Toewijzing metabolisme: Bewakingsactiviteit lactaat Dehydrogenase rechtstreeks in weefsel

Samenvatting

We beschrijven een protocol voor het toewijzen van de ruimtelijke spreiding van enzymatische activiteit voor enzymen die nicotinatmide adenine dinucleotide-fosfaat (NAD(P)H) + H + rechtstreeks in weefselmonsters genereren.

Samenvatting

Toewijzen van enzymatische activiteit in ruimte en tijd is van cruciaal belang voor het begrip van de moleculaire basis van cel gedrag in normale weefsels en ziekte. In situ metabole activiteit testen kunnen informatie geven over de ruimtelijke spreiding van de metabole activiteit binnen een weefsel. Wij bieden hier een gedetailleerd protocol voor het toezicht op de activiteit van het enzym lactaat dehydrogenase rechtstreeks in weefselmonsters. Lactaat dehydrogenase is een belangrijke determinant van of verbruikte glucose worden geconverteerd naar energie via aerobe of anaerobe glycolyse. Een oplossing met lactaat en NAD wordt verstrekt aan een bevroren weefselsectie. Cellen met hoge lactaat dehydrogenase activiteit zal omzetten in de meegeleverde lactaat pyruvaat, terwijl tegelijkertijd converteren verstrekt nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) NADH en een proton, die kan worden opgespoord op basis van de vermindering van de nitrotetrazolium blauwe naar formazan, die wordt weergegeven als een blauwe neerslag. Beschrijven we een gedetailleerd protocol voor lactaat dehydrogenase bewakingsactiviteit in muis huid. Toepassing van dit protocol, vonden we dat lactaat dehydrogenase activiteit hoog in de cellen van de stam van het sluimerende haarfollikel in de huid is. Toepassing van het protocol aan gekweekte muis embryonale stamcellen, bleek hoger kleuring in gekweekte embryonale stamcellen dan muis embryonale fibroblasten. Onderzoek van vers geïsoleerde muis aorta bleek kleuring in zachte spiercellen loodrecht op de aorta. De methodologie die kan worden gebruikt om de activiteit van enzymen die het genereren van een proton in bevroren of vers weefsel ruimtelijk in kaart.

Inleiding

Inzicht in de locaties binnen weefsels waarin enzymen hoge of lage activiteit hebben is essentieel voor de ontwikkeling van het begrip en fysiologie. Transcript of proteïne niveaus worden vaak gebruikt als surrogaten voor enzymatische activiteit. Hoewel dergelijke studies kunnen informatief, bieden ze geen gegevens die cruciaal worden kan voor het bepalen van een enzymactiviteit, zoals posttranslationele modificaties, de aanwezigheid van eiwitcomplexen, of van het enzym subcellular localisatie. Enzymatische activiteit rechtstreeks wordt gemeten, is het vaak gecontroleerd in gehomogeniseerde eiwit lysates die niet langer informatie over individuele cellen binnen het mengsel of de ruimtelijke spreiding van de cellen met hoge of lage activiteit binnen een weefsel bevatten.

Wij bieden hier een gedetailleerd protocol voor het toewijzen van de ruimtelijke spreiding van enzymatische activiteit binnen een weefsel monster. De methodologie is gebaseerd op eerdere onderzoeken die aantonen dat tetrazolium zouten kunnen worden gebruikt voor het lokaliseren van de activiteit van dehydrogenases, reductases en oxidasen in bevroren weefsel¹. Met deze methoden wordt een water onoplosbare formazan gevormd wanneer protonen worden overgedragen aan een tetrazolium zout^2,3. Glucose-6-fosfaat dehydrogenase genereert NADPH en een proton en met tetrazolium activiteit is geconstateerd. Glucose-6-fosfaat dehydrogenase heeft gevolgd in Europese bot hepatocyten⁴, in alveolaire type 2 cellen van de longen⁵ en nephrons van de nier-⁵. Tetrazolium zouten zijn ook gebruikt om transketolase activiteit in bevroren weefsel⁶te controleren. Een soortgelijke aanpak werd onlangs gebruikt om de activiteit van meerdere dehydrogenases in de dezelfde weefsel op aangrenzende dia's⁷te controleren.

