Driedimensionale weergave en analyse van Immunolabeled, verduidelijkt menselijke placenta Villous vasculaire netwerken

Summary

Deze studie geeft een protocol voor het omkeerbare weefsel clearing, immunokleuring, 3D-rendering en analyse van vasculaire netwerken in menselijke placenta villi monsters over de volgorde van 1-2 mm,³.

Abstract

Nutriënt en gas uitwisseling tussen moeder en foetus treedt op op het grensvlak van de maternale intervillous bloed en het grote villous capillaire netwerk dat een groot deel van de parenchym van de menselijke placenta maakt. De distale villous capillaire netwerk is het eindpunt van de foetale bloedtoevoer na meerdere generaties vertakking van vaartuigen uit afkomstig uit de navelstreng uit te breiden. Dit netwerk heeft een aaneengesloten cellulaire schede, de syncytieel trofoblast barrière laag, waardoor de vermenging van foetaal bloed en het moederlijke bloed waarin het continu baadt. Beledigingen aan de integriteit van de placenta capillaire netwerk, die zich in wanorde zoals moeders diabetes, hoge bloeddruk en obesitas, hebben gevolgen die aanwezig ernstige gezondheidsrisico's voor de foetus, kinder-, en volwassen. Als u wilt beter definiëren de structurele effecten van deze beledigingen, werd een protocol ontwikkeld voor deze studie die vangt capillaire netwerkstructuur volgorde van 1-2 mm³ waarin een topologische landschapskenmerken in zijn volledige complexiteit kan onderzoeken. Om dit te bereiken, clusters van terminal villi van placenta worden ontleed en de trofoblast-laag en de capillaire endothelia zijn immunolabeled. Deze monsters worden vervolgens verduidelijkt met een nieuw weefsel clearing proces dat het mogelijk maakt te verwerven van de confocal afbeeldingsstapels naar z-diepten van ~ 1 mm. De driedimensionale renderings van deze stapels worden vervolgens verwerkt en geanalyseerd voor het genereren van capillaire basisnetwerk maatregelen zoals volume, aantal capillaire takken en capillaire vertakkingspunten einde, als bevestiging van de geschiktheid van deze aanpak voor de karakterisering van het capillaire netwerk.

Introduction

Ons begrip van de ontwikkeling van de placenta en de pathologieën is, in belangrijke mate beperkt tot ruimtelijke relaties tussen aangrenzende villi en ingeperkt haarvaten afgeleid van histologische secties afgeleid. In dit onderzoek hebben we deze kwestie door de ontwikkeling van de middelen voor het genereren van driedimensionale (3D) renderings van menselijke placenta capillaire netwerken die geschikt voor analyses van capillaire netwerkfuncties (bijvoorbeeld vertakking zijn, stevigheid). Om dit te doen hebben wij gecombineerd immunefluorescentie kleuring met twee commerciële weefsel clearing producten, Visikol-1 en Visikol-2 (hierna aangeduid als oplossing-1 en oplossing-2).

De menselijke placenta is een uitgestrekte complex van bloedvaten, gelegen op het raakvlak tussen de intervillous bloed van de moeder en de zich ontwikkelende foetus. Uit te breiden uit vanaf de invoegpositie in de chorionic plaat, takken de navelstreng in een netwerk van slagaderen en aderen die ramify ter dekking van de chorionic oppervlak met een uitgebreide vasculaire netwerk. Hun doeleinden dan neer in het interieur of de diepte van de placenta schijf waar ze ondergaan verschillende meer vertakkende generaties en eindigen in de terminal villi en hun ingeperkt capillaire netwerken, de site van de uitwisseling van gassen, voedingsstoffen, doordringen en metabole afval tussen foetale en maternale bloed.

