Methodenartikel

Bouw van synthetische Phage weergegeven Fab bibliotheek met op maat gemaakte diversiteit

14.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57357

⸱

1 mei 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Antibody Engineering, Shanghai Institute for Advanced Immunochemical Studies, ShanghaiTech University, 2Banting and Best Department of Medical Research, Terrence Donnelly Center for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto, 3Department of Molecular Genetics, Terrence Donnelly Center for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde procedure voor de bouw van een bibliotheek van synthetische antilichaam faag-weergegeven met op maat gemaakte diversiteit. Synthetische antilichamen hebben brede toepassingen van fundamenteel onderzoek om de diagnose van de ziekte en therapeutics.

Samenvatting

Vraag naar monoclonal antilichamen (mAbs) in fundamenteel onderzoek en geneeskunde groeit jaarlijks. Hybridoma technologie is de dominante methode voor mAb development sinds haar eerste verslag in 1975. Als een alternatieve technologie zijn faag display methoden voor mAb ontwikkeling steeds aantrekkelijker omdat Humira, het eerste faag afkomstige antilichaam en één van de best verkochte mAbs, goedgekeurd voor de klinische behandeling van reumatoïde artritis in 2002. Als een proefdiervrije mAb ontwikkeling technologie gebaseerde, mijdt faag display antigeen immunogeniciteit, humanisering en dierlijke onderhoud die worden vereist van de ontwikkeling van het antilichaam van de technologie op basis van traditionele hybridoma. In dit protocol beschrijven we een methode voor de bouw van synthetische faag-weergegeven Fab bibliotheken met diversiteit van 109-1010 verkrijgbaar met een enkel electroporation. Dit protocol bestaat uit: 1) hoogrendabele electro-bevoegde cel voorbereiding; 2) extractie van uracil-bevattende single-stranded DNA (dU-ssDNA); 3) Kunkel methode gebaseerd oligonucleotide gerichte mutagenese; 4) electroporation en berekening van de grootte van de bibliotheek; 5) eiwit A/L gebaseerde enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) voor het vouwen en functionele diversiteit evaluatie; en 6) DNA sequentieanalyse van diversiteit.

Inleiding

mAbs heeft brede toepassingen variërend van fundamenteel onderzoek tot de diagnose van de ziekte en therapeutics. Vanaf 2016 zijn meer dan 60 mAbs goedgekeurd door de Amerikaanse Food and Drug Administration (USFDA) voor de klinische behandeling van auto-immuunziekten, kanker en infectieziekten1,2.

In 1975 rapporteerde Kohler en Milstein een techniek voor de continue generatie van antilichamen van een enkele klonen specificiteit van een cellulaire bron aangeduid als 'hybridomas' en deze techniek is later uitgegroeid tot een hoeksteen in geneeskunde en industrie3 ,4. Generatie van mAbs door deze methode vereist een paar stappen, met inbegrip van de productie van antigeen muis immunisatie, winning van B-lymfocyten, fusie van B-cellen met myeloma cellen vormen onsterfelijke hybridoma cellen, selectie van de kloon, en voor therapeutische toepassingen, humanisering is vereist om te voorkomen dat menselijke anti-muis-antilichamen (HAMA)4,5. Echter, voor deze technologie, antigenen met inbegrip van toxines, pathogenen en zeer geconserveerde eiwitten zijn relatief niet effectief in het genereren van een immuunrespons in vivo voor mAb productie5.

In 1978 gemeld Hutchison et al. het gebruik van een oligonucleotide aan directe mutagenese van een residu in een single-stranded bacteriofaag virus6. In 1985, Smith gemeld dat buitenlandse gene fragmenten kunnen worden gesmolten in het frame met het gen codering faag vacht eiwit III en kunnen dus worden weergegeven op het oppervlak van de bacteriofaag zonder afbreuk te doen aan haar infectiviteit7. Deze baanbrekende werken een basis gelegd voor de latere aanleg van phage-weergegeven antilichaam bibliotheken in immuun, naïef, en synthetische vormt met de formaten van single-keten variabele fragment (scFv) en antigeen-bindende fragment (Fab) voor therapeutische mAb development8,9. Van de technisch oogpunt, de ontwikkeling van het antilichaam weergave gebaseerde van de bacteriofaag biedt een complementaire benadering van hybridoma gebaseerde mAb ontwikkeling dat bijdragen kan tot het omzeilen van de beperkingen die sommige antigenen kunnen opleveren en de humanisering proces dat hybridoma afkomstige antilichamen vereisen vaak5. Vanaf 2016, 6 faag display afkomstige mAbs zijn goedgekeurd in de markt met inbegrip van Humira, een van de meest succesvolle mAbs gebruikt voor de behandeling van reumatoïde artritis, en vele faag display afkomstige antilichaam kandidaten zijn momenteel in diverse stadia van klinische onderzoek10.

Voor immuun- en naïef faag antilichaam bibliotheken, de diversiteit van complementariteit-bepalen regio's (CDR) in lichte en zware keten is afgeleid van het natuurlijke immuunsysteem repertoire (d.w.z., van B-cellen). De diversiteit van CDR in synthetische faag antilichaam bibliotheken is daarentegen volledig kunstmatige. Synthetische benaderingen van bibliotheek bouw bieden nauwkeurige controle over het ontwerp van de reeks diversiteit en bieden mogelijkheden voor mechanistische studies van antilichaam structuur en werken11,12. Bovendien kan het kader voor synthetische bibliotheken worden geoptimaliseerd voor bibliotheek bouw om stroomafwaarts, grootschalige industriële ontwikkeling11,12.

In 1985, Kunkel rapporteerde een single-stranded DNA (ssDNA) mutagenese sjabloon gebaseerde benadering om plaats-geleide mutaties in M13 bacteriofaag efficiënt13. Deze aanpak werd vervolgens op grote schaal gebruikt voor de bouw van bibliotheken faag-weergegeven. Chemisch gesynthetiseerd DNA oligonucleotides ontworpen om diversiteit in Fab CDR worden opgenomen in een phagemid met een antilichaam ruggengraat sjabloon. In dit proces, de phagemid wordt uitgedrukt als een uracil-bevattende ssDNA (dU-ssDNA) en de oligonucleotides worden gegloeid op de CDR en verruimd en double-stranded DNA (dsDNA) in aanwezigheid van DNA van T7 polymerase en T4 DNA ligase synthetiseren. Tot slot kan gegenereerde ds-DNA in Escherichia coli door electroporation worden binnengebracht.

