechterkant) dan het smeren van een dun laagje vaseline tussen de wax strips met een spatel.
- Bij het monteren van de beeldvorming ladder in stap 2.10.2, druk op de randen gesneden filtreerpapier in de wax scores met fijne pincet (figuur 1G).
- Als u wilt instellen voor perfusie in stap 2.12, vul spuit reservoirs met preoxygenated oplossingen, of gebruik de optionele gas variëteit om zuurstof oplossingen in elke reservoir. Spoel alle buizen met Ringer's solution, zorgen voor dat alle lijnen stromen wanneer geopend en purge grote bubbels.
- Voordat vullen de imaging kamer in stap 2.13, plaatst u een ander punt van vaseline op elke blootgestelde hoek van het dekglaasje aan om te voorkomen dat het lateraal glijden tijdens stroom met de spuit.
- Wanneer de imaging kamer wordt gevuld en gemonteerd in het werkgebied van de Microscoop, schakel de aspirator en sluit de aspirator-buis. Testen van de stroom van de Ringer's oplossing en gebruik de micropositioner om te situeren de aspirator buis over de uitstroom kamer zodat kleine hoeveelheden vloeistof zijn getrokken uit voordat de zaal loopt over (meestal ~ 1 mm boven het oppervlak van de oplossing voor een debiet van 2 mL/min). Bewaar Ringer's oplossing stroomt terwijl het selecteren van segmenten in stap 3.4.
- Schakelen om uit te voeren van het experiment in stap 3.4 voor perfusie, stroom van oplossingen door het sluiten van de afsluiter van de eerste oplossing bij het openen van die van de tweede oplossing.
- Bijvoorbeeld, om het afbreken van extracellulaire nb+ van de imaging kamer, gebruik twee reservoirs van de spuit gevuld met Ringer's oplossing of nb+-vrije oplossing (tabel 3). Stromen Ringer's oplossing voor het vaststellen van de basislijn, dan overschakelen naar nb+-vrije oplossing. Dit resulteert in grote cytosolische Ca2 + in fotoreceptor buitenste segmenten verhoogt en cel organen (Zie Figuur 4).
- Zwaartekracht-gevoed perfusie systemen, worden gecontroleerd door het niveau van de oplossing in elk reservoir dus het debiet constant tijdens imaging is. Top af reservoirs, desgewenst met zuurstofrijk oplossingen, of te handhaven continu zuurstof dat kolkt van de gas-variëteit.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Stabiele positionering en dwarse richting van segmenten zijn de sleutel tot succesvolle beeldbewerking met injectie of perfusie van farmacologische agenten. Zorgvuldige bestudering en segmenten vóór confocal imaging verplaatsen als die nodig zijn om dat alle retinale lagen zijn zichtbaar (figuur 2A, segment ii). Als een segment wordt gedraaid iets doorsturen (figuur 2A, segment iii), bundels van buitenste segmenten zichtbaar zal ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Ex vivo beeldvorming van verse zebrafish retinale segmenten heeft bewezen als een veelzijdig instrument voor het bestuderen van fotoreceptor biologie20,21,22, en is uniek in die zin dat hierdoor analyse van afzonderlijke cellen in een volwassen, volledig gedifferentieerde netvlies. Met praktijk is het mogelijk om meerdere experimenten met weefsel van een enkele vis, zelfs met behulp van seriële segmenten uit hetzelfde d...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
Wij danken Ralph Nelson en Daniel Possin voor doordachte oriëntatie terwijl het ontwikkelen van dit protocol, en Eva Ma, Ashley George en Gail Stanton voor generatie van stabiele transgene zebrafish lijnen. Het werk werd gesteund door de NSF GRFP 2013158531 aan M.G., NIH NEI 5T32EY007031 naar de W.C. en M.G. en EY026020 J.H. en S.B.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| zebrafish | Univeristy of Washington South Lake Union Aquatics Facility | stocks maintained in-house as stable transgenic lines | |
| petroleum jelly | Fisher Scientific | 19-090-843 | voor petroleum jelly spuit |
| 3-mL slip tip spuit | Fisher Scientific | 14-823-436 | voor petroleum jelly spuit |
| 20g 3,8 cm slip tip naald | Fisher Scientific | 14-826-5B | voor petroleum jelly spuit |
| platte 7 cm X 2,5 cm microscoopglaasje | Fisher Scientific | 12-550-A3 | voor eyecup dissectie, snijdkamer |
| Seche Vite heldere nagellak | Amazon | B00150LT40 | voor snijdkamer |
| 18 mm X 18 mm #1 glazen dekglas | Fisher Scientific | 12-542A | voor beeldvorming ladders |
| smaakloze tandheelkundige was | Amazon | B01K8WNL5A | voor beeldvorming ladders |