Beledigingen naar de placenta capillaire netwerk tijdens de ontwikkeling duurzame gevolgen hebben voor de gezondheid van de foetus, pasgeboren zuigelingen- en de opkomende volwassen ^1,2,3. Met het oog op zwangerschap-gerelateerde aandoeningen zoals miskraam, beperking van de uteriene groei, pre-eclampsie en de moeder diabetes ^4,5,6 er is een hoge waarde geplaatst op de ontwikkeling van methoden voor de meting en karakterisatie van placenta villous capillaire netwerken. Een grote wegversperring is dat placenta vasculaire netwerken een brede waaier van schaal omvatten. De oppervlakte vasculaire netwerken kunnen worden zo groot als 4-5 mm in diameter. De terminal villous haarvaten zijn over de volgorde van 10 -20 µm in diameter; de placenta bevat meer dan 300 km aan bloedvaten ⁷. Op dit moment zijn er paar makkelijk te gebruiken en snelle technieken die deze uitersten van de schaal van het vaartuig vangen kunnen. Tot op heden kan slechts een klein aantal villi worden gemaakt door microscopie. Bijvoorbeeld, Jirkovska et al. gericht op de placenta villosités op termijn confocale microscopie combineren met seriële optische secties tussenpozen 1 µm verkregen 120 µm dik secties; ⁸werden geen gegevens over het aantal monsters studeerde noch statistieken worden meegedeeld. Capillaire structuren werden geïdentificeerd, en contouren van villi en haarvaten waren handgetekende, met schetsen voor beeldanalyse geëxporteerd. Terwijl de auteurs spreken over de implicaties van hun bevindingen voor het "groeiend villous vasculaire netwerk", zijn deze conclusies problematisch wanneer alleen "term" (36 + week zwangerschapsduur) weefsel wordt bestudeerd. Evenzo Mayo et eenl. en Pearce et al. vertrouwd op het weefsel van dezelfde leeftijd, voor hun simulaties van bloed stroom en zuurstof overdracht, maar hun analyses werden beperkt tot slechts een paar termijn terminal villi ^9,10 . Stereology is ook toegepast op de studie van de structuur van villous schepen. Maar nogmaals, de focus is over het algemeen op latere zwangerschappen leveren liveborn zuigelingen met één of meer zwangerschap complicaties ^11,12.

Tot voor kort, was confocal microscopie beperkt tot imaging naar weefsel diepten van 100-200 µm vanwege de absorptie van de excitatie en emissie van de fluorescentie door de bovenliggende weefsel ¹³ . Hoewel weefsel clearing en 3D histologie wijd zijn beschreven in de literatuur en er zijn zijn tal van methoden voor clearing veel weefsel ongeschikt voor gebruik met weefsels in het algemeen, aangezien zij onherroepelijk cellulaire morfologie via de Hyperhydratie beschadigen van proteïnen of verwijdering van lipiden. Daarom is het niet mogelijk om te valideren dat deze resultaten kenmerkend voor het weefsel zelf en niet artefacten zijn uit de verwerking van overwegende dat onze weefsel clearing proces is een omkeerbare techniek welk vermag valideren tegen traditionele histologie. Weefsel clearing in het algemeen gaat om een van drie belangrijke benaderingen: 1) uniforme matching van de brekingsindex (RI) van weefsel componenten door onderdompeling in RI overeenkomende oplossingen, waarbij de cumulatieve lichtverstrooiing veroorzaakt uit lensing toe te schrijven aan continu wordt verwijderd schommelingen van de lage RI (cytosol) en hoge RI (eiwit/lipiden) bestanddelen; 2) verwijderen van lipide onderdelen door middel van inbedding in de hydrogel en met behulp van elektroforese/diffusie Schakel lipide onderdelen; 3) uitbreiding/denaturatie van eiwitstructuur dat toegenomen penetratie van oplosmiddelen te bevorderen van de eenvormigheid van de RI ¹³. Terwijl deze benaderingen kunnen weefsels transparant maken en toestaan voor 3D voorstellingen van biomarkers moeten worden gegenereerd, zijn deze 3D representaties van twijfelachtige klinische waarde omdat het is uitdagend om te bepalen of deze beelden indicatieve van weefsel eigenschappen of van het weefsel clearing proces. Aan de andere kant, aangezien onze weefsel wissen omkeerbaar is kan standaard histologische en/of immunohistochemistry worden toegepast op de dezelfde weefsel te beoordelen of de wijzigingen klinisch significante zijn.