Voor hoge diversiteit, faag-weergegeven bibliotheek bouw, hoog-voltage electroporation van een tweecomponenten mengsel van electro-bevoegde cellen en covalent moet gesloten circulaire dsDNA (CCC-dsDNA) zorgvuldig worden voorbereid. Sidhu et al. bewerkt voor de bereiding van electro-bevoegde cellen en DNA op basis van traditionele methoden en sterk verbeterde bibliotheek diversiteit14.

In dit protocol beschrijven we een methode voor de bouw van synthetische faag-weergegeven Fab bibliotheken met diversiteit van 109-1010 verkrijgbaar met een enkel electroporation. Figuur 1 toont een overzicht van de bibliotheek bouw waaronder: 1) hoogrendabele electro-bevoegde cel voorbereiding; 2) extractie van dU-ssDNA; 3) Kunkel methode gebaseerd oligonucleotide gerichte mutagenese; 4) electroporation en berekening van de grootte van de bibliotheek; 5) eiwit A/L gebaseerde ELISA voor het vouwen en functionele diversiteit evaluatie; en 6) DNA sequentieanalyse van diversiteit. In de materiaal tabelstaan alle reagentia, stammen en apparatuur. Tabel 1 toont de reagens setup.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Opmerking: Filter steriele tips moeten gebruikt worden tijdens bij de behandeling van phage om verontreiniging Pipetteer pistool te omgeving te voorkomen. Aseptische gebied of kap moet worden gebruikt bij behandeling met bacteriën en phage experimenten. Phage experiment gebied moet worden schoongemaakt met behulp van 2% natrium dodecyl sulfaat (SDS) gevolgd door 70% ethanol faag verontreiniging te vermijden. Voor het maken van seriële verdunningen in dit protocol, nieuwe tips dient voor elke verdunning.

