Methodenartikel

FM kleurstof fietsen in de synaps: vergelijken van hoge kalium depolarisatie, elektrische en Channelrhodopsin stimulatie

DOI:

10.3791/57765

⸱

24 mei 2018

 , 
1Department of Biological Sciences, Vanderbilt University, 2Departments of Biological Sciences, Pharmacology, Cell and Developmental Biology, Kennedy Center for Research on Human Development, Vanderbilt University and Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Synaptic Vesikel (SV) fietsen is het mechanisme van de kern van de intercellulaire communicatie in neuronale synapsen. FM kleurstof opname- en release zijn het belangrijkste middel van kwantitatief onderzoek SV endo- en exocytose. Hier, vergelijken wij alle stimulatie methoden om te rijden FM1-43 fietsen in de Drosophila motorische eindplaat (NMJ) model synaps.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FM kleurstoffen worden gebruikt voor het bestuderen van de synaptische Vesikel (SV) cyclus. Deze amphipathic sondes hebben een hydrofiele kop en hydrofobe staart, waardoor ze wateroplosbaar met de mogelijkheid om omkeerbaar betreden en verlaten van membraan lipide bilayers. Deze styryl-kleurstoffen zijn relatief niet-belichting fluorescerende in waterig medium, maar de invoeging in het buitenste van de bijsluiter van het plasma-membraan veroorzaakt een > 40 X verhoging van fluorescentie. In neuronale synapsen, zijn FM kleurstoffen geïnternaliseerd tijdens SV endocytose, verhandelde zowel binnen als tussen SV zwembaden en vrijgegeven met SV exocytose, bieden een krachtig hulpmiddel om te visualiseren presynaptische stadia van transmissie. Een primaire genetische model van glutamaterge synapse ontwikkeling en functie is de Drosophila motorische eindplaat (NMJ), waar FM kleurstof imaging is gebruikt uitgebreid te kwantificeren SV dynamiek in een brede waaier van mutant voorwaarden. De NMJ synaptic terminal is gemakkelijk bereikbaar, met een prachtig scala aan grote synaptic los ideaal voor beeldtoepassingen. Hier, wij vergelijken en het contrast van de drie manieren om te stimuleren de Drosophila NMJ rijden activiteit-afhankelijke FM1-43 kleurstof opname/release: 1) bad toepassing van hoge [K+] 2) zuignap elektrode motorische zenuw te depolarize neuromusculaire weefsels stimulatie om te depolarize van de presynaptische zenuw terminal, en 3) gericht transgene expressie van channelrhodopsin varianten voor licht-gestimuleerd, ruimtelijke controle van depolarisatie. Elk van deze methoden heeft voor- en nadelen voor de studie van genetische mutatie gevolgen op de SV-cyclus op de Drosophila NMJ. We zullen bespreken deze voor- en nadelen bij de selectie van de stimulatie aanpak, samen met de methoden die specifiek zijn voor elke strategie. Naast fluorescerende imaging kunnen FM kleurstoffen photoconverted aan elektron-dichte signalen gevisualiseerd met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) om te studeren van SV cyclus mechanismen op ultrastructureel niveau. Wij bieden de vergelijkingen van confocale en elektronenmicroscopie beeldvorming van de verschillende methoden van Drosophila NMJ stimulatie, om te helpen guide de selectie van toekomstige experimentele paradigma's.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het prachtig gekenmerkt Drosophila larvale motorische eindplaat (NMJ) glutamaterge synapse model is gebruikt synapse formatie en functie met een grote spectrum van genetische verstoringen1te gaan studeren. De motor neuron terminal bestaat uit meerdere takken van de axon, elk met vele uitgebreide synaptic los. Deze ruim varicosities (maximaal 5 µm in diameter) bevat alle van de transmissie-machine, met inbegrip van uniforme glutamaterge synaptische vesikels (SVs; ~ 40 nm diameter) in cytosolische reserve en gemakkelijk-vrij te geven zwembaden2. Deze blaasjes op het basisstation op de presynaptische plasmamembraan fusion site actieve zones (AZs), waar exocytose de glutamaat neurotransmitter release voor trans bemiddelt-synaptic communicatie. Vervolgens worden de SVs opgehaald uit het plasma-membraan via kus-en-run-recycling- of clathrin-gemedieerde endocytose (CME) voor herhaalde exo/endocytose cycli. De Drosophila NMJ is gemakkelijk toegankelijk en geschikt voor zowel isoleren en karakteriseren van SV cyclus mutanten. Met behulp van voorwaartse genetische schermen, hebben nieuwe mutaties geleid tot de identificatie van nieuwe genen kritisch voor de SV cyclus3. Bovendien, omgekeerde genetische benaderingen, beginnend met de reeds bekende genen hebben geleid tot de opheldering van nieuwe mechanismen van de cyclus van de SV door de zorgvuldige beschrijving van mutant fenotypen4fietsen. De Drosophila NMJ is bijna ideaal als een experimentele synaptic voorbereiding voor het ontleden van SV endocytose exocytose HORLOGEMECHANISMES via methoden om optisch track vesikel fietsen tijdens transmissie.