Hier beschrijven we een methode om met behulp van tetrazolium zouten te controleren van de ruimtelijke spreiding van lactaat dehydrogenase activiteit (Figuur 1). Lactaat dehydrogenase kunt converteren pyruvaat gegenereerd door glycolyse te lactaat en de omgekeerde reactie. Lactaat dehydrogenase activiteit is bijgevolg een belangrijke determinant van pyruvaat de ingang in de tricarboxylic acid cyclus versus de secretie zoals lactaat. Lactaat niveaus in het bloed worden vaak gebruikt voor de diagnose van een aantal ziekten, waaronder kanker^8,9,10, omdat het kan signaal dat ziekte of letsel heeft beschadigde cellen en het enzym is vrijgegeven.

Er zijn vier lactaat dehydrogenase genen: LDHA, LDHB, LDHC en LDHD¹¹. LDHA en LDHB worden verondersteld te zijn ontstaan uit een vroege LDHA gen¹²dubbel. LDH is actief als een tetrameer en LDHA en LDHB kan homotetramers en heterotetramers met elkaar. LDHA wordt gemeld te hebben hogere affiniteit voor pyruvaat, terwijl LDHB aan hebben hogere affiniteit voor lactaat, en bij voorkeur converteren lactaat en pyruvaat¹³is gemeld. De promotor LDHA bevat bandplaatsen voor de HIF1α, cMYC en FOXM1 transcriptie factoren¹¹. Bovendien, zoals vele andere glycolytic enzymen^14,15, kan LDH worden gewijzigd door posttranslationele modificaties. Fibroblast groeifactor receptor 1 kan LDHA Y10, die bevordert tetrameer vorming, of Y83, die bevordert NADH substraat bindende¹⁶phosphorylate. Ook kan LDHA geacetyleerd¹⁷. Om deze redenen vereist een compleet begrip van LDH activiteit controle niet alleen LDH eiwitniveaus, maar van het enzym activiteit ook.

Naast de methode die we hier presenteren, zijn andere benaderingen gebruikt om lactaat dehydrogenase activiteit te controleren. Lactaat dehydrogenase activiteit kan spectrophotometrically worden gecontroleerd in gehomogeniseerde eiwit lysate. De generatie van NADH zoals lactaat wordt geconverteerd naar pyruvaat kan worden gemeten op basis van de absorptie bij 340 nm, terwijl de verdwijning van NADH kan worden gecontroleerd dat pyruvaat naar lactaat¹⁸is geconverteerd. Lactaat dehydrogenase activiteit heeft ook gevolgd met magnetische resonantie beeldvorming (MRI). ¹³ C-pyruvaat kan worden beheerd en de omzetting van pyruvaat naar lactaat kan worden gecontroleerd als de verhouding tussen [1 -¹³C] lactaat / [1 -¹³C] pyruvaat. Verhoogde ratio's van [1 -¹³C] lactaat / [1 -¹³C] pyruvaat zijn waargenomen in kanker weefsel¹⁹. Terwijl de MRI-gebaseerde benaderingen kunnen informatie geven over lactaat dehydrogenase activiteit in normale en ziekte weefsels, hebben de methoden niet de resolutie nodig voor het bepalen van het niveau van de activiteit in specifieke cellen. De methodologie die hier geboden kan informatie verstrekken over lactaat dehydrogenase activiteit in weefsel gebieden en zelfs in afzonderlijke cellen.

Met behulp van in situ activiteit testen, vonden we dat de activiteit van lactaat dehydrogenase hoog in de haarfollikel cellen van de stam van muis huid^{20 is}. Wij ook gebruikt de methode aan de activiteiten van lactaat dehydrogenase in gekweekte embryonale stamcellen controleren en vond dat de activiteit is hoger in de cellen van de stam dan de feeder laag. Tenslotte, wij gecontroleerd van de activiteit van lactaat dehydrogenase in verse muis aorta en waargenomen vlekken in de zachte spiercellen. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor lactaat dehydrogenase bewakingsactiviteit in bevroren muis huid.