1. E. Coli SS320 Electro-bevoegde cel voorbereiding

  1. Vooraf warm LB/tet agarplaat (voorbereid en opgeslagen bij 4 ° C voor minder dan 1 - week oud) bij 37 ° C incubator voor 1 h. gebruiken een steriele inoculatie lus of steriele tip aan streak uit een voorraad van glycerol van E. coli SS320 cellen op de voorverwarmde LB/tet agar bord in een zigzag-anker direc tion zachtjes langs het oppervlak van de plaat. Incubeer de plaat bij 37 ° C incubator's nachts voor ongeveer 12-15 h.
  2. De volgende dag, gebruik een steriele inoculatie lus of steriele tip om te kiezen van een goed gescheiden één kolonie langs de zig-zag-lijn en enten in 10 mL voor 2YT/tet medium in een 50mL ronde onderkant-buis door dompelen de lus in het medium en kort te roeren.
  3. Incubeer bij 37 ° C met schudden bij 200 omwentelingen per minuut gedurende ongeveer 3-4 uur tot OD600 is bereikt op rond 0,4-0,8 (log fase groei). Monitor OD600 bij 2 h. Tijdens deze periode, warme vooraf 5 LB/tet agar platen (voorbereid en opgeslagen bij 4 ° C voor minder dan 1 - week oud) in een incubator 37 ° C gedurende ten minste 1 uur.
  4. Toevoegen van 20 μL M13KO7 helper faag uit lab voorraad met titer rond 1 x 1013 kolonievormende eenheid (cfu) /mL in 180 μL van steriele 1 X PBS in gesteriliseerde met autoclaaf 1.5-mL buizen te bereiden 10 tienvoudige seriële verdunningen.
  5. Aliquot 4 mL gesteriliseerde met autoclaaf en vloeibare 2YT top agar in 5 X 14 mL ronde onderkant buizen, label van elke buis met een verdunning van het vijfde tot het negende van het tienvoudige verdunning, respectievelijk, en broeden in een incubator 65 ° C te handhaven van de 2YT top agar in de vloeibare toestand.
  6. Mix 500 μL van log fase E. coli SS320 cellen in de buis van de verdunning M13KO7 (Kies de vijfde tienvoudige verdunning naar de negende tienvoudige verdunning) en broeden in een incubator 37 ° C gedurende 5-10 minuten.
  7. Tijdens de incubatie van stap 1.6, 2YT top agar van stap 1.5 overbrengen naar kamertemperatuur (RT) om af te koelen gedurende ongeveer 5 minuten tot ongeveer 42 ° C. Innerlijke pols gebruiken voor het testen van de temperatuur van de bovenste agar 2YT; het moet als vloeistof. Elke verdunning mengsel van stap 1.5 overbrengen aan elke overeenkomstige 2YT top agar buis. Draai de deksel van elke buis en meng door het draaien ondersteboven meermaals zacht en kort te vermijden zeepbel generatie.
  8. Zorgvuldig giet van ieder mengsel langs de rand van een vooraf warm LB/tet agarplaat (uit stap 1.3) en hellen de plaat iets om volledig en gelijkmatig de plaat te vullen met het mengsel terwijl het vermijden van de invoering van bubbels. Houd de platen op RT voor ongeveer 5-10 min om de hoogste agar binnen elke plaat stollen en Incubeer de platen van de bovenste agar 2YT bij 37 ° C's nachts voor ongeveer 15-18 h.
  9. Kies de plaat verdunning na overnachting groei vanaf stap 1.8 met rond 100-200 middelgrote, single, goed gescheiden platen voor inoculatie van de plaque. Gebruik één hand te houden de agarplaat tegen een lichtbron, alsmede de andere kant te houden van een pipet pistool geladen met een lang steriel pipet-tip om verticaal stab in de bovenste agar, en het verzamelen van een enkelvoudige en goed gescheiden plaque.
    1. Hellen de pipet tip lichtjes van elkaar te scheiden van de bovenste agar met plaque. Pipetteer op en neer meerdere malen te verjagen van de agar met plaque in een ronde bodem van 14 mL cultuur buis voorgeladen met 1 mL van 2YT/kan/tet medium (Zie tabel 1).
    2. Herhaal deze procedure om het kiezen van 3-5 plaques in totaal. Het doel van het plukken van de verschillende platen is om succesvolle inoculatie, zoals een plaquette te flauw en relatief klein in vergelijking met een kolonie bacteriën. Groeien de plaques gedurende 8 uur bij 37 ° C met schudden bij 200 omwentelingen per minuut.
  10. Overdracht van een buis van het kweken van cultuur in 50 mL voor 2YT/kan/tet medium in een maatkolf van 250 mL verbijsterd. Groeien bij 37 ° C met schudden bij 200 rpm's nachts gedurende ongeveer 12 uur.
  11. Drie 2-L verbijsterd kolven met 900 mL van superbroth/tet/kan medium, elk met 5 mL van de overnachting cultuur worden geënt. Incubeer bij 37 ° C met schudden bij 200 t/min voor 6-7 h OD600 rond 0.6-0.8.
  12. Chill de drie kolven van bacteriecultuur in een ijsbad voor 5 min met zachte constante wervelende met de hand. De volgende stappen moeten gebeuren in een koude kamer, op ijs, met prechilled oplossingen en apparatuur.
  13. Gebruik van absorptie weefsel handdoek drogen het buitenste glas van iedere kolf; Gebruik één hand om te hellen de fles 1-L gesteriliseerde met autoclaaf centrifuge op de Bank en de andere hand te giet het medium zachtjes uit elke kolf in elke fles centrifuge.
  14. Draai bij 5.000 × g en 4 ° C gedurende 10 minuten om de bacteriën. pellet
  15. Na centrifugeren, decanteren zachtjes de bovendrijvende substantie in een gesteriliseerde met autoclaaf afval bekerglas van 5-L.
  16. Elke fles vullen met 100 mL steriele gefiltreerd 1,0 mM HEPES, pH 7.4, en voeg een gesteriliseerde met autoclaaf magnetische roer bar aan elke fles om te helpen bij pellet resuspensie van 200 toeren per minuut. Swirl en verjagen de hele pellet van de muur van de fles iedere enkele minuten tijdens de magnetische roeren. Zodra de pellet is opgelost, vul elke fles met een extra 400 mL steriele gefiltreerd 1,0 mM HEPES, pH 7.4.
  17. Centrifugeer bij 5.000 × g en 4 ° C voor 10 min. Decant het supernatant, behoud van de roer-bar in de fles.
  18. Herhaal stap 1.16 aan 1.17 eens.
  19. Resuspendeer elke pellet in steriele-gefilterd, 10% ultrazuiver glycerol 500 mL met behulp van de roer-bars. Swirl en verjagen de hele pellet van de muur van de fles iedere enkele minuten tijdens de magnetische roeren.
  20. Centrifugeren en decanteren zoals in stap 1.17. Herhaal stap 1.19 eens. Gebruik lange arm gesteriliseerde met autoclaaf pincet te verwijderen van de roer-bar.
  21. Centrifugeer bij 5.000 × g- en 4 ° C gedurende 15 min. Decant het supernatant en verwijder eventuele resterende sporen van supernatant van elke fles van de centrifuge met een pipet.
  22. 3,0 mL 10% ultrazuiver glycerol toevoegen aan één fles en zachtjes resuspendeer de pellet door pipetteren. Spoel de suspensie tot de volgende fles en herhaal tot alle van de pellets zijn geresuspendeerde en gecombineerd in één fles. Ongeveer 6 mL sterk geconcentreerde cellen worden verkregen met een titer van ongeveer 3 x 1011 cfu/mL.
  23. Vooraf chill 1.5-mL gesteriliseerde met autoclaaf microcentrifuge buizen en een buis van de 96-Wells opbergdoos zonder scheidingswand bij-80 ° C gedurende ten minste 1 uur voordat u deze stap. Draagt de vooraf gekoeld microcentrifuge buizen aan de koude kamer op ijs voordat pipetteren aliquots van de celsuspensie pellet. Gebruik een pipet aan aliquoot 350 μL van celsuspensie in elke 1,5 mL microcentrifuge buis.
  24. Breng de aliquots in een schuim doos container gevuld met vloeibare stikstof voor flash bevriezing (3-5 min).
    1. Vervoer van het schuim doos met vloeibare stikstof naar een vriezer-80 ° C (zie stap 1.23).
    2. Verwijderen van de 1.5-mL microcentrifuge buis opbergdoos uit de diepvries-80 ° C (zie stap 1.23) en zet op ijs.
    3. Snel gebruiken een metalen gaas te zeef de aliquots van vloeibare stikstof en plaats ze in de buis opbergdoos. Winkel bij-80 ° C.
      Let op: De vloeibare stikstof kan brandwonden veroorzaken en moet worden gezorgd voor de bescherming van de veiligheid. Gebruik een Fab ruggengraat phagemid om de efficiëntie van de bereid electro-bevoegde cellen (de Fab ruggengraat phagemid voorraad moet in ultrazuiver (MilliQ) water bij 400 ng/µL) te controleren. Ontdooi de Fab ruggengraat phagemid in 10 µL ultrazuiver water 1 μg en een hoeveelheid 350 μL van electro-bevoegde SS320 op ijs, en prechill een cuvet electroporation 0,2 cm tussenruimte op het ijs.
  25. De 350 μL electro-bevoegde SS320 cellen toevoegen aan de 10 µL DNA na het ontdooien en meng door het meerdere malen pipetteren terwijl het mengsel op het ijs. Vermijd invoering van bubbels.
  26. Vooraf warm 15 mL SOC voedingsbodem in een 50mL-buis in een waterbad 37 ° C gedurende ten minste 30 minuten voordat electroporation. Het mengsel van 360 μL overbrengen in de meetcel en electroporation na instructies van de fabrikant uit te voeren.
  27. Onmiddellijk de cellen na electroporation door toevoeging van 1 mL voorverwarmde SOC voedingsbodem (uit stap 1,27) en pipetteren te redden. Het medium van de Cuvet overbrengen in een vooraf geladen met 5 mL voorverwarmde SOC. kolf van 125 mL
  28. Spoel de cuvette tweemaal, telkens met 1 mL van voorverwarmde SOC medium en het medium overbrengen in de kolf van 125mL (zie stap 1,27). Voeg voorverwarmde SOC middellange tot een eindvolume van 10 mL de maatkolf van 125mL.
  29. Incubeer de celcultuur van 10 mL gedurende 30 minuten bij 37 ° C met schudden bij 200 omwentelingen per minuut.
  30. Seriële verdunningen om de efficiëntie van de transfectie en M13KO7 pre besmettingstarief maken
    1. Gebruik een pipet meerkanaals 180 μL van 2YT media toevoegen aan elk putje van één kolom van een 96-microwell-plaat.
    2. Maken 8 vertienvoudigd seriële verdunningen: overdracht 20 μL van cultuur uit stap 1.29 aan het eerste putje van de plaat, mix door pipetteren en overdracht 20 μL van het mengsel naar het volgende goed. Herhaal deze stap tot het einde van de seriële verdunning.
    3. Plaat 10 μL van elke seriële verdunning op de LB/carb, LB/kan en LB/tet platen in tweevoud.
    4. Na een nacht bebroeden bij 37 ° C.
    5. Efficiëntie berekeningsformule: veronderstel dat M het nummer van de gemiddelde kolonie gerekend vanaf de verdunde vouw 10N is (N is van 1-8). De E. coli SS320 electro-bevoegde cel transfectie efficiëntie van de phagemid van de Fab ruggengraat van LB/carb plaat is gelijk aan M X 10N + 3 cfu/µg. De M13KO7 pre besmettingstarief naar schatting van de verhouding van de kolonies in LB/kan en LB/tet. Het percentage van E. coli SS320 bevoegde cellen transfected met de Fab ruggengraat phagemid naar schatting van de verhouding van de kolonies in LB/carb en LB/kan.

