Hier presenteren we een protocol om te kwantificeren follikels in gekweekte eierstokken van jonge Muizen zonder seriële segmenteren. Met behulp van hele orgel immunofluorescentie en weefsel wissen, is fysieke segmenteren vervangen door optische segmenteren. Deze methode voor de bereiding van de monsters en visualisatie handhaaft integriteit van orgel en vergemakkelijkt geautomatiseerde kwantificering van specifieke cellen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Hele Mount immunofluorescentie en follikel kwantificering van gekweekte muis eierstokken
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Onderzoek op het gebied van zoogdieren reproductieve biologie brengt vaak evaluatie van de algehele gezondheid van eierstokken en teelballen. Met name bij vrouwtjes, wordt ovariële fitness vaak beoordeeld door visualiseren en kwantificeren van de follikels en eicellen. Omdat het vruchtbeginsel een ondoorzichtige drie-dimensionale weefsel is, vereisen traditionele benaderingen moeizaam het weefsel in talrijke seriële secties opsplitsen om te visualiseren van cellen in het gehele orgaan. Bovendien, omdat kwantificering door deze methode houdt meestal slechts een subset van de secties gescheiden door de geschatte diameter van een oöcyt scoren is het vatbaar voor onjuistheden. Hier, wordt een protocol beschreven dat in plaats daarvan maakt gebruik van hele orgel weefsel clearing en immunofluorescentie kleuring van muis eierstokken te visualiseren follikels en eicellen. Vergeleken met meer traditionele benaderingen, dit protocol is gunstig voor het visualiseren van de cellen binnen het ovarium voor tal van redenen: 1) het vruchtbeginsel blijft intact gedurende de bereiding van de monsters en verwerking; 2) kleine eierstokken, die moeilijk te sectie, kunnen worden onderzocht met gemak; 3) cellulaire kwantificering meer gemakkelijk en nauwkeurig gebeurt; en 4) het hele orgel beeld.
Inleiding
Om het onderzoek naar de cellulaire samenstelling en morfologische kenmerken van zoogdieren eierstokken, afhankelijk wetenschappers vaak van in vivo experimenten gevolgd door immunohistological kleuring van paraffine ingesloten eierstokken. Meer recent echter hele eierstok orgel cultuur heeft bewezen een effectief alternatief voor het bestuderen van ovariële functie1,,2,,3,4 , omdat de techniek kan gepaard gaan met betere visualisatie en kwantificering tools. Traditioneel, analyse van ovariële morfologie is afhankelijk van reconstru....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Cornell University's institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) heeft ingestemd met alle methoden beschreven hier, onder protocol 2004-0038 bij JCS.
1. voorbereiding van instrumenten en kweekmedia
- Veeg het werkgebied met 10% bleekwater schoon en laat het bleekmiddel te blijven op het oppervlak gebied werk voor ten minste 5 min. Na 5 min, verwijder het overtollige bleekmiddel met schone papieren handdoeken en 70% ethanol (EtOH). Schoon het ontleden Microscoop grondig met 70% EtOH.
Opmerking: Het is belangrijk dat het werkgebied worden ten minste semi-steriele om verontreiniging van orgel culturen te voorkomen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dit protocol omvat 6 belangrijke stappen volgen dissectie van de eierstokken, zoals uiteengezet in Figuur 1. Figuur 2 , Figuur 3 , Figuur 4 wijzen op de meest nieuwe kenmerken van dit protocol, die omvatten de optimalisatie van weefsel voor eierstokken en hele weefsel oöcyt kwantificering met behulp van FIJI-ImageJ wi.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De studie van zoogdieren reproductie vereist gebruiken en kwantificeren van gespecialiseerde cellen die niet routinematig vatbaar voor celkweek. Ex vivo cultuur systemen zijn echter effectief bij het handhaven van de eierstok en follikel levensvatbaarheid1,15. Tijdens de eierstok cultuur vereist het weefsel een groter oppervlak voor uitwisseling van voedingsstoffen via diffusie. Daarom 5 - dagen oude muis eierstokken zijn ideaal in grootte en vorm voor o.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Wij danken Rebecca Williams en Johanna Dela Cruz van de Cornell BRC Imaging en Andrew Recknagel voor nuttige suggesties en technische bijstand. Dit werk werd gesteund aan de nationale instituten van gezondheid subsidie S10-OD018516 (naar Cornell's Imaging Facility), T32HD057854 tot J.C.B. en R01-GM45415 naar J.C.S.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Micro dissecting scissor 4.5", straight, sharp points | Roboz | RS-5912 | Micro dissecting scissor |
| Jewelers style forceps 4-3/8", style 5 | Integra Miltex | 17-305X | Fine tip forceps |
| Micro Iris Scissors 4", straight, sharp points | Integra Miltex | 18-1618 | Micro dissecting iris scissor or micro dissecting spring scissor |
| 1X Minimal Essential Media (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11090-081 | |
| Fetal Bovine Serium | Corning | 35011CV | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | Gebruikt in Stap 1.3.1 |
| 35mm Tissue Culture Treated Dish | Corning | 430165 | |
| Nunc™ 24-Well Carrier Plate for Cell Culture Inserts | ThermoFisher Scientific | 141006 | Poriegrootte: 8μm |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% oplossing |
| 1X Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
| Nutator mixer GyroTwister™ | Labnet | S1000-A-B | driedimensionale shaker |
| Normal Goat Serum | VWR | 103219-578 | |
| Bovine Serum Albumen (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium borohydride solution (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452904-25ML | Gebruik de oplossing, in plaats van de tablet of poedervorm |
| Polyvinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136-250G | Oplosbaar in koud water |
| Triton™ X-100 | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | polyethyleenglycol tert-octylfenylether |
| Spuitfilters | ThermoFisher Scientific | 725-2520 | 25mm |
| 10mL spuiten | BD | 309695 | |
| Mouse anti-p63 antibody (4A4) | Biocare Medical | CM 163A | Verdunning 1:500 |
| Rabbit anti-MVH antibody | Abcam | ab13840 | Verdunning 1:600 |
| Alexa Fluor® goat anti-mouse 594 | ThermoFisher Scientific | A-11032 | Verdunning 1:1000 |
| Alexa Fluor® goat anti-rabbit 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | Verdunning 1:1000 |
| 4,6-Diamidino-2-fenylindole (DAPI) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| D-(-)sorbitol | Sigma-Aldrich | 240850-100G | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012-100ML | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-5X10ML | |
| FIJI-ImageJ | Beeldverwerkingssoftware | ||
| Wegwerp plastic transferpipetten | VWR | 414044-034 |
Referenties
- O'Brien, M. J., Pendola, J. K., Eppig, J. J. A Revised Protocol for In Vitro Development of Mouse Oocytes from Primordial Follicles Dramatically Improves Their Developmental Competence. Biology of Reproduction. 68 (5), 1682-1686 (2003).
- Morgan, S., Campbell, L., Allison, V., Murray, A., Spears, N.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
