Therapie testen in een sferoïde gebaseerde 3D cel cultuur Model voor hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom

Samenvatting

We beschrijven de evolutie van een sferoïde gebaseerde, driedimensionale in vitro model waarmee we kunnen testen van de huidige standaard voor experimentele therapie regimes voor hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom op cellijnen, die gericht zijn op het evalueren van therapie gevoeligheid en weerstand op primaire cellen van menselijke specimens in de toekomst.

Samenvatting

Huidige behandelingsopties voor geavanceerde en steeds terugkerende hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom (HNSCC) omsluiten straling en chemo-straling benaderingen met of zonder chirurgie. Terwijl platinum gebaseerde chemotherapie regimes momenteel vertegenwoordigen de goudstandaard in termen van werkzaamheid en worden gegeven in de overgrote meerderheid van de gevallen, nieuwe chemotherapie regimes, namelijk immunotherapie zijn in opkomst. De berekening van responsrates en therapie resistentie mechanismen voor beide chemo regime zijn echter moeilijk te voorspellen en blijven onvoldoende begrepen. Brede variaties van chemo en straling resistentie-mechanismen zijn bekend tot op heden. Deze studie beschrijft de ontwikkeling van een gestandaardiseerde, hoge-doorvoer in vitro assay beoordelen HNSCC cellijn reactie op verschillende therapie-regimes, en hopelijk op primaire cellen van individuele patiënten als een toekomstige instrument voor gepersonaliseerde tumor therapie. De bepaling is ontworpen om te worden geïntegreerd in de kwaliteit-gecontroleerde standaard algoritme voor HNSCC patiënten bij onze tertiaire care center; Dit is echter onderwerp van toekomstige studies. Technische haalbaarheid ziet er veelbelovend voor primaire cellen van de tumor Biopten van daadwerkelijke patiënten. Monsters worden vervolgens overgebracht naar het laboratorium. Biopten worden mechanisch gescheiden gevolgd door enzymatische spijsvertering. Cellen worden vervolgens gekweekt in ultra-lage wrijvingscoëfficiënt cel cultuur flesjes ter bevordering van de reproduceerbaar, gestandaardiseerde en spontane vorming van driedimensionale, sferoïde-vormige cel conglomeraten. Spheroïden zijn dan klaar om te worden blootgesteld aan chemo-straling protocollen en immunotherapie protocollen zo nodig. De grootte van de laatste cel levensvatbaarheid en sferoïde zijn indicatoren van therapie gevoeligheid en daarom in de toekomst te beoordelen van de patiënten waarschijnlijk therapie antwoord rekening konden worden getrokken. Dit model zou een waardevolle, kosten-efficiënte hulpmiddel naar gepersonaliseerde therapie voor hoofd en nek kanker.

Inleiding

Hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom (HNSCC) is de zesde gemeenschappelijkste kanker wereldwijd met een stijgende incidentie voor cutane humaan papillomavirus (HPV) infectie-geassocieerde pathogenese, naast een meerderheid van de gevallen veroorzaakt door buitensporige nicotine en alcohol verbruik ^1,2. Terwijl kleinere tumoren en vooraf invasieve stadia meestal goed te behandelen met chirurgische excisie zijn, meestal in combinatie met cervicale lymfeklier dissectie, blijft behandeling voor geavanceerde-fase en terugkerende HNSCC uitdagend als gevolg van agressieve tumor invasie met metastatische verspreiding en weerstand tegen straling en chemotherapie protocollen^3,4,5,6,7,8. Recente studies suggereren een hoge variabiliteit van cellulaire fenotype en sub karakterisering van circulerende en gedissemineerde tumorcellen is net begonnen^9,10. De eerdere overtuiging van een solide, uniforme tumor massa moest worden herzien in het licht van de recente studies in het verleden jaar^11,12,13,14. Huidige benaderingen voor de karakterisering van de tumor en identificatie van belangrijke mutaties kunnen het identificeren van verschillende genen die lijken te worden geassocieerd met therapie resistentie maar blijven een kosten-intensieve aanpak. Bovendien kennis met genotype niet noodzakelijkerwijs toe dat een betrouwbare voorspelling van fenotype en de reactie van de behandeling.