2. voorbereiding Uracil-bevattende ssDNA (dU-ssDNA) uit de sjabloon Phagemid

Opmerking: A eerder gemeld Fab ruggengraat phagemid werd gebruikt als de sjabloon voor de dU-ssDNA voorbereiding15. De architectuur van de Fab ruggengraat phagemid is afgebeeld in Figuur 2. Een plasmide spin kit (QIAprep Spin M13) wordt gebruikt voor de winning van dU-ssDNA met lichte wijzigingen.

  1. Vooraf warm een LB/cmp-plaat (voorbereid en opgeslagen bij 4 ° C voor minder dan 1 - week oud) in een 37 ° C incubator voor 1 h. Streak uit een voorraad van glycerol van E. coli CJ236 cellen (of een andere stam van de dut−/ung−) met steriele lussen of tips op de voorverwarmde LB/cmp-bord. Incubeer de plaat bij 37 ° C's nachts voor ongeveer 12-15 h.
  2. Kies een één kolonie met een steriele tip en enten in 2 mL van 2YT/cmp medium in een 14-mL polypropyleen ronde-onderkant-buis.
  3. Incubeer het medium bij 37 ° C met schudden bij 200 t/min voor 3-4 h tot OD600 is bereikt op rond 0,4-0,8 (log fase groei).
  4. 5-10 μl faag van Fab ruggengraat sjabloon toevoegen in de cultuur en Incubeer bij 37 ° C met schudden bij 200 omwentelingen per minuut gedurende 30 minuten om faag infectie.
  5. Na incubatie, gebruiken een steriele tip aan streak uit 10 μL van cultuur op een voorverwarmde LB/carb-bord bij 37 ° C. Incubeer bij 37 ° C's nachts voor ongeveer 12-15 h.
  6. Kies een één kolonie van de E. coli CJ236 met Fab ruggengraat phagemid een starter cultuur van 3 mL 2YT/carb/cmp in een polypropyleen ronde-onderkant-buis van 14 mL beënten, en groeien bij 37 ° C met schudden bij 200 rpm's nachts gedurende ongeveer 12 uur.
  7. Beënt de 0.3 mL starter cultuur in 30 mL 2YT/carb/cmp in een verbijsterd fles van 250 mL.
  8. Incubeer de celcultuur bij 37 ° C met schudden bij 200 t/min voor 3-4 h tot OD600 is bereikt op rond 0,4-0,8 (log fase groei).
  9. Toevoegen van de M13KO7 (lab voorraad, titer van ongeveer 1 x 1013 cfu/mL) aan de cultuur van stap 2.8 met een menigvuldigheid van infectie (MOI) van ongeveer 10 en de laatste titer van M13KO7 is ongeveer 1 x 1010 cfu/mL.
  10. Incubeer bij 200 rpm en 37 ° C gedurende 1 uur.
  11. Pellet de cultuur door in een 50 mL ronde-onderkant-buis bij 5.000 × g en 25 ° C gedurende 20 minuten centrifugeren.
  12. Giet het supernatant en resuspendeer de pellet met 30 mL verse 2YT/carb/kan/uridine. Breng de hersuspensie in een nieuwe verbijsterd fles van 250 mL.
  13. Incubeer bij 200 rpm en 25 ° C voor 22-24 h.
  14. De cultuur van stap 2.13 overboeken naar een ronde-onderkant-buis van 50 mL en de cultuur bij 12.000 × g gedurende 20 minuten centrifugeren om te scheiden van de bacteriofaag supernatant van de bacteriële cel pellet. Breng de bacteriofaag supernatant in een nieuwe ronde onderkant-buis van 50 mL en voeg 1/5 het eindvolume van PEG/NaCl oplossing te precipiteren de bacteriofaag. Meng goed en incubeer op ijs voor 30 min te precipiteren de phage deeltjes.
  15. Centrifugeer bij 12.000 × g en 4 ° C gedurende 30 min. Decant het supernatant en centrifugeer bij 4.000 × g- en 4 ° C gedurende 2 min. gecombineerd het resterende supernatant.
  16. Resuspendeer de pellet bacteriofaag in 2 mL steriele gefiltreerd 1 X PBS en transfer naar 1.5-mL microcentrifuge buizen. Centrifugeer bij 12.000 × g gedurende 5 min. in een benchtop microcentrifuge te verwijderen van alle resterende bacteriële puin en de bacteriofaag supernatant overbrengen naar nieuwe 1.5-mL microcentrifuge buizen en bewaren bij 4 ° C.
  17. Controleer de efficiëntie van de opneming uracil in E. coli CJ236 via side by side vergelijking met E. coli SS320.
    1. 180 μL van 2YT media toevoegen aan elk putje van één rij van een 96-wells-plaat.
    2. Maak tien 10-fold seriële verdunningen: 20 μL van de bacteriofaag supernatant overbrengen in het eerste putje van de plaat, Meng door pipetteren en overdracht 20 μL van het mengsel naar het volgende goed. Herhaal deze stap tot het einde van de seriële verdunning.
    3. 10 μL van bacteriofaag uit de laatste acht seriële verdunningen te infecteren 90 μL van E. coli CJ236 en E. coli SS320 in logboek fase toevoegen (OD600 = 0,4-0,8). Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten met zacht schudden.
    4. Plaat 10 μL van de seriële verdunning van elke infectie in E. coli CJ236 en E. coli SS320 op 2YT/Carb platen in tweevoud.
    5. Na een nacht bebroeden bij 37 ° C.
    6. Titer berekeningsformule: veronderstel dat M het nummer van de gemiddelde kolonie gerekend vanaf de verdunde vouw 10N is (N is van 1-10). De titer van E. coli CJ236 of E. coli SS320 is gelijk aan M X 10N + 2 cfu/mL. Schatten van de efficiëntie van uracil opneming van de verhouding tussen de titer van E. coli CJ236 en E. coli SS320.
  18. Voeg 1/100 volume van de bacteriofaag neerslag buffer MP in de bacteriofaag supernatant in 1.5-mL microcentrifuge buizen, en tover ondersteboven zachtjes om te mengen meerdere malen. Incubeer bij RT gedurende ten minste 2 min. Phage deeltjes zijn neergeslagen uit het kweekmedium, en dus een bewolkt oplossing op dit moment zichtbaar moet zijn.
  19. Toepassen op het monster uit stap 2.18 een plasmide spin kolom (bijvoorbeeldQIAprep) in een buis 1.5-mL microcentrifuge. De bindingscapaciteit van een spin kolom voor ssDNA kan bereiken ten minste 10 µg. Centrifuge op 6000 × g en 25 ° C gedurende 30 s in een benchtop-microcentrifuge. Gooi de doorstroom die in de 1.5-mL microcentrifuge buis. Phage deeltjes blijven gebonden aan de matrijs van de kolom in dit stadium.
  20. 0,7 mL van de UT-MLB faag lysis en bindende buffer (Zie discussie) toevoegen aan de kolom en Incubeer bij RT gedurende ten minste 1 min.  Centrifugeer bij 6.000 x g en 25 ° C gedurende 30 s en negeren de doorstroming.
  21. Voeg een ander 0,7 mL van de UT-MLB-buffer en Incubeer bij RT gedurende ten minste 1 min.
  22. Centrifugeer bij 6.000 × g gedurende 30 s. negeren de doorstroming. In dit stadium is de bacteriofaag vacht eiwit gescheiden van de dU-ssDNA, die gebonden aan de matrix van de kolom blijft.
  23. Voeg 0,7 mL wassen buffer PE met ethanol na instructies van de fabrikant. Centrifugeer bij 6.000 × g gedurende 30 s en negeren de doorstroming.
  24. Herhaal stap 2.23 en Centrifugeer nogmaals bij 6.000 × g voor 30 s residuele buffer PE verwijderen.
  25. Overdracht van de kolom naar een nieuwe 1.5-mL microcentrifuge buis en voeg 100 μl van elutie buffer EB (10 mM Tris· CL, pH 8,5) naar het midden van de kolom membraan.
  26. Incubeer bij RT gedurende 10 min en centrifuge bij 6.000 × g gedurende 1 minuut aan elueer de dU-ssDNA. Ongeveer kan 1,5 tot 2,5 μg dU-ssDNA/mL cultuur worden verkregen.
  27. Het analyseren van de eluted DNA door electrophoresing 1 μL op een 1% agarose gel van TAE. Het DNA moet worden weergegeven als een overwegend één band met geen smeren.
  28. Bepalen van de concentratie van DNA door het meten van de extinctie op een spectrofotometer nanodrop op 260 nm (een260 = 1.0 voor 33 ng/μL van ssDNA). Typische dU-ssDNA concentraties liggen op 200-500 ng/μL.