Protocol

Alle experimenten beschreven werden goedgekeurd door de Commissie van de zorg van het dier aan de Universiteit van Californië, Los Angeles.

1. het genereren van dia's van bevroren muis huid

1. Euthanaseren muizen overeenkomstig het beleid van de instelling.
   Opmerking: Volg institutioneel beleid voor beschermende kleding. Alle protocollen waarbij dieren moeten worden goedgekeurd door de Commissie voor de institutionele zorg van dier.
2. Verwijderen van de muis haar met een dierlijke tondeuse.
3. Maak incisies in de huid met behulp van schaar. Met behulp van Tang, til de huid uit de buurt van de muis. Met behulp van schaar, het gedeelte van de huid weggesneden.
4. Vul de cryomold met bevriezing reagens samengestelde (Zie Tabel van materialen).
5. Plaats huid secties in gevulde cryomolds met behulp van naald-nosed tang. Oriënteren huid zodat weefsel segmenten een dwarsdoorsnede van de huid van de epidermis de dermis en de hypodermis spier (Figuur 2 genereert).
   Opmerking: indien mogelijk mount experimentele en controle van muizen samen in de zelfde cryomold zodat ze kunnen worden gesegmenteerd op dezelfde dia en samen verwerkt. Wees voorzichtig niet te maken van de bubbels.
6. Plaats cryomold op het vlakke oppervlak van een blok van droog ijs in een ijsemmer en laat bevriezen. Blijven observeren van de oriëntatie van de huid. Pas indien nodig.
   Opmerking: Cryogene handschoenen dragen bij de behandeling van droog ijs.
7. Pipetteer cryomolds in een vriezer-80 ° C voor opslag. Monsters kunnen worden gehandhaafd in de vriezer voor ongeveer 3 maanden zonder een significant verlies van enzymatische activiteit. Laat niet bevroren secties uitdrogen.
8. Met behulp van een cryostaat bij-20 ° C, segment weefsel maken secties 7-10 µm dik voor de beste huid morfologie²¹.

2. voorbereiding van de dia's van de kleuring

1. Stellen het aantal dia's die moeten worden getest. Omvatten een besturingselement dia waarop NAD zal worden ingehouden en een ander besturingselement dia waarop het substraat, lactaat, zal worden ingehouden. Omvatten een positieve controle dia uit een blok van de bevroren weefsel eerder onderzocht.
2. Kort vast dia's met huid secties met 4% formaline voor 5 min hetzij door pipetting 1 mL 4% formaline in de dia verschijnt of bij de verwerking van meerdere dia's, door dompelen van dia's in een container met 4% formaline.
   Opmerking: De fixatie zorgt dat de huid doet niet schil af uit de dia's gedurende de volgende procedures en behouden de morfologie van de huid.
   Let op: Formaline is een kankerverwekkende stof en gevaarlijke; Draag handschoenen, laat niet het raken van uw huid en het uitvoeren van deze stap in een chemische zuurkast.
3. Wassen dia's met ten minste 1 mL fosfaat gebufferde zoutoplossing, pH 7.4, per dia door pipetteren of dompelen.

3. voorbereiding van de kleurstofoplossing

1. Vortex samen reagentia voor lactaat dehydrogenase activiteit kleuring (50 mM Tris pH 7.4, 750 µM NADP, 80 µM fenazine methosulfate (PMS), 600 µM nitrotetrazolium blauwe chloride en 30 mM lactaat) in een gepaste afmetingen buis afhankelijk van de hoeveelheid vlekken oplossing vereist.
   Opmerking: 1 mL is voldoende voor één dia volledig.
2. Bereid een tweede oplossing waarin alle reagentia behalve NAD aanwezig zijn. Bereid een derde oplossing waarin alle reagentia behalve lactaat aanwezig zijn.

4. Incubeer dia's in de kleurstofoplossing

1. Pipet zachtjes de kleurstofoplossing of besturingsoplossingen in de voorbereide dia's die betrekking hebben op het gedeelte in zijn geheel (1 mL is voldoende voor één dia). Als u meerdere dia's samen worden verwerkt, dompel u alle dia's in de kleurstofoplossing tegelijkertijd (zorg ervoor dat de container heeft genoeg oplossing voor het volledig bedekt de weefselsectie).
2. Incubeer de dia's in een bevochtigde omgeving bij 37 ° C in het donker. Als kleurstofoplossing boven de dia wordt weergegeven, plaatst u de dia in een bevochtigde omgeving ter voorkoming van verdamping.

