Als de genetische varianten die zijn gekoppeld aan ziekten bij de mens begint te worden blootgelegd, wordt het steeds belangrijker systemen waarmee snel evalueren de biologische betekenis van deze geïdentificeerde varianten te ontwikkelen. Dit protocol wordt beschreven methoden voor de evaluatie van menselijke genfunctie tijdens vrouwelijke meiose ik met behulp van de muis eicellen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Met behulp van de muis eicellen te beoordelen van menselijke genfunctie tijdens de meiose I
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Embryonale aneuploïdie is de voornaamste genetische oorzaak van onvruchtbaarheid bij de mens. De meeste van deze evenementen zijn afkomstig tijdens vrouwelijke meiose, en zij positief gecorreleerd met de maternale leeftijd, leeftijd alleen is niet altijd voorspellende van het risico van het genereren van een aneuploid embryo. Varianten van de gen kunnen daarom goed voor onjuiste chromosoom segregatie tijdens de oögenese. Gezien het feit dat toegang tot menselijke eicellen is beperkt voor onderzoeksdoeleinden, een serie van tests werden ontwikkeld om de studie van menselijke genfunctie tijdens meiose ik met behulp van de muis eicellen. Ten eerste zijn boodschapper-RNA (mRNA) van het gen en gen variant van belang microinjected in de profase ik-gearresteerd muis eicellen. Na die tijd voor expressie, eicellen synchroon vrijkomen Meiotische rijping te voltooien meiose ik. Door tagging de mRNA met een opeenvolging van een fluorescerende verslaggever, zoals groen fluorescente proteïne (Gfp), kan de lokalisatie van het menselijke eiwit naast de fenotypische wijzigingen worden beoordeeld. Bijvoorbeeld, winst of verlies van functie kan worden onderzocht door middel van experimentele omstandigheden die uitdaging van het gen product Meiotische fouten te herstellen. Hoewel dit systeem gunstig is in het onderzoek naar menselijke eiwitfunctie tijdens de oögenese, moet voldoende interpretatie van de resultaten worden verricht, gezien het feit dat eiwit expressie niet op endogene niveaus is en, tenzij gecontroleerd voor (dat wil zeggen klopte uit of naar beneden) zijn lymfkliertest homologen ook aanwezig in het systeem.
Inleiding
Onvruchtbaarheid is een aandoening die 10-15% van de menselijke bevolking van reproductieve leeftijd 1, waaruit bijna de helft medische behandeling 2 zoekenbeïnvloedt. Hoewel de etiologie van onvruchtbaarheid divers is en in veel gevallen multifactoriële, de meest voorkomende genetische afwijking bij de mens embryonale aneuploïdie 3 is. Aneuploïdie wordt gedefinieerd als de afwijking (winst of verlies) van het juiste aantal chromosomen in een cel. Het fenomeen van aneuploïdie in menselijke embryo's is gemeenschappelijk en verhoogt met geavanceerde maternale leeftijd 4,....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. moleculaire klonen
- Verkrijgen van full-length codering sequentie van het gen van belang en de plasmide in vitro transcriptie (pIVT)11vector.
Opmerking: Full-length cDNA klonen zijn commercieel verkrijgbaar bij verschillende leveranciers of via omgekeerde transcriptie polymerasekettingreactie (RT-PCR) kunnen worden gegenereerd. Het nationaal centrum voor biotechnologische informatie (NCBI) onlinebron biedt transcript sequenties van genen van de Nucleotide en Expressed sequence gecodeerde (EST) databases. Voor het gemak van eiwit kunnen visualisatie en analyse van expressie niveaus, fusie aan de groen fluorescente proteïn....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Na in vitro hebben transcriptie hoogwaardige RNA een verhouding van A260/A280 voor (1.8-2.2) en een A260/A230 verhouding ≥1.7 als gemeten met een spectrofotometer. De afbeelding in Figuur 1 ziet u de migratie van in vitro-RNA geproduceerd op een denatureren agarose gel na elektroforese. Een band die is ingesmeerd in patroon of een monster met meerdere formaat banden kunt aangeven verontreiniging of aantasting van het monster. Als alternatief.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Vanwege de snelle en toenemende identificatie van menselijke genetische varianten ziekte is gekoppeld, is het noodzakelijk dat systemen voor de evaluatie van hun biologische betekenis worden vastgesteld. Begrip eiwitfunctie in menselijke meiose poses bijzondere uitdagingen omdat menselijke eicellen kostbare zijn en zeldzame en menselijk sperma niet vatbaar voor genetische manipulatie zijn. Muis eicellen zijn een waardevol voor de evaluatie van menselijk Meiotische gen functie 10,
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door een onderzoek subsidie van de American Society for Reproductive Medicine en van de Charles en Johanna Busch Memorial Fund bij Rutgers, The State University van NJ aan K.S. A.L.N. werd gesteund door een subsidie van de N.I.H. (F31 HD0989597).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.2 mL Seal-Rite PCR tube | USA Scientific | 1602-4300 | |
| 1 kb DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0313 | |
| 100 bp DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0243 | |