3. Kunkel methode gebaseerd Oligonucleotide gerichte mutagenese

Opmerkingen: Het is raadzaam om uit te voeren van kleinschalige reacties vóór schaaleindwaarde reacties om de kwaliteit van de mutagene oligonucleotide en reactie componenten. Een cartoon van Kunkel van methode gebaseerd gerichte oligonucleotide mutagenese is afgebeeld in Figuur 3. Verschillende aminozuur diversiteit worden in CDRH1, CDRH2, CDRH3 en CDRL3 regio's binnengebracht met IMGT nummering nomenclatuur16 (tabel 2). De theoretische aminozuur diversiteit van elke CDR, totale theoretische aminozuur diversiteit en oligonucleotide sequenties zijn vermeld in tabel 2.

  1. Oligonucleotide fosforylatie met T4 polynucleotide kinase
    1. Combineren van 0,6 μg mutagene oligonucleotides, ontworpen om een enkele CDR, met 2 μL 10 X TM buffer 2 μL 10 mM ATP en 1 μL 100 mM DTT muteren. Ultrazuiver H2O aan een totaal volume van 18 μL in een tube 1.5-mL toevoegen. 4 aparte en parallelle fosforylatie reacties zijn voor de bouw van de bibliotheek, zo ingesteld dat in dat geval overeenkomt met CDRH1, CDRH2, CDRH3 en CDRL3, respectievelijk.
    2. Toevoegen van 20 U (2 uL) van T4 polynucleotide kinase aan elk tube en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C (reactie 1 in tabel 3). Gebruik onmiddellijk voor gloeien.
  2. Gloeien van de oligonucleotides aan de sjabloon
    1. 20 μg dU-ssDNA sjabloon, toevoegen 25 μL van 10 X TM buffer, 20 μL van elke gefosforyleerd oligonucleotide oplossing en ultrapure H2O tot een eindvolume van 250 μL in een 0,5 mL-buis. Meng goed en Pipetteer in 0,20 mL PCR buizen (van elk 50 μl) als reactie 2 in tabel 3. Deze hoeveelheden DNA bieden een molaire verhouding van 3:1 tussen oligonucleotide en sjabloon, ervan uitgaande dat de verhouding van de lengte van oligonucleotide en sjabloon 1:100.
    2. Incubeer de reactie in een PCR machine bij 90 ° C gedurende 3 minuten, 50 ° C gedurende 3 minuten, en 20 ° C gedurende 5 minuten.
  3. Enzymatische synthese van CCC-dsDNA
    1. Toevoegen aan het mengsel van 250 μL gegloeid oligonucleotide/sjabloon, 10 μL van 10 mM ATP, 10 μL van 25 mM dNTP mix 15 μL van 100 mM DTT, 30 Weiss eenheden T4 DNA ligase en 30 U T7 DNA-polymerase als reactie 3 in tabel 3.
    2. Incubeer de reactie in de buis van de 1.5-mL bij 20 ° C's nachts.
    3. Wassen en de gesynthetiseerde CCC-dsDNA concentreren in een 0,5 mL centrifugaal filter-apparaat met een 30 kDa porie grootte membraan op RT.
      1. De overnachting reactiemengsel overbrengen in het filter apparaat en voeg ultrazuiver H2O aan 400 µL eindvolume. Draaien op 14.000 × g gedurende 10 minuten; het volume is minder dan 50 μl.
      2. Negeren van de stroom door, Voeg 400 µL van ultrazuiver H2O in de filter en draaien op 14.000 × g gedurende 10 minuten.
      3. Herhaal nogmaals stap 3.3.3.2.
      4. Plaats de filter ondersteboven in een schone microcentrifuge buis om te herstellen van de CCC-dsDNA. Spin bij 1000 × g gedurende 2 min; het herstelde volume is over het algemeen rond de 20-40 μL. De herstelde CCC-dsDNA kan onmiddellijk gebruikt voor electroporation van E. coli of bevroren bij-20 ° C voor later gebruik. Normaal 20-40 μg CCC-DNA kan worden verkregen.
    4. Electrophorese 1,0 µL van de geëlueerd reactieproduct naast de dU-ssDNA-sjabloon te visualiseren van het resultaat van de reactie.