| dubbelzijdige scheermesjes | Stoelting | 51427 | voor weefselsnijden |
| weefsel snijder met digitaal micrometer | Stoelting | 51415 | voor weefselsnijden |
| filterpapier - wit geribbeld gemengd cellulose, 13 mm diameter, 0,45 µm poriegrootte | EMD Millipore | HAWG01300 | filterpapier voor het monteren van retina's |
| 10 cm petrischaal | Fisher Scientific | FB0875712 | voor vis euthanasie, dissectie, beeldvorming ladder montage |
| 15 cm platte-tip houten applicator stick | Fisher Scientific | 23-400-112 | voor draadooglus tool |
| 30g (0,25 mm diameter) wolfraamdraad | Fisher Scientific | AA10408G6 | voor draadooglus tool |
| D-glucose | Sigma Aldrich | G8270 | component van aanvullingsvoorraadoplossing |
| natrium L-lactaat | Sigma Aldrich | L7022 | component van aanvullingsvoorraadoplossing |
| natriumpyrovaat | Sigma Aldrich | P2256 | component van aanvullingsvoorraadoplossing |
| L-glutamine | Sigma Aldrich | G3126 | component van aanvullingsvoorraadoplossing |
| L-glutathione, gereduceerd | Sigma Aldrich | G4251 | component van aanvullingsvoorraadoplossing |
| L-ascorbinezuur | Sigma Aldrich | A5960 | component van aanvullingsvoorraadoplossing |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | component van Ringer's oplossing |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | component van Ringer's oplossing |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma Aldrich | C3881 | component van Ringer's oplossing |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | component van Ringer's oplossing |
| MgCl2 · 6H2O | Sigma Aldrich | M0250 | component van Ringer's oplossing |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | component van Ringer's oplossing |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152 | component van Na+-vrije Ringer's oplossing |
| 6 N HCl | Fisher Scientific | 02-003-063 | component van Na+-vrije Ringer's oplossing |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5655 | component van Na+-vrije Ringer's oplossing |
| 50 mL conische centrifugebuis | Denville Scientific | C1062-P | container voor Ringer's oplossing |
| Vannas schaar - 8 cm, hoekige 5 mm bladen | World Precision Instruments | 501790 | micro-schaar voor eyecup dissectie |
| Zwitserse pincet - #5, 11 cm, recht, 0,06 X 0,07 mm uiteinden | World Precision Instruments | 504510 | fijn pincet voor eyecup dissectie en schijfmanipulatie |
| enkelzijdige scheermesjes | Fisher Scientific | 12-640 | voor eyecup dissectie en trimmen van filterpapier |
| EMD Millipore filter pincet | Fisher Scientific | XX6200006P | platte pincet voor het hanteren van nat filterpapier |
| C12 558/568 BODIPY | Fisher Scientific | D3835 | kleurt levende celkernen; incubeer 5 µg/mL gedurende 15 min bij kamertemperatuur |
| propidiumjodide (PI) | Fisher Scientific | P3566 | kleurt dode celkernen; incubeer 5 µg/mL gedurende 20 min bij kamertemperatuur |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | kleurt levende celkernen; incubeer 5 µg/mL gedurende 20 min bij kamertemperatuur |
| Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM) | Fisher Scientific | T668 | kleurt functionele, negatief geladen mitochondriën; incubeer 1 nM gedurende 30 min bij kamertemperatuur |
| weefsel perfusiekamer | Cell MicroControls | BT-1-18/BT-1-18BV [-SY] | beeldvormingskamer voor injectie of perfusie |
| 2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (NBDG) | Fisher Scientific | N13195 | fluorescerende glucose analoog gegeven oraal aan zebravissen 30 min voorafgaand aan euthanasie |
| Olympus laser scanning confocale microscoop | Olympus | FV1000 | confocale microscoop voor het visualiseren van fluorescentie van snijsels op celniveau |
| Carbonyl cyanide 3-chloorfenylhydrazon (CCCP) | Sigma Aldrich | C2759 | experimenteel reagens dat mitochondriale ademhaling afbreekt; behandel snijsels tot een eindconcentratie van 1 µM |
| miniatuur aspirator positioneerder | Cell MicroControls | FL-1 | voor perfusie |
| perfusie manifold, gasbellen manifold, flow klep, 60cc spuithouder | Warner Instruments | various | voor perfusie |
Referenties
- Lieschke, G., Currie, P. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Ma, E., et al. Loss of Pde6 reduces cell body Ca2+ transients within photoreceptors. Cell Death Dis. 4 (9), e797(2013).