Er zijn weinig vorderingen bij het verbeteren van de algehele en ziektevrije overleving voor geavanceerde-fase en terugkerende ziekte. Nicotine - evenals virus-geassocieerde carcinoom, huidige behandelingsopties naast chirurgie plaatst u agressieve straling en chemotherapie platina gebaseerde regimes. Zijn er gevolgen voor verschillende respons tussen HPV-negatieve en positieve carcinoom; echter dit is nog niet leiden tot een wijziging in het algemeen therapie richtlijnen. Weerstand naar de bestraling en chemotherapie is een wijdverspreid fenomeen in alle stadia van de tumor en bestaat voor platina gebaseerde chemotherapie alsook voor gerichte therapie (Anti-EGFR; epidermale groeifactor-receptor) en onlangs opkomende checkpoint remming¹⁵. Ineffectief bestraling en chemotherapie komt op een hoge kosten van significante patiënt morbiditeit in termen van dysfagie, mucositis, droge mond en risico daling van renale of cardiale functie onder anderen. Voorspellen van therapie antwoord vóór lijkt het besluit van een algemene therapie-concept voor elke individuele patiënt het cruciale doel, het voorkomen van geen onnodige behandeling concepten, de bijwerkingen en de kosten.

Wij willen een model om te testen van de individuele patiënt behandeling gevoeligheid naar huidige standaard chemo-straling die kan worden geïntegreerd in het algoritme van de regelmatige en kwaliteit-gecontroleerde oncologische behandeling van een technische staande punt vestigen. De verre doel was om het gebruik van het model zonder het gebruik van sterk veranderde en leeftijd cellijnen, als ze slecht werkelijke menselijke tumorcellen zonder hun variabiliteit vertegenwoordigen en heterogeniteit zoals we nu, terwijl de vaststelling van het protocol weten werd gedaan in verschillende cellijnen. Om onafhankelijk te zijn alleen van commercieel beschikbare cellijnen, wij onlangs met succes gegenereerd een tussenliggende cellijn genaamd "PiCa" uit primaire HNSCC cellen van menselijke tumor exemplaren met geconserveerde cellulaire markeringen op het oppervlak en beperkte passages ¹⁶. deze PiCa cellijn dient als voorbereiding op de ontwikkeling van het model op de weg om vervolgens te proeven met verse menselijke kankercellen van tumor biopsieën later volgen. Het is aangetoond dat cellen in drie-dimensionale cel culturen anders reageren en meer in-vivo-beheer van kanker medicijnen dan die groeien in monolayers^{17,18,19,20 willen ,21}, voornamelijk te wijten aan de instandhouding van migrerende en sub differentiatie eigenschappen van bepaalde cel subsets^22,23,24. Hier beschrijven we het protocol van een sferoïde gebaseerde, driedimensionaal model van tussenliggende cellijnen en primaire menselijke plaveiselcelcarcinoom cellen en manieren hoe een dergelijk model in de behandeling van kanker van het hoofd en de nek chirurg en oncoloog ( integreren Figuur 1).

Protocol

Alle studies aangetoond in dit manuscript, namelijk het gebruik van menselijke tumor specimens, zijn beschermd onder en in toestemming met voorafgaande beslissingen van universiteit geneeskunde van Mainz/Universiteit van München Medical Center ethisch comité. Patiënten hebben geïnformeerde toestemming volgens de nationale wettelijke bepalingen akkoord te gaan met wetenschappelijk gebruik van overtollige biologisch materiaal dat werd verkregen in de loop van hun behandeling gegeven. Onderzoek is uitgevoerd met inachtneming van alle institutionele, nationale en internationale richtlijnen voor het menselijk welzijn.

1. het nemen van een Tumor biopsie van hoofd en Heck plaveiselcelcarcinoom

1. Uitvoeren van algemene (propofol en/of Sevofluraan, spier ontspannen agent) of lokale infiltratie (2% ultracaine, adrenaline) / oppervlakte (xylocaine) verdoving in de operatiekamer of kno onderzoek stoel. Visualiseren van de massa van de tumor in de orale holte/keelholte/strottenhoofd/andere delen van de bovenste spijsvertering en respiratoire tractus met standaard operationele instrumenten en, indien nodig, onder de Microscoop.
2. Neem een biopsie verse tumor vanuit de periferie van de kanker laesie met botte of snijdende instrumenten. Vermijd het midden van de laesie vanwege overvloedige necrose op dit gebied. Het verkregen weefsel aan een steriele container met isotone natriumchlorideoplossing plaatsen
3. Voer na de biopsie, hemostase zo nodig, bijv., met een bipolair of monopolaire coagulatie apparaat naast het gebruik van vasoconstrictive stoffen.
4. Breng de biopsie van de tumor die bestemd zijn voor cel cultuur experimenten rechtstreeks naar de aangrenzende laboratorium tractus. Andere tumor biopsieën verzenden door de patholoog zoals gebruikelijk aan het uitsluiten van kanker.
5. Zorg ervoor dat een laboratoriumtechnicus klaar is voor het verwerken van het specimen direct.