4. Electroporation en berekening van de grootte van de bibliotheek

  1. Chill de gezuiverde CCC-dsDNA (20 μg in een maximumvolume van 50 μl) in een buis 1.5-mL microcentrifuge en een cuvet electroporation 0,2 cm tussenruimte op het ijs.
  2. Vooraf warm 20 mL SOC media in een 50mL polypropyleen conische centrifugebuis in het waterbad 37 ° C gedurende ten minste 30 minuten.
  3. Ontdooi een aliquot 350 μL van electro-bevoegde E. coli SS320 op ijs. De cellen toevoegen aan het DNA en meng grondig door pipetteren meerdere malen. Vermijd invoering van bubbels.
  4. Het mengsel overbrengen in de meetcel en electroporation na instructies van de fabrikant uit te voeren. Wanneer de BTX ECM-630 electroporation systeem wordt gebruikt, zijn de relevante instellingen bijvoorbeeld 2,5 kV veldsterkte, 125 Ω weerstand en 50 µF capaciteit.
  5. Onmiddellijk de electroporated cellen te redden door toevoeging van 1 mL voorverwarmde SOC voedingsbodem en overgeplaatst naar 17 mL voor SOC medium in een kolf van 125mL. Spoel de cuvette tweemaal met 1 mL van SOC medium en overdracht aan de dezelfde maatkolf (eindvolume is 20 mL).
  6. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C met schudden bij 200 omwentelingen per minuut.
  7. Bepaal de electroporation efficiëntie.
    1. 180 μL van 2YT media toevoegen aan elk putje van één kolom van een 96-microwell-plaat.
    2. Maken 8 tien keer seriële verdunningen: overdracht 20 μL van de 20-mL cultuur aan het eerste putje van de plaat, meng met pipetteren en overdracht 20 μL van het mengsel naar het volgende goed. Herhaal deze stap tot het einde van de seriële verdunning.
    3. Plaat 10 μL van elk van de seriële verdunningen op een LB/carb plaat in tweevoud. Plaat 100 µL resterende middelen van elk van de seriële verdunningen op afzonderlijke LB/carb platen voor kolonie graaf toetsing. Deze platen zal ook voorzien in één klonen ELISA en volgorde analyse (zie punt 5).
    4. Na een nacht bebroeden bij 37 ° C.
    5. Het tellen van de kolonies van de 10 μL duplicaten op de plaat LB/carb. Veronderstel dat M de gemiddelde kolonie getal getelde op 10N vouwen LB/carb plaat (N is van 1-8). De totale bibliotheek grootte is gelijk aan 2 M X 10N + 3 -kolonies.
  8. Aliquot de cultuur uit stap 4.6 even in twee 2-L verbijsterd kolven, elk met 500 mL van 2YT/carb/kan medium voor faag bibliotheek generatie.
  9. Incubeer bij 37 ° C met schudden bij 200 rpm's nachts voor ongeveer 16 h.
  10. De cultuur overbrengen met twee 1-L gesteriliseerde met autoclaaf centrifuge flessen en Centrifugeer gedurende 30 minuten bij 12.000 × g bij 4 ° C.
  11. Het supernatant overbrengen in twee nieuwe 1-L gesteriliseerde met autoclaaf centrifuge flessen en voeg 1/5 het eindvolume van PEG/NaCl oplossing te precipiteren de bacteriofaag. Incubeer op ijs gedurende 30 minuten.
  12. Centrifugeer gedurende 30 min op 12.000 × g- en 4 ° C. Zorgvuldig de bovendrijvende vloeistof decanteren en dat niet wordt verstoord van de bacteriofaag pellet. Spin voor 1 min bij 4000 x g en verwijder het resterende supernatant met een pipet.
  13. Resuspendeer de pellet faag met 20 mL steriele gefiltreerd 1 X PBS buffer en overdracht aan een nieuwe 50 mL-buis.
  14. De onoplosbare zaak pellet door centrifugeren voor 5 min op 12.000 × g- en 4 ° C. Het supernatant overbrengen in een nieuwe 50 mL-buis.
  15. De faag concentratie door spectrofotometer meten (OD268 = 1.0 voor een oplossing van 5 X 1012 faag/mL).
  16. Pas de bacteriofaag tot 5 X 1012 faag/mL in 1 X PBS met 10% ultrazuiver glycerol.
  17. Aliquot 1 mL van phage oplossing per 1.5-mL microcentrifuge buis. Gebruik de bibliotheken onmiddellijk voor pannen of Bewaar bij-80 ° C.