Een waaier van fluorescente markeringen visuele tracking van blaasjes tijdens het fietsen van dynamiek, maar de meest veelzijdige zijn FM kleurstof analogen die is voor het eerst gesynthetiseerd door Mao, F., et al.. 5. structureel, FM kleurstoffen bevatten een hydrofiele kop en een lipofiele staart verbonden via een aromatische ring, met een centrale regio spectrale eigenschappen toekennen. Deze styryl kleurstoffen partitioneren omkeerbaar in membranen, niet 'flip-flop' tussen membraan folders en dus nooit zijn vrij in het cytosol en zijn veel meer tl in membranen dan water5. Omkeerbare inbrengen in een lipide dubbelgelaagde veroorzaakt een verhoging van de 40-fold in fluorescentie6. Bij neuronale synapsen bestaan klassieke FM kleurstof labeling experimenten uit Baden van de synaptische voorbereiding met de kleurstof tijdens depolarizing stimulatie te laden kleurstof via SV endocytose. Externe kleurstof wordt dan gewassen weg en de SV-cyclus wordt gearresteerd in een calcium-vrije ringer-oplossing om het imago van de geladen synapsen7. Een tweede ronde van stimulatie in een bad met kleurstof-vrije triggers FM release via exocytose, een proces dat kan worden gevolgd door het meten van de daling van de intensiteit van de fluorescentie. SV populaties van een enkele blaasje tot zwembaden met honderden blaasjes kunnen kwantitatief gecontroleerde6,7. FM kleurstoffen zijn gebruikt om te ontleden activiteit-afhankelijke mobilisatie van functioneel verschillende SV zwembaden, en te vergelijken kus-en-run vs. CME fietsen8,9. De methode is aangepast om afzonderlijk assay opgeroepen, spontane en miniatuur synaptic cyclus activiteiten (met uiterst gevoelige apparatuur op te sporen van zeer kleine fluorescentie wijzigingen en verminderen photobleaching)10. Testen kunnen worden uitgebreid tot de ultrastructureel niveau door photoconverting de fluorescerende FM-signaal in een elektron-dichte label voor Transmissie Electronenmicroscopie11,12,13,14 .

Historisch, de synaptische preparaten zwemmen in een hoog gehalte aan kalium (hierna te noemen "hoge [K+]") is de methode van keuze voor depolarizing stimulatie om te induceren SV fietsen; de kikker cholinerge NMJ5, variërend tot gekweekt knaagdier hersenen hippocampal neuronen15, de Drosophila glutamaterge NMJ model16,17. Deze hoge [K+] aanpak is eenvoudig, vereist geen gespecialiseerde apparatuur, en daarom de meeste labs toegankelijk is, maar heeft beperkingen voor zowel de toepassing en de interpretatie van de gegevens. Een veel meer fysiologisch geschikte methode is het gebruik van zuiging elektrode elektrische stimulatie van de nervus4,5,12. Deze aanpak drijft actiepotentiaal vermeerdering voor directe stimulatie van de presynaptische zenuw terminal, en resultaten kunnen direct worden vergeleken met elektrofysiologische testen van transmissie functie13,14, 15, maar vereist gespecialiseerde apparatuur en is technisch veel moeilijker. Met de komst van optogenetics heeft het gebruik van neuronale stimulatie van de channelrhodopsin extra voordelen, met inbegrip van strakke Spatio controle van kanaal expressie met behulp van de binaire Gal4/UAS systeem20. Deze aanpak is technisch veel gemakkelijker dan zuig elektrode stimulatie en vereist niets meer dan een zeer goedkope LED lichtbron. Hier, gebruiken we beeldvorming van FM1-43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) pyridinium dibromide) tot en met zowel vergelijken en het contrast van deze drie methoden van de verschillende stimulatie bij de Drosophila NMJ: eenvoudige hoge [K+ ], uitdagende channelrhodopsin van elektrische en nieuwe benaderingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. de larvale lijm dissectie