2. verwerking van de Tumor Specimen

1. Plaats van de tumor specimen op een geschikte en steriele ondergrond en het grondig met een steriel scalpel voor eenmalig gebruik in zo weinig mogelijk stukjes gesneden.
   Let op: Controleer of de status van besmettelijke en bloed overdraagbare ziekten is goed gedocumenteerd en de technicus in de aandacht van de instellingen standaard protocollen om te voorkomen dat naald stok of snijden letsel met potentieel biohazard patiënt materiaal en de protocollen te volgen na mogelijke verwonding.
2. Na voldoende mechanische scheiding van het primaire weefsel, zet het weefsel in een flesje met Collagenase ik / II en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C. Zeef door een 70 µm falcon cel zeef en wassen van de vering met Hanks evenwichtige zoutoplossing (HBSS).
3. Na de succesvolle scheiding en latere wassen, plaats de schorsing met 1-2 × 10⁶ cellen in een T75 cel cultuur kolven (75 cm²) te groeien naar sub-confluentie 5% CO₂ en een temperatuur van 37 ° C. Deze stap kan tot 10 dagen duren.
   1. Gebruik van speciale Keratinocyt kweekmedium dat bestaat uit de volgende: 125 mL Dulbecco gewijzigd van eagles medium (DMEM), 250 mL Keratinocyt aangevuld voedingsbodem (aangevuld medium bestaande uit 500 mL Keratinocyt SF Medium, 15 mg van boviene hypofyse uittreksel (BPE), 2,5 mL penicilline/streptomycine, 150 ng recombinante menselijke epitheliale groeifactor (EGF), 516 µL van 300 mM CaCl₂, voorraad mix worden van tevoren voorbereid), 125 mL van F12 nutriënten mix, 10 mg voor BPE (0,75 mL), 75 ng recombinante menselijke EGF (2 µL) , 3,75 mL 200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptide (tabel van materialen).

3. zaaien de cellen in ultra-lage wrijvingscoëfficiënt cel cultuur platen

1. Bevestig de celgroei tumor onder een microscoop. De cellen in cultuur tellen (primaire of cel cultuur) en zaad van 5.000 primaire tumorcellen of 1000 en 2000 cellen van tussenliggende cellijn / andere cellijn in 200-300 µL van media (stap 3.2.) in een ultra-lage wrijvingscoëfficiënt plaat met concaaf, ronde bodems (96-Wells).
2. Cultuur van de cellen bij 5% CO₂ bij 37 ° C en in gelijke delen DMEM en airway epitheliale cel medium (BEGM), foetaal runderserum 10%, 1% penicilline/streptomycine, 1% natrium pyruvaat, 1% niet-essentiële aminozuren, 1% L-glutamine (stap 2.3.). Als cellijnen worden gebruikt, is media op basis van de DMEM volstaat.
   1. Uitvoeren van wijzigingen van de media om de andere dag. Let niet op de sferoïde met de pipet tijdens media wijzigingen gecombineerd. De spheroïden cultuur tot op het niveau van de groei, zoals beschreven in punt 3.3 is bereikt (ongeveer 7-10 dagen).
3. Bevestig spontane sferoïde vorming onder de Microscoop door op zoek naar driedimensionale, sferoïde-vormige cel conglomeraten. Sluiten de putjes met onregelmatige en/of meerdere sferoïde vorming van verder onderzoek.
   Opmerking: Spheroïden zichtbaar moeten zijn met het blote oog, ook verdere verwerking en media wijzigingen zoals beschreven hieronder te vergemakkelijken.

4. spheroïden op multimodale standaard of experimentele Tumor therapie bloot

1. Kies een gewenste therapie-regime. Het ontwerp van voldoende grote controlegroepen waarmee vergelijkingen van behandelingen om onbehandeld spheroïden of spheroïden ontvangen van slechts gedeeltelijke therapie regimes, bv. straling alleen. De grootte van de controlegroepen hangt af van het ontwerp van de experimentele groep en niet universeel worden gedefinieerd.
2. Uitwisseling van de media aan media met additieven, zin media met chemotherapeutica en/of monoklonale antilichamen op de gewenste concentraties. Voeg cisplatine bij de concentraties van 2,5/5/10 µM of 5-fluoruracil (5FU) bij 30 µM.
   Opmerking: Voor hoge doorvoer experimenten of grote groep maten/groot aantal groepen, kan men een geautomatiseerde pipetting robot gebruiken wij verdere oprichten in de experimenten.
3. Als alternatief, stralen de cel cultuur platen met spheroïden op 2 Gy met behulp van een geschikte straling faciliteit.
   Let op: Eerbiediging van de instelling protocollen met betrekking tot preventie van schadelijke straling blootstelling van de werknemers. Werken alleen met aangewezen en opgeleide technici volgens richtlijnen van de bescherming van de straling. Indien gewenst, voeg chemotherapeutica zoals beschreven onder 4.2. daarna.
4. Incubeer de cellen gedurende 24 uur in de eerder beschreven kweekomstandigheden (37 ° C, stap 3.2).
5. Na de incubatie, blijven de celcultuur gedurende ten minste 6 dagen met media wijzigingen om de andere dag.