Deze studie geeft een analyse van 47 distale villous monsters verkregen uit een totaal van 23 klinisch normaal en electively beëindigd zwangerschappen tussen 9-23 voltooide weken dracht en twee voldragen normale leveringen. Immunofluorescentie etikettering van trofoblast en endothelia heeft een kwantitatieve en geautomatiseerde analyse van veranderingen in de villous vasculaire netwerken en hun complexiteit.

Met dit protocol, we geïsoleerd en geanalyseerd terminal villi en hun capillaire netwerken op een schaal niet mogelijk eerder. Deze aanpak, wanneer toegepast op de ontwikkeling van het netwerk van villous en capillaire hele draagtijd zal identificeren die eigenschappen die de Stichting voor de geboorte van een gezond kind. Wanneer toegepast op studies van gecompliceerde zwangerschappen, zal het ook duidelijk maken wanneer en hoe de placenta pathologieën wijzigen de villous bomen en de capillaire netwerken ze schede, en hoe deze foetale welzijn aantasten.

Protocol

Dit protocol volgt de richtlijnen van New York Staatsinstituut voor fundamenteel onderzoek in ontwikkelingsstoornissen menselijke onderzoek ethisch comité.

1. villous boom dissectie

1. Spoel formaline vaste weefsel van de placenta met fosfaat afgeslepen zoutoplossing (PBS)¹⁴ tot en met de formaline verwijderen en plaatsen in een petrischaal op het podium van een dissectie Microscoop. Scalpel en fijne pincet gebruiken om pesten de placenta weefsel uit elkaar om te zoeken villous bomen (witte threadlike vertakkende structuren). Ontleden uit stukjes villosités boom (enkele mm lang) en het weefsel overbrengen in een micro-buis met ~ 1 mL PBS.

2. immunefluorescentie kleuring

1. Met een pipet, verwijder de PBS en vervangen door verse PBS. Laat staan voor 10 min met de occasionele zwenken. Herhaal dit nogmaals.
   Opmerking: Deze stap en alle verdere stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur behalve de primair antilichaam-incubatie.
2. Met behulp van een precisiepipet, verwijder en vervang de PBS met PBS + 0,1% Triton-X100 + 2% geit serum (PBS-T-GS) om permeabilize van de weefsels en blok niet-specifieke binding van secundaire antilichamen. Incubeer gedurende 30 min.
3. Vervangen van de PBS-T-GS met PBS met 2% geit serum, zowel muis monoklonaal anti-CK7 en konijn anti-CK7.
   1. Incubeer weefsel 's nachts bij 4 ° C.
   2. Verwijder de resterende antilichamen door wassen met PBS-GS gedurende 10 minuten met de occasionele zwenken.
   3. De PBS-GS Verwijder en vervang door PBS-GS met beide geit-antimuis IgG in combinatie met een groene uitstoten (520 nm) fluorophore en geit anti-konijn IgG gekoppeld een infrarood uitstoten (652 nm) fluorophore.
   4. Verwijder de antilichamen door stap 2.1 te herhalen.
   5. Het weefsel van de immunolabeled bij kamertemperatuur worden opgeslagen in het donker.

3. verduidelijking van het weefsel

1. Het wassen van de monsters 3 keer met PBS 10 minuten tussenpozen.
2. Uitdrogen van het weefsel door het verwijderen van de PBS met een pipet en vervangen door 50% ethanol (methanol kan eveneens worden gebruikt). Incubeer gedurende 10 minuten vervangen door verse 50% ethanol en incubeer voor 10 min. Herhaal dit nogmaals voor een totaal van 3 incubations. Herhaal incubations met 70%. Vervolgens vervangen door 100% ethanol en incubeer gedurende 15 minuten (methanol kan ook worden gebruikt).
3. Met een boete-tipped pincet, overbrengen in weefsel een verse micro-buis met ~ 1 mL oplossing-1 voor 4 uur.
4. Met een boete-tipped Tang, overbrengen in weefsel een verse micro-buis met oplossing-2 voor ~ 4 h.
   Opmerking: Wanneer opgeslagen in het donker, de immunofluorescentietest is stabiel bij kamertemperatuur gedurende ten minste 6 maanden.
5. Niet vermengen met een waterige oplossing, (b.v. montage medium) als de clearing zal verloren.