| 6X DNA loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| 9-well glass spot plate | Thomas Scientific | 7812G17 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Alexa-fluor-568 conjugated anti-mouse IgG | Thermo Scientific | A21050 | 1:200 verdunning |
| Alexa-fluor-633 conjugated anti-human IgG | Thermo Scientific | A21091 | 1:200 verdunning |
| Ampicillin | VWR | AA0356 | |
| Anti-vibration table | Technical Manufacturing Corp | elk standaardmodel | |
| Anti-Acetylated Tubulin antibody | Sigma Aldrich | T7451 | 1:100 verdunning |
| Anti-centromeric (CREST) antibody | Antibodies Incorportated | 15-234 | 1:30 verdunning |
| Barrier (Filter) Pipette tips | Thermo Scientific | AM12635 | Zorg ervoor dat ze compatibel zijn met uw pipetmerk. Deze zijn compatibel met Eppendorf pipetten. |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Agar, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0445-07-6 | |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0446-07-5 | |
| Capillary tubing | Sutter | B100-75-10 | |
| Center Well organ culture dish | VWR | 25381-141 | |
| CO2 tank | Voor incubator | ||
| Confocal microscope | Zeiss | elk standaardmodel | |
| Centrifuge (Met koelcapaciteit) | Thomas Scientific | elk standaardmodel | |
| Cover Glass 11 x 22 mm | Thomas Scientific | 6663F10 | |
| Coverslips | Thomas Scientific | 6663-F10 | De dikte varieert voor specifieke microscopen |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| DEPC H20 | Life Technologies | AM9922 | |
| Digital Dry Bath | Thermo Scientific | 888700001 | |
| Easy A high fidelity cloning enzyme | Agilent | 600400 | Voor DNA-klonen |
| Enzymes for linearizing pIVT | New England Biolabs | NdeI of KasI kan worden gebruikt | |
| Ethidium Bromide | Thermo Scientific | 155585011 | |
| Fluorescent Microscope | Elke fluorescente microscoop kan worden gebruikt | ||
| Formaldehyde (37%) | Thermo Fisher Scientifc | 9311 | |
| Formaldehyde RNA loading dye | Ambion | 8552 | |
| Frosted Microscope Slides (Uncharged) 25X75 mm | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Full Length cDNA Clones | Zijn verkrijgbaar bij elke leverancier die open reading frame clones levert | ||
| Gel electrophoresis apparatus | Bio-Rad | elk standaardmodel | |
| Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| Globin Forward Primer for pIVT Construct | 5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'. Kan worden gekocht bij elk bedrijf dat aangepaste oligonucleotiden genereert | ||
| Globin Reverse Primer for pIVT Construct | 5'- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3' Kan worden gekocht bij elk bedrijf dat aangepaste oligonucleotiden genereert | ||
| Holding pipettes | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
| Humidified Chamber | Tupperware kan worden gebruikt | ||
| Illustra Ready-To-Go RT-PCR beads | GE Life Sciences | 27925901 | |
| Incubator | elk standaardmodel met CO2 en watermanteltechnologie | ||
| Inverted Microscope | Nikon instruments | Elk standaardmodel | |
| Image J (NIH) Software | NIH | Software voor beeldafbeeldanalyse | |
| Lid of 96 well plate | Nalgene Nunc International | 263339 | |
| Low Adhesion 0.5 mL microcentrifgue tube | USA Scientific | 1405-2600 | |
| MacVector | MacVector | Software voor sequentieanalyse | |
| MG132 | Selleckchem | S2619 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Millenium RNA Markers-Formaldehyde | Ambion | AM7151 | |
| Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | Resuspend in DMSO bij 2,5mM |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Alleen gebruikt embryo-getest, steriel gefilterd |
| Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | Resuspend in DMSO bij 100 mM |
| Mouthpiece | Biodiseno | MP-001-Y | |
| N2 tank | voor anti-vibratietafel | ||
| Nail Polish; Clear | Elke duidelijke nagellak kan worden gebruikt | ||
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | elk standaardmodel | |
| NorthernMax 10X Denaturing Gel Buffer | Life Technologies | AM8676 | |
| NorthernMax 10X Running buffer | Life Technologies | AM8671 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running buffer | Thermo Scnentific | NP0001 | |
| Organ Culture Dish 60x15mm | Life Technologies | 08-772-12 | |
| Paraformaldehyde | Polysciences, Inc. | 577773 | |
| PCR Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4484075 | |
| Petri Dish 139 mm | Thermo Fisher Scientifc | 501V | |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientifc | 121V | |
| Petri Dish 60 mm | Falcon BD | 351007 | |
| Picoinjector | XenoWorks Digital Microinjector | elk standaardmodel | |
| Pipette puller | Flaming-Brown Micropipette puller | Model P-1000 | |
| pIVT plasmid |
Referenties
- Thoma, M. E., et al. Prevalence of infertility in the United States as estimated by the current duration approach and a traditional constructed approach. Fertil Steril. 99 (5), 1324-1331 (2013).
- Boivin, J., Bunting, L., Collins, J. A., Nygren, K. G.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