5. beoordeling van sferoïde grootte en omvang van cellulaire proliferatie voor Assay uitlezing

1. De sferoïde grootte meten in termen van gebied na digitale foto documentatie op dag 6 (dag 10, dag 16) met een grafische software (parameter 1).
2. Na centrifugeren bij 520 x g gedurende 2,5 min van de plaat, verwijder de bovendrijvende substantie. Wassen van de cellen met voldoende hoeveelheid 1 x PBS en centrifuge die de plaat opnieuw zoals beschreven, gevolgd door het verwijderen van het supernatant (PBS).
3. Voeg 100 µL van enzymatische cell detachement oplossing aan elk flesje om de spheroïden te ontbinden. Incubeer de plaat gedurende 8 minuten bij 37 ° C.
4. Selectievakje voor succesvolle ontbinding van de sferoïde onder de Microscoop. Voeg 100 µL van DMEM. Centrifugeer de plaat bij 520 x g gedurende 2,5 min. Verwijder het supernatant en opschorten van de cellen in 100 µL van DMEM.
5. Een commercieel beschikbare colorimetrische proliferatie assay, bij voorbeeld WST-8 test op elke flacon volgens van de instructies van de fabrikant²⁵uitvoeren De bepaling in een enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) lezer (parameter 2) voorgelezen.

Resultaten

We waren in staat om te spheroïden van eencellige schorsingen, reproducibly eerst te genereren uit verschillende cellijnen, met inbegrip van de propriëtaire PiCa cellijn, later van primaire menselijke kankercellen afgeleid van verse tumor biopsieën, zoals beschreven in Hagemann et al. . ²⁶. we twee gevestigde methoden geëvalueerd voor sferoïde generatie; de twee zijn de zogenaamde opknoping neerzetten (HD) methode en de methode van ultra-lage wrijvingscoëf...

Discussie

We waren in staat om een protocol voor het genereren van reproduceerbaar spheroïden van cel schorsingen, voor beide cellijnen, en voorbereidende experimenten, primaire tumor van de menselijke cellen. We eerst beoordeeld van de twee eerder beschreven methoden en de ULA-methode, een methode waar cultuur platen met ultra-lage wrijvingscoëfficiënt oppervlakken worden gebruikt, zijn de veiliger en betrouwbaarder voor de generatie van uniforme driedimensionale spheroïden geïdentificeerd. Door het combineren van twee aparte met...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM)	Biochrom, Berlijn, Duitsland	F 0425
Fetaal bovien serum	Gibco Life Technologies, Paisley, VK	10500-064
penicillin/streptomycin	Biochrom, Berlijn, Duitsland	A2212
natriumpyruvaat	Biochrom, Berlijn, Duitsland	L0473
niet-essentiële aminozuren	Biochrom, Berlijn, Duitsland	K0293
L-Glutamine	Biochrom, Berlijn, Duitsland	K0293
Liberase	Roche Life Sciences, Bazel, Zwitserland	5401127001
GravityPLUS 3D Cultuur en Assay Platform	InSphero, Schlieren, Zwitserland	PB-CS 06-001
GravityTRAP plaat	InSphero, Schlieren, Zwitserland	PB-CS-01-001
Ultra-low attachment (ULA) kweekplaten	Corning, Corning, NY, VS	4520
groeimedium voor luchtweg-epitheelcellen	Promocell, Heidelberg, Duitsland	C-21060
amfotericine B	Biochrom, Berlijn, Duitsland	A 2612
groeimedium supplementmix voor luchtweg-epitheelcellen	Promocell, Heidelberg, Duitsland	C39165
WST-8 test	Promocell, Heidelberg, Duitsland	PC PK-CA705-CK04
Keratinocyte SFMedium + L-Glutamine 500mL	Invitrogen	#17005-034
Bovine Pituitary Extract (BPE), 25mg	Invitrogen	#37000015
Recombinant human Epithelial Growth Factor 2,5 µg	Invitrogen	#37000015
DMEM Hoge Glucose	Invitrogen	#21068-028
Penicillin Streptomycin 10000U/mL Penicillin/ 10000µg/mL Streptomycin	Invitrogen	#15140-122
F12 Nutrient Mix	Invitrogen	#21765-029
Glutamax (200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptide in NaCl)	Invitrogen	#35050087
HBSS (Ca, Mg)	Life Technologies	#14025-092	(geen fenolrood)
1x TrypLE Express Enzym	Invitrogen	#12604-013	(geen fenolrood)
Accutase (enzymatische celdetachment-oplossing)	Innovative cell technologies	Cat# AT104
70 µm Falcon celstrainer	BD Biosciences, VS	#352350