4. montage voor microscopie

1. Monteer het weefsel tussen een standaard glasplaatje en een dekglaasje aan niet zoals het weefsel zacht en gemakkelijk misvormde is.
2. Verwijzen naar Figuur 5B en mount het weefsel in een zaal van de Sykes-Moore als volgt;
   1. Plaats met een boete-tipped Tang een 25-mm ronde dekglaasje aan in de kamer basis.
   2. Plaats de rubberen afdichting in de basis het dekglaasje aan met een boete-tipped pincet.
   3. Breng een druppel (~ 40 µL) voor oplossing-2 in het midden van het dekglaasje aan met een pipet.
   4. Met de fine-tipped verlostang overbrengen in een stuk weefsel van oplossing-2 de daling in het midden van het dekglaasje aan.
   5. Plaats een tweede dekglaasje aan op de bovenkant van de pakking.
   6. Schroef de borgring in de bovenkant van de base de coverslips en de pakking comprimeren tot firma.
      Opmerking: Wees voorzichtig niet te overdreven scherpen of het dekglaasje aan zal verbrijzelen.
   7. Een naald van 22-gauge aansluit op een poort op de base en via de pakking.
   8. Vul een 3-mL injectiespuit met ~ 1,5 mL van oplossing-2.
   9. Monteren van een 25-meter-naald op de spuit.
   10. Plaats de naald van de spuit in de tegenovergestelde poort en door de pakking.
   11. Zorgen ervoor dat de lucht in de kamer is ontluchting via de andere 25-gauge-naald, zachtjes injecteren oplossing-2en vullen de kamer.
   12. Verwijder de naald en spuit en plaats van de kamer op een grote glasplaatje in het werkgebied van de confocal microscoop.
3. U kunt ook gesneden aangepaste putten uit PDMS siliconen bladen.
   1. Knip met een schaar een 25,4 × 25,4 mm² stukje van het PDMS blad.
   2. Met een scalpel gesneden ~ 12,7 × 12,7 mm² goed in het stuk.
   3. Druk op het stuk stevig op een microscoopglaasje.
   4. Vul de put naar de top met oplossing-2.
   5. Het stuk weefsel van de micro-buis overbrengen naar het midden van de put.
   6. Plaats een dekglaasje aan op de bovenkant van de put zodat de onderkant van het dekglaasje aan wordt bevochtigd met oplossing-2 is met een boete-tipped Tang.
   7. Monteer het Sykes Moore kamer met het weefsel op het podium van de confocal microscoop.

5. confocale microscopie

1. Brengen het weefsel in de zaal in beeld met een 10 x doelstelling.
2. Het stadium van de Microscoop omhoog en omlaag door het brandvlak voor het meten van de afstand tussen de bovenkant en de onderkant van het weefsel.
3. Het podium in 2,5 µm stappen voor het verzamelen van een confocal afbeeldingsbestand met een reeks van beelden door het weefsel van boven naar beneden verplaatsen.

6. de omkering van de Clearing

1. De clearing omkeren door het weefsel te brengen naar een micro-buis met > 20 x de hoeveelheid 100% ethanol. Om 1 h vervangen intervallen met 70% ethanol, en vervolgens 50% ethanol en ten slotte PBS. Bewaren bij 4 ° C in het donker.
   Opmerking: Nu verwerken de weefsels voor het insluiten van de standaard paraffine, vectorafbeeldingsbestanden en histologische of immuno-histochemische kleuring.

7. deconvolutie

Opmerking: Voor de volgende stappen, software opdrachten, Tabs en drop-down menu's zijn cursief weergegeven.

