Driedimensionale weergave en analyse van Immunolabeled, verduidelijkt menselijke placenta Villous vasculaire netwerken

Summary

Deze studie geeft een protocol voor het omkeerbare weefsel clearing, immunokleuring, 3D-rendering en analyse van vasculaire netwerken in menselijke placenta villi monsters over de volgorde van 1-2 mm,³.

Abstract

Nutriënt en gas uitwisseling tussen moeder en foetus treedt op op het grensvlak van de maternale intervillous bloed en het grote villous capillaire netwerk dat een groot deel van de parenchym van de menselijke placenta maakt. De distale villous capillaire netwerk is het eindpunt van de foetale bloedtoevoer na meerdere generaties vertakking van vaartuigen uit afkomstig uit de navelstreng uit te breiden. Dit netwerk heeft een aaneengesloten cellulaire schede, de syncytieel trofoblast barrière laag, waardoor de vermenging van foetaal bloed en het moederlijke bloed waarin het continu baadt. Beledigingen aan de integriteit van de placenta capillaire netwerk, die zich in wanorde zoals moeders diabetes, hoge bloeddruk en obesitas, hebben gevolgen die aanwezig ernstige gezondheidsrisico's voor de foetus, kinder-, en volwassen. Als u wilt beter definiëren de structurele effecten van deze beledigingen, werd een protocol ontwikkeld voor deze studie die vangt capillaire netwerkstructuur volgorde van 1-2 mm³ waarin een topologische landschapskenmerken in zijn volledige complexiteit kan onderzoeken. Om dit te bereiken, clusters van terminal villi van placenta worden ontleed en de trofoblast-laag en de capillaire endothelia zijn immunolabeled. Deze monsters worden vervolgens verduidelijkt met een nieuw weefsel clearing proces dat het mogelijk maakt te verwerven van de confocal afbeeldingsstapels naar z-diepten van ~ 1 mm. De driedimensionale renderings van deze stapels worden vervolgens verwerkt en geanalyseerd voor het genereren van capillaire basisnetwerk maatregelen zoals volume, aantal capillaire takken en capillaire vertakkingspunten einde, als bevestiging van de geschiktheid van deze aanpak voor de karakterisering van het capillaire netwerk.

Introduction

Ons begrip van de ontwikkeling van de placenta en de pathologieën is, in belangrijke mate beperkt tot ruimtelijke relaties tussen aangrenzende villi en ingeperkt haarvaten afgeleid van histologische secties afgeleid. In dit onderzoek hebben we deze kwestie door de ontwikkeling van de middelen voor het genereren van driedimensionale (3D) renderings van menselijke placenta capillaire netwerken die geschikt voor analyses van capillaire netwerkfuncties (bijvoorbeeld vertakking zijn, stevigheid). Om dit te doen hebben wij gecombineerd immunefluorescentie kleuring met twee commerciële weefsel clearing producten, Visikol-1 en Visikol-2 (hierna aangeduid als oplossin....

Protocol

Dit protocol volgt de richtlijnen van New York Staatsinstituut voor fundamenteel onderzoek in ontwikkelingsstoornissen menselijke onderzoek ethisch comité.

1. villous boom dissectie

1. Spoel formaline vaste weefsel van de placenta met fosfaat afgeslepen zoutoplossing (PBS)¹⁴ tot en met de formaline verwijderen en plaatsen in een petrischaal op het podium van een dissectie Microscoop. Scalpel en fijne pincet gebruiken om pesten de placenta weefsel uit elkaar om te zoeken villous bomen (witte threadlike vertakkende structuren). Ontleden uit stukjes villosités boom (enkele mm lang) en het weefsel overbrengen in e....

Results

De gegenereerde 3D renderings van de haarvaten in clusters van terminal villi in menselijke placenta vanaf 8 weken zwangerschapsduur tot termijn levering waren geteld als individuele clusters en skeletonized voor netwerkanalyse. De functionele eenheden van de placenta (Figuur 1A) zijn de villosités bomen die een uitbreiding van oppervlakte schepen waar ze de placenta parenchym (Figuur 1Ben uitgeb.......

Discussion

De institutionele Review Board goedgekeurd de collectie van placenta villous weefsels voor fixatie van formaline van electively beëindigd zwangerschappen. Voordat de procedures werden uitgevoerd, een kort overzicht van het medisch dossier genoteerd maternale leeftijd, pariteit, en bevestigde de afwezigheid van eventuele onderliggende medische (b.v., hypertensie, diabetes en lupus) of foetale (structurele of chromosomale afwijkingen, abnormale groei) werd uitgevoerd. De technische fiche en elke verzamelde monster.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Formaldehyde solution (w/v) in aqueous phosphate buffer	Macron Fine Chemicals	H-121-08	General fixation agent, ready to use formula, use caution as vapors are toxic
Scalpel blades	ThermoFisher Scientific	08-916-5B No. 11
Scalpel	ThermoFisher Scientific	08-913-5
Fine forceps	Electron Microscopy Services	78354-119
Micro Tube (1.7 mL)	PGC Scientifics	505-201
Phosphate buffered saline	Sigma	D8537	PBS
Pipette	VWR	52947-948	disposable, 3ml transfer pipette
Triton X-100	Boehriner Mannheim	789 704	Dilute to 0.1% from stock
Goat Serum	Gibco	16210-064	Dilute to 2% in PBS solution
Mouse monoclonial anti-ck7 Keratin 7 Ab-2 (Clone OV-TL 12/30)	ThermoFisher Scientific	MS-1352-RQ
Rabbit Anti-CD31 antibody	Abcam	ab28364
green emitting (520 nm) fluorochrome	Invitrogen	A11017	Alexa-Fluor 488
infrared emitting (652 nm) fluorochrome	Invitrogen	A21072	Alexa Fluor 633
Ethanol alcohol 200 proof	Pharmco-Aaper	111000200	Dilute down to lower concentrations using PBS as needed
Solution-1	Visikol Inc.		Visikol Histo-1
Solution-2	Visikol Inc.		Visikol Histo-2
Skyes-Moore chambers	BellCo Glass Inc.	P/N 1943-11111
25 gauge needle	ThermoFisher Scientific	14-826AA	BD Precision Glide Needes
3 mL syringe	ThermoFisher Scientific	14-823-40	BD disposable syringe
PDMS silicon sheets	McMaster-Carr	P/N 578T31
confocal microscope	Nikon Inc.		Nikon C1 Confocal Microscope
Deconvolution software	Media Cybernetics		AutoQuant X22
Fiji image processing software			free, Open source  software available at https://fiji.sc
Hematoxylin	Leica Biosystems	3801570	Component 1 of SelecTech H&E staining system
Alcoholic Eosin	Leica Biosystems	3801615	Component 2 of SelecTech H&E staining system
Blue Buffer	Leica Biosystems	3802918	Component 3 of SelecTech H&E staining system
Aqua Define MCX	Leica Biosystems	3803598	Component 4 of SelecTech H&E staining system
Immunohistochemistry detection system	ThermoFisher Scientific	TL-125-QHD	UltraVision Quanto Detection System HRP DAB