5. beoordeling door EiwitA / L Direct bindende ELISA Assay en Sequencing

  1. Willekeurig kiezen 96 enkele kolonies op LB/carb plaat uit stap 4.7.3 in een 96-diep goed cultuur plaat met 800 μL van 2YT/carb in elk putje. Incubeer gedurende 3-4 uur bij 37 ° C met schudden bij 1.000 tpm tot OD600 = 0,4-0,8.
  2. Voeg 100 μl van M13KO7 (1 X 1011 cfu/mL) aan elk putje van een 96-diepe cultuur goed plaat met een meerkanaalspipet. Incubeer bij 37 ° C met schudden bij 1000 omwentelingen per minuut gedurende 1 uur.
  3. Voeg 100 μl van 2YT 10 X concentratie van kanamycine (500 μg/mL) met aan elk putje met een meerkanaalspipet. Na een nacht bebroeden bij 37 ° C met schudden bij 1000 omwentelingen per minuut.
  4. Ontbinden eiwit L tot 1 µg/mL in 1 X PBS. 3/4 jas van de putten in een 384-well hoge binding aan eiwitten polystyreen plaat met 30 µL per putje van de eiwitten L oplossing. Na een nacht bebroeden bij 4 ° C.
  5. Gooi de overnachting eiwit L coating oplossing van stap 5.4. Voeg 50 µL van M-PBST (de blokkerende oplossing) aan alle van de putten in de hoge 384-well-binding aan eiwitten polystyreen plaat met een meerkanaalspipet. Incubeer de platen op een microplate-shaker voor 1 h op RT.
  6. Spin down de overnachting cultuur uit stap 5.3 in een cultuur van diep 96-wells-plaat bij 3000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. De faag is het supernatant.
  7. Gooi de blokkerende oplossing van stap 5.5. 15 μL van M-PBST en 15 μL van elke bacteriofaag supernatant (stap 5.6) toevoegen aan 3 van de eiwitten L gecoat wells als drievoud en 1 niet-gecoate goed als negatieve controle met behulp van een meerkanaalspipet. Incubeer bij RT gedurende 1 h met schudden bij 200 omwentelingen per minuut.
  8. Gooi de bacteriofaag oplossing. De plaat 6 keer met 80 μL van PBST door een geautomatiseerd plaat-wasmachine te wassen.
  9. 15 μL van M-PBST en 15 μL van eiwit A-HRP (1:1, 500 verdund in 1 X PBS) toevoegen aan elk putje met een meerkanaalspipet en Incubeer bij RT voor 1 h met het schudden van ongeveer 200 toeren per minuut.
  10. Gooi de eiwit A-HRP/M-PBST oplossing. Wassen van de plaat 6 keer met 80 μL van PBST.
  11. Voeg TMB substraat (30 μl per putje) met een meerkanaalspipet en incubeer gedurende 2-3 minuten tot de kleur ontwikkelt. Stop de reactie met 1,0 M H3PO4 (30 μl per putje).
  12. Lees de platen spectrophotometrically bij 450 nm. Positieve klonen worden gedefinieerd als degenen die een gemiddelde verhouding van OD450 absorptie van eiwitten L putten aan de M-PBST goed groter dan 3.0 vertonen.
  13. In een 96-diepe Nou, infecteren 50 μl van SS320 in 2YT/tet in logboek fase met 5 μL van de dezelfde bacteriofaag gebruikt voor de ELISA (stap 5.6) gedurende 30 minuten op RT.
  14. Voeg 950 μL van 2YT/carb in de 96-diepe goed uit stap 5.13 en na een nacht bebroeden bij 37 ° C met schudden bij 1000 omwentelingen per minuut.
  15. Pak de phagemid van DNA door Mini prep DNA extractie kit. Gebruik van de upstream inleidingen van VL (5'-TCGCTTTGTTTTTATTTTTTAATGTA-3') en VH (5'-GACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCG-3') voor sequentieanalyse te schatten van de diversiteit van de reeks bibliotheek.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Na het stroomschema van de Fab bibliotheek bouw (Zie Figuur 1), wij bereid M13KO7 helper faag vooraf besmet E. coli SS320 electro-bevoegde cellen. De efficiëntie van deze electro-bevoegde cellen wordt geraamd op 2 X 109 cfu/µg toen de ruggengraat van de Fab phagemid voor bouw van library werd gebruikt (Figuur 4).

De efficiëntie van de opneming uracil...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Voor de bouw van hoge diversiteit, faag-weergegeven Fab Bibliotheken, kwaliteitscontrole zijn controleposten nodig om te controleren van de verschillende fasen van het bouwproces, met inbegrip van de bevoegdheid van electro-bevoegde cellen, kwaliteit van de dU-ssDNA-sjabloon, efficiëntie van CCC-dsDNA synthese, titer na electroporation, Fab vouwen en diversiteit van het aminozuur van CDR door sequentieanalyse van Fab-faag klonen.

Hoge opbrengst en zuiverheid van de dU-ssDNA is essentieel voor ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs waarderen Dr. Frederic Fellouse van het Sidhu laboratorium voor kritische opmerkingen over Kunkel van methode gebaseerd synthetische Fab faag bibliotheek bouw. De auteurs waarderen Mrs. Alevtina Pavlenco en andere leden van de Sidhu lab voor waardevolle hulp van de voorbereiding van hoogrenderende electro-bevoegde E. coli cellen en hoge kwaliteit dU-ssDNA. Dit werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (Grant No.: 81572698, 31771006) DW en door ShanghaiTech University (Grant No.: F-0301-13-005) laboratorium van antilichaam engineering.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagents
1.0 M H3PO4FisherAC29570
1.0 M Tris, pH 8.0Invitrogen15568-025
10 mM ATPInvitrogen18330-019
100 mM dithiothreitolFisherBP172
100 mM dNTP mixGE Healthcare28-4065-60oplossing met 25 mM van elk van dATP, dCTP, dGTP en dTTP.
3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB)Kirkegaard & Perry Laboratories Inc50-76-02
50X TAEInvitrogen24710030
AgaroseFisherBP160
Carbenicillin, carbSigmaC1389100 mg/mL in water,  0.22 μm filter-sterilise, werkconcentratie: 100 μg/mL.
Chloramfenicol, cmpSigmaC0378100 mg/mL in ethanol, 0.22 μm filter-sterilise, werkconcentratie: 10 μg/mL.
EDTA 0.5 M, pH 8.0InvitrogenAM9620G
Granulated agarVWRJ637-500G
H2O2 peroxidase substraatKirkegaard & Perry Laboratories Inc50-65-02
K2HPO4Sigma795488
Kanamycin, kanFisherAC6112950 mg/mL in water,  0.22 μm filter-sterilise, werkconcentratie: 50 μg/mL.
KH2PO4SigmaP2222
Na2HPO4Sigma94046
NaClAlfa AesarU19C015
NanodropFisherND2000C
NaOHFisherSS256! WAARSCHUWING NaOH veroorzaakt brandwonden.
NON-Fat Powdered MilkSangon BiotechA600669
PEG-8000FisherBP233
Protein A-HRP conjugateInvitrogen101123
QIAprep Spin M13 KitQiagen22704
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28706
QIAquick PCR Purification KitQiagen28104
Recombinant Protein LFisher77679
T4 DNA polymeraseNew England BiolabsM0203S
T4 polynucleotide kinaseNew England BiolabsM0201S
T7 DNA polymeraseNew England BiolabsM0274S
Tetracycline, tetSigmaT766050 mg/mL in water, 0. 22 μm filter-sterilise, werkconcentratie: 10 μg/mL.
TryptoneFisher0123-07-5
Tween-20SigmaP2287
Ultrapure glycerolInvitrogen15514-011
UridineSigmaU375025 mg/mL in ethanol, werkconcentratie: 0.25 μg/mL.
Yeast extractVWRDF0127-08
NaamBedrijf CatalogusnummerOpmerkingen
Stammen
E.coli CJ236New England BiolabsE4141Genotype: dut-  ung-  thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F' camr). Gebruikt voor de bereiding van dU-ssDNA.
E.coli SS320Lucigen60512Genotype: [F'proAB+lacIq lacZΔM15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 Δ(araABC-leu)7679 ΔlacX74 galUgalK rpsL thi. Geoptimaliseerd voor hoog-efficiënte elektroporatie en filamenteuze bacteriofagenproductie.
M13KO7New England BiolabsN0315S
NaamBedrijf CatalogusnummerOpmerkingen
Equipment
0.2-cm gap elektroporatie cuvetteBTX
96-well 2mL Deep-well platenFisher278743
96-well Maxisorp immunoplatenNunc151759
Baffled flessenCorning
Centrifuge op tafelEppendorf5811000096
CentrifugeflessenNalgene
ECM-630 elektroporatieapparaatBTX
Magnetische roerstavenNalgene
Thermo Fisher centrifugeFisher
Hogesnelheid shakerTAITEKMBR-034P
Microplate shakerQILINBEIERQB-9002
Vloeibare handelaar voor 96 en 384 wellsRAININ
Meerkanaals pipetteRAININE4XLS
Amicon concentratorMerckUFC803096