1. Start van de deconvolutie software en open het afbeeldingsbestand.
2. Voer parameters vermeld in het venster'Summary'.
   1. Voor 'spaties Voer de voxel x-, y- en z-afmetingen in µm.
   2. Selecteer voor elk kleurkanaal, de fluorescente kleurstof gebruikt voor de immunokleuring van de drop-down menu.
   3. Voor de 'modaliteit ', selecteer Confocale Laser Scanning in het drop-down menu.
   4. Voor de 'objectief, selecteer 10 x in het drop-down menu.
   5. Voor de 'onderdompeling Medium', lucht selecteren uit het drop-down menu.
   6. Klik op de 'Toepassen ' knop.
3. Klik op het tabblad'Deconvolution'.
4. Klik op '3D deconvolutie ' in het drop-down menu.
5. In de '3D - deconvolutie ' venster verzekeren dat de instellingen zijn: 1) adaptieve PSF Blind, 3) gebruik (standaard Adaptive PSF 10 iteraties, Medium lawaai), 2) theoretische PSF 4) Base naam.
6. Klik op de 'groene sortie knop ' om het programma te starten.
7. Wanneer u klaar bent, herhaal stap 7.3-7.6 het programma opnieuw te starten. Wanneer u klaar bent voor de derde en laatste keer het programma opnieuw.
8. In de 'Data Manager' venster, klik op het bestand voorafgegaan door "10-10 - 10-".
9. Klik op de 'bestand ' tab, klik op 'Opslaan als.
10. Selecteer in het venster'Save As' '8-bits geheel getal zonder voorteken ' van de 'gegevenstype ' drop-down menu en klik op opslaan.

8. de beeldverwerking

1. Fiji software starten.
   1. Klik op 'bestand ', klik op 'Open' en selecteer het afbeeldingsbestand Deconvolved en klik op de 'Open' knop in de 'Open' venster.
   2. Klik op 'kanalen Image/kleur/splitsen en omzetten de drie kleuren afbeelding bestand in drie nieuwe bestanden die slechts één kleur bevatten. Sla het afbeeldingsbestand rode dat de immunolabeled villous capillaire afbeelding set bevat. De groene en blauwe afbeeldingsbestanden verwijderen.
   3. De fluorescentie van de achtergrond van de rode beeldbestand met aftrekken: 'proces/Subtract achtergrond '.
   4. Stel in het drop-down menu Rolling ball straal in op 10 pixels.
   5. Laat de 4 menuopties uitgeschakeld en klik op 'OK'.
   6. Klik op 'Ja in het menu van de proces Stack.
   7. Verwijderen van inherente weefsel fluorescentie (autofluorescence) door het openen van de 'Image/aanpassen/Helderheid-Contrast' menu en het minimum, maximum, helderheid en contrast instellen. Wees voorzichtig niet te verwijderen om het even welk van de capillaire immunofluorescentie.
   8. Minimaliseren resterende irrelevant fluorescentie door het openen van de 'Image/aanpassen/drempel ' menu en de schuifregelaars aan te passen zodat de capillaire immunofluorescentie wordt gemarkeerd. Controleer de 'donkere achtergrond ' vak en klik op 'Toepassen '. Op de 'converteren naar binaire vervolgkeuzelijst ' menu check de 'zwarte achtergrond ' vak en klik op 'OK'. Sla het bestand van de zwart-wit (binaire) beeld voor analyses hieronder.

9. analyse

1. Object tellen en Skeletonization.
   1. Selecteer de binaire image-bestand dat is gemaakt in stap 8.1.8.
   2. Klik op 'analyseren/3D OC Options en controleer alleen 'Volume' en 'winkel resultaten...' vakken in het drop-down menu. Verzekeren dat het vak 'Toon toegangsnummers' aangevinkt is. Klik op de 'OK' knop.
   3. CLIck op 'analyseren/3D objecten teller '. Stel in het drop-down menu, "grootte Filter: Min.' op 5000. Verzekeren dat de 'uitsluiten objecten op randen selectievakje is uitgeschakeld. Controleer of de 'ObjectsStatistieken en 'Samenvatting ' selectievakjes zijn ingeschakeld. Klik op de 'OK' knop.
      Opmerking: Dit kan enige tijd duren afhankelijk van de grootte en computer configuratie bestand.
   4. Sla de tabel met statistieken en het toewijzingsbestand op objecten.
   5. Selecteer het bestand van de kaart objecten. Klik op 'Plugins/skelet/Skeletonize 2D-3D' tot skeletonize van de capillaire netwerk in het binaire bestand. Klik op 'bestand/opslaan als. Selecteer 'Tiff...' in het drop-down menu. In het opslaan als TIFF-venster toevoegen "Skel-" u object de naam van het bestand van de kaart en klik op de 'Opslaan ' knop.
   6. Klik op 'analyseren/skelet/analyseren skelet 2D-3D'. Accepteer de standaardinstellingen in het drop-down menu en klik op de 'OK' knop. Sla de tabel tak 'informatie' , de ' uitslagen , en twee uitvoerbestanden (Skel-objecten-label - skeletten en Tagged skelet).