5. toezicht op de dia 's

1. Toezicht op de omzetting van de kleurstofoplossing van duidelijk blauw door visuele inspectie. Wanneer de monsters hebt bereikt het gewenste niveau van blauwheid, zet de reactie stop doordat de kleurstofoplossing.
   Opmerking: Voor de huid, 10 min is voldoende. De tijd hangt af van het orgel en de enzymatische activiteit.
2. Dia's met fosfaat gebufferde zoutoplossing te spoelen door pipetteren (1 mL is voldoende voor elke dia) of dompelen.
   Opmerking: Alle monsters die moeten worden vergeleken aan elkaar moeten worden gehandhaafd in kleurstofoplossing voor de zelfde hoeveelheid tijd.

6. counterstain en monteren

1. Pipetteer een counterstain in de dia's wanneer de dia's een passend niveau van blauwheid hebt bereikt.
   Opmerking: Counterstains die de kernen rode of groene zorgt voor goed contrast met de blauwe gemaakt door de formazan precipitant.
2. Monteren met waterige of niet-waterig medium²²montage. Één tot drie druppels (40-50 µL) montage medium is voldoende is afhankelijk van de grootte van de cover slip.

7. het beeld van dia's en kwantificeren

1. Dia's voor een afbeelding onder een lichte Microscoop. Neem foto's van experimentele en controlemonsters en alle negatieve controles op 10 X, 20 X en 40 X vergroting.
2. Het bepalen van de intensiteit van de blauwe vlek in verschillende regio's met de software van de analyse van de afbeelding.

Resultaten

Resultaten voor in situ activiteit testen in muis huid²⁰hebben we eerder gemeld. Zoals blijkt uit Figuur 3, vastgesteld we hebben dat hoge niveaus van lactaat dehydrogenase activiteit in de haarfollikel stamcellen aan de basis van de haarfollikel als hierboven de procedures beschreven werden gevolgd. Deze bevindingen werden bevestigd door fluorescentie geactiveerd cel sorteren van de huid voor de cellen van de stam van de haar...

Discussie

De hier beschreven methode kan worden gebruikt om de activiteit van lactaat dehydrogenase of andere metabole enzymen die resulteren in NADH of NADPH, verschillende soorten cellen binnen een weefsel of binnen verschillende gedeelten van een weefsel na verloop van tijd te controleren. Lactaat dehydrogenase is een belangrijk enzym voor het begrip van de biologie van stamcellen en tumoren, en de mogelijkheid om lactaat dehydrogenase activiteit in afzonderlijke cellen te controleren is waarschijnlijk belangrijk inzicht verwer...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Chirurgische instrumenten			Voor het verzamelen van huid van geëuthanaseerde muizen
Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm	Fisher Scientific	NC9511236	Voor het bevriezen van muizenhuid
Tissue-Tek O.C.T. compound	Fisher Scientific	NC9638938	Voor het monteren van cryomolds
IJsemmer	Fisher Scientific	07-210-106
Droogig
Polysine Adhesion Slide	Fisher Scientific	12-545-78
4% formaline	Fisher Scientific	23-245-684	Verdund in water
fosfaat gebufferde zoutoplossing, pH 7.4
vortex
Tris base	Fisher Scientific	23-245-684
NAD	Sigma-Aldrich	N7004
Fenazine methosulfaat	Sigma-Aldrich	P9625
Nitrotetrazoliumblauwchloride	Sigma-Aldrich	N6876
Lithiumbotery L-lactaat	Sigma-Aldrich	L2250	Substraat
37°C incubator (of weefselkweekincubator)
Braziliaanse tegenkleuring	Anatech	861	Tegenkleuring
Montagemedium	Vector Laboratories	H-5000
Dekglasjes voor glijmiddel	Fisher Scientific	12-544D
Lichtmicroscoop