- Niethammer, P., Grabher, C., Look, A., Mitchison, T. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).
- Andrews, N., et al. Visualising apoptosis in live zebrafish using fluorescence lifetime imaging with optical projection tomography to map FRET biosensor activity in space and time. J. Biophotonics. 9 (4), 414-424 (2016).
- Kioka, H., et al. Evaluation of intramitochondrial ATP levels identifies G0/G1 switch gene 2 as a positive regulator of oxidative phosphorylation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (1), 273-278 (2014).
- Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-Time Visualizationof Neuronal Activity during Perception. Curr. Biol. 23 (4), 307-311 (2013).
- Stewart, A., Braubach, O., Spitsbergen, J., Gerlai, R., Kalueff, A. Zebrafish models for translational neuroscience research: from tank to bedside. Trends Neurosci. 37 (5), 264-278 (2014).
- Zou, S. -Q., Yin, W., Zhang, M. -J., Hu, C. -R., Huang, Y. -B., Hu, B. Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish. J. Vis. Exp. (36), e1742(2010).
- Neuhauss, S. Behavioral genetic approaches to visual system development and function in zebrafish. J. Neurobiol. 54 (1), 148-160 (2002).
- Stearns, G., Evangelista, M., Fadool, J., Brockerhoff, S. A Mutation in the Cone-Specific pde6 Gene Causes Rapid Cone Photoreceptor Degeneration in Zebrafish. J. Neurosci. 27 (50), 13866-13874 (2007).
- Gross, J., Perkins, B. Zebrafish mutants as models for congenital ocular disorders in humans. Mol. Reprod. Dev. 75 (3), 547-555 (2007).
- Lewis, A., Williams, P., Lawrence, O., Wong, R., Brockerhoff, S. Wild-Type Cone Photoreceptors Persist Despite Neighboring Mutant Cone Degeneration. J. Neurosci. 30 (1), 382-389 (2010).
- Wang, T. -M., Holzhausen, L., Kramer, R. Imaging an optogenetic pH sensor reveals that protons mediate lateral inhibition in the retina. Nat. Neurosci. 17 (2), 262-268 (2014).
- Van Hook, M., Thoreson, W. Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation. J. Vis. Exp. (76), e50007(2013).
- Connaughton, V. Zebrafish retinal slice preparation. Meth. Cell Sci. 25 (1/2), 49-58 (2003).
- Kennedy, B., et al. Identification of a zebrafish cone photoreceptor-specific promoter and genetic rescue of achromatopsia in the nof mutant. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (2), 522-529 (2007).
- George, A., et al. Synaptojanin 1 is required for endolysosomal trafficking of synaptic proteins in cone photoreceptor inner segments. PLoS ONE. 9 (1), e84394(2014).
- George, A. Synaptojanin1 is involved in endolysosomal trafficking in cone photoreceptors (Doctoral dissertation). , Available from: http://hdl.handle.net/1773/33102 (2015).
- Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases. Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).
- Giarmarco, M., Lindsay, K., Du, J., Cleghorn, W., Brockerhoff, S., Hurley, J. Imaging Real-time Glucose Uptake Reveals Distinct Transport Among Cell Types. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. , Poster abstract (2015).
- Kanow, M., et al. Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye. eLife. 6, (2017).
- Giarmarco, M., Cleghorn, W., Sloat, S., Hurley, J., Brockerhoff, S. Mitochondria Maintain Distinct Ca2+ Pools in Cone Photoreceptors. J. Neurosci. 37 (8), 2061-2072 (2017).
- Uckermann, O., et al. Selective staining by vital dyes of Müller glial cells in retinal wholemounts. Glia. 45 (1), 59-66 (2003).
- Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Current protocols in cytometry. , Chapter 9, Unit 9.39 (2012).
- Kulkarni, M., et al. Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (99), (2015).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