Results

De gegenereerde 3D renderings van de haarvaten in clusters van terminal villi in menselijke placenta vanaf 8 weken zwangerschapsduur tot termijn levering waren geteld als individuele clusters en skeletonized voor netwerkanalyse. De functionele eenheden van de placenta (Figuur 1A) zijn de villosités bomen die een uitbreiding van oppervlakte schepen waar ze de placenta parenchym (Figuur 1Ben uitgeb...

Discussion

De institutionele Review Board goedgekeurd de collectie van placenta villous weefsels voor fixatie van formaline van electively beëindigd zwangerschappen. Voordat de procedures werden uitgevoerd, een kort overzicht van het medisch dossier genoteerd maternale leeftijd, pariteit, en bevestigde de afwezigheid van eventuele onderliggende medische (b.v., hypertensie, diabetes en lupus) of foetale (structurele of chromosomale afwijkingen, abnormale groei) werd uitgevoerd. De technische fiche en elke verzamelde monster...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Formaldehyde-oplossing (w/v) in waterige fosfaatbuffer	Macron Fine Chemicals	H-121-08	Algemeen fixeermiddel, gebruiksklare formule, gebruik met voorzichtigheid omdat dampen giftig zijn
Scalpelmesjes	ThermoFisher Scientific	08-916-5B No. 11
Scalpel	ThermoFisher Scientific	08-913-5
Fijne pincet	Electron Microscopy Services	78354-119
Microbuis (1,7 mL)	PGC Scientifics	505-201
Fosfaat buffered saline	Sigma	D8537	PBS
Pipet	VWR	52947-948	wegwerp, 3ml overdracht pipet
Triton X-100	Boehriner Mannheim	789 704	Verdun tot 0,1% vanuit voorraad
Geitenserum	Gibco	16210-064	Verdun tot 2% in PBS oplossing
Muis monoklonale anti-ck7 Keratine 7 Ab-2 (Clone OV-TL 12/30)	ThermoFisher Scientific	MS-1352-RQ
Konijn Anti-CD31 antilichaam	Abcam	ab28364
Groen lichtgevend (520 nm) fluorochroom	Invitrogen	A11017	Alexa-Fluor 488
Infrarood lichtgevend (652 nm) fluorochroom	Invitrogen	A21072	Alexa Fluor 633
Ethanol alcohol 200 proof	Pharmco-Aaper	111000200	Verdun tot lagere concentraties met PBS indien nodig
Oplossing-1	Visikol Inc.		Visikol Histo-1
Oplossing-2	Visikol Inc.		Visikol Histo-2
Skyes-Moore kamers	BellCo Glass Inc.	P/N 1943-11111
25 gauge naald	ThermoFisher Scientific	14-826AA	BD Precision Glide Nadelen
3 mL spuit	ThermoFisher Scientific	14-823-40	BD wegwerpspuit
PDMS siliconen vellen	McMaster-Carr	P/N 578T31
confocale microscoop	Nikon Inc.		Nikon C1 Confocal Microscoop
Deconvolutie software	Media Cybernetics		AutoQuant X22
Fiji beeldverwerkingssoftware			gratis, open source  software beschikbaar op https://fiji.sc
Hematoxyline	Leica Biosystems	3801570	Component 1 van SelecTech H&E kleuringssysteem
Alcoholische Eosine	Leica Biosystems	3801615	Component 2 van SelecTech H&E kleuringssysteem
Blauwe Buffer	Leica Biosystems	3802918	Component 3 van SelecTech H&E kleuringssysteem
Aqua Define MCX	Leica Biosystems	3803598	Component 4 van SelecTech H&E kleuringssysteem
Immunohistochemische detectiesysteem	ThermoFisher Scientific	TL-125-QHD	UltraVision Quanto Detectie Systeem HRP DAB