Referenties

  1. Singh, S., et al. Monoclonal Antibodies: A Review. Curr Clin Pharmacol. , (2017).
  2. Reichert, J. M. Antibodies to watch in 2017. MAbs. 9 (2), 167-181 (2017).
  3. Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
  4. Milstein, C. The hybridoma revolution: an offshoot of basic research. Bioessays. 21 (11), 966-973 (1999).
  5. Gray, A. C., Sidhu, S. S., Chandrasekera, P. C., Hendriksen, C. F., Borrebaeck, C. A. Animal-Friendly Affinity Reagents: Replacing the Needless in the Haystack. Trends Biotechnol. 34 (12), 960-969 (2016).
  6. Hutchison, C. A. 3rd, et al. Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence. J Biol Chem. 253 (18), 6551-6560 (1978).
  7. Smith, G. P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).
  8. Sidhu, S. S. Phage Display in Biotechnology and Drug Discovery. , CRC Press. (2005).
  9. Weiss, G. A., Watanabe, C. K., Zhong, A., Goddard, A., Sidhu, S. S. Rapid mapping of protein functional epitopes by combinatorial alanine scanning. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (16), 8950-8954 (2000).
  10. Frenzel, A., Schirrmann, T., Hust, M. Phage display-derived human antibodies in clinical development and therapy. MAbs. 8 (7), 1177-1194 (2016).
  11. Sidhu, S. S., Fellouse, F. A. Synthetic therapeutic antibodies. Nat Chem Biol. 2 (12), 682-688 (2006).
  12. Adams, J. J., Sidhu, S. S. Synthetic antibody technologies. Curr Opin Struct Biol. 24, 1-9 (2014).
  13. Kunkel, T. A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (2), 488-492 (1985).
  14. Sidhu, S. S., Lowman, H. B., Cunningham, B. C., Wells, J. A. Phage display for selection of novel binding peptides. Methods Enzymol. 328, 333-363 (2000).
  15. Persson, H., et al. CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies. J Mol Biol. 425 (4), 803-811 (2013).
  16. Lefranc, M. P., et al. IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. Dev Comp Immunol. 27 (1), 55-77 (2003).
  17. Graille, M., et al. Complex between Peptostreptococcus magnus protein L and a human antibody reveals structural convergence in the interaction modes of Fab binding proteins. Structure. 9 (8), 679-687 (2001).
  18. Graille, M., et al. Crystal structure of a Staphylococcus aureus protein A domain complexed with the Fab fragment of a human IgM antibody: structural basis for recognition of B-cell receptors and superantigen activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5399-5404 (2000).
  19. Huang, R., Fang, P., Kay, B. K. Improvements to the Kunkel mutagenesis protocol for constructing primary and secondary phage-display libraries. Methods. 58 (1), 10-17 (2012).
  20. Chen, G., Sidhu, S. S. Design and generation of synthetic antibody libraries for phage display. Methods Mol Biol. 1131, 113-131 (2014).
  21. Padlan, E. A. Anatomy of the antibody molecule. Mol Immunol. 31 (3), 169-217 (1994).
  22. Virnekas, B., et al. Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic Acids Res. 22 (25), 5600-5607 (1994).
  23. Fellouse, F. A., Sidhu, S. S. Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. , Second Edition, CRC Press. 157-180 (2006).
  24. Fantini, M., et al. Assessment of antibody library diversity through next generation sequencing and technical error compensation. PLoS One. 12 (5), e0177574(2017).
  25. Glanville, J., et al. Deep sequencing in library selection projects: what insight does it bring? Curr Opin Struct Biol. 33, 146-160 (2015).
  26. Perelson, A. S., Oster, G. F. Theoretical studies of clonal selection: minimal antibody repertoire size and reliability of self-non-self discrimination. J Theor Biol. 81 (4), 645-670 (1979).
  27. Miersch, S., et al. Scalable high throughput selection from phage-displayed synthetic antibody libraries. J Vis Exp. (95), e51492(2015).
  28. Ponsel, D., Neugebauer, J., Ladetzki-Baehs, K., Tissot, K. High affinity, developability and functional size: the holy grail of combinatorial antibody library generation. Molecules. 16 (5), 3675-3700 (2011).
  29. Petering, J., McManamny, P., Honeyman, J. Antibody therapeutics - the evolving patent landscape. N Biotechnol. 28 (5), 538-544 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Synthetische fage displayconstructie van Fab bibliothekenoligonucleotidesgestuurde mutagenesestroomcompetente cellen met hoge effici ntieProte ne A L ELISADNA sequentieanalyseKunkel methodebibliotheekgrootte bij elektroporatieop maat gemaakte antilichaamdiversiteitsynthetische antilichaambibliotheek

Gerelateerde artikelen