  1. Grondig Meng 10 delen van silicone-elastomeer basis met 1 deel van silicone-elastomeer genezen van de agent uit de elastomeer kit (Tabel van materialen).
  2. 22 x 22 mm glas coverslips met de elastomeer en genezen op een hete plaat op 75 ˚C jas voor enkele uren (tot niet meer plakkerig aanvoelt).
  3. Plaats een dekglaasje enkel elastomeer-gecoat glas aan in de op maat gemaakte plexi glas dissectie kamer (Figuur 1, beneden) ter voorbereiding van de larvale dissectie.
  4. De lijm pipetten van borosilicaatglas capillair met behulp van een standaard micro-elektrode trekker te verkrijgen van de gewenste conus en tip grootte voor te bereiden.
  5. Zachtjes breken uit de micropipet tip, en aan het andere eind, koppelen van 2 ft van flexibele kunststof buis (1/32" inwendige diameter, ID 3/32" buitendiameter, OD; 1/32" muur; Tabel van materialen) met mond montage (P2 Pipetteer tip).
  6. Vul een kleine container (0,6 mL Eppendorf buis GLB) met een kleine hoeveelheid (~ 20 µL) lijm (Tabel of Materials) ter voorbereiding van de larvale dissectie.
  7. De kamer vullen met zoutoplossing (in mM): 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl21 CaCl2, 70 sacharose en 5 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic zuur (HEPES) pH 7,2.
  8. Toevoegen van anti-paard radijs peroxidase (HRP) antilichaam geconjugeerd met Alexa Fluor 647 (anti-HRP:647, verdund 1:10 uit een voorraad van 1 mg/mL) voor het labelen van de NMJ presynaptische terminal tijdens dissectie21,22.
  9. Met behulp van een fijn penseel (maat 2), een dolende derde instar uit de voedsel-flacon verwijderen en plaatsen op de cover elastomeer-gecoat glas.
  10. Vul het glas micropipet uiteinde met een klein volume van lijm met behulp van negatieve luchtdruk gegenereerd door mond met bijlage (stap 1.5).
  11. Positie larve dorsale kant naar boven met pincet en lijm het hoofd naar het dekglaasje elastomeer beklede aan met een kleine druppel lijm positieve luchtdruk via mond.
  12. Herhaal deze procedure met het achterste uiteinde van de larve, om ervoor te zorgen dat het dier wordt uitgerekt strak tussen de twee bijlagen van de lijm.
  13. Met behulp van schaar (bladen 3 mm; Tabel van materialen), maak een horizontale snede (~ 1 mm) op posterior en een verticale snee langs de dorsale middellijn.
  14. Met behulp van fijne pincet (#5, Tabel of Materials), zachtjes verwijderen dorsale luchtpijp, gut, vet lichamelijk en andere inwendige organen die betrekking hebben op de daaraan gehechte spiermassa.
  15. Herhaal de lijmen procedure voor de vier kleppen van lichaam muur, ervoor zorgend om voorzichtig rekken de muur van de instantie zowel horizontaal als verticaal.
  16. Til het ventrale zenuw snoer (VNC) met behulp van Tang, zorgvuldig de motorzenuwen knip met de schaar en de VNC vervolgens volledig te verwijderen.
  17. Vervangen door de dissectie saline Ca2 +-zoutoplossing (hetzelfde als de bovenstaande dissectie saline zonder de CaCl2) om te stoppen met SV gratis fietsen.

2. optie 1: High [K+] FM kleurstof laden

  1. Van een stamoplossing van FM1-43 (4 mM), voeg 1 µL tot 1 mL van 90 mM KCl oplossing (hoog [K+] in een dissectie zoutoplossing) voor een eindconcentratie van 4 µM.
  2. Met behulp van een precisiepipet, vervangen de Ca2 +-gratis zoutoplossing in de beeldvorming zaal met de hoge [K+] FM kleurstof oplossing voor het stimuleren van SV endocytose kleurstof opname.
  3. Onmiddellijk beginnen met een digitale timer voor de vooraf vastgestelde duur van de hoge [K+] depolarizing stimulatie periode (bijv., 5 min; Figuur 2).
  4. Opmerking de sterke samentrekkingen van de spieren voor de duur van de hoge depolarisatie [K+] om te bevestigen een gezonde larvale voorbereiding.
  5. Wanneer de timerperiode afloopt, snel de hoge [K+] FM kleurstof oplossing verwijderen en vervangen met Ca2 +-gratis zoutoplossing om te stoppen met SV fietsen.
  6. Wassen snel achter elkaar met de Ca2 +-gratis saline (5 x voor 1 min) om ervoor te zorgen de hoge [K+] FM kleurstof oplossing volledig is verwijderd.
  7. Handhaven van de larvale voorbereiding in verse Ca2 +-gratis saline voor onmiddellijke beeldbewerking met de confocal microscoop.

3. beeldvorming: Confocale microscopie

  1. Gebruik een rechtop confocal microscoop met een 40 X water onderdompeling doelstelling naar afbeelding NMJ kleurstof fluorescentie (andere microscopen kunnen worden gebruikt).
  2. Afbeelding muscle 4 NMJ van abdominale segmenten 2-4 (andere NMJs kunnen worden beeld) en het verzamelen van beelden met behulp van de juiste software (Tabel van materialen).
  3. Gebruik een HeNe 633 nm laser te wekken HRP:647 (met long pass filter > 635 nm) en een Argon 488 nm laser te prikkelen FM1-43 (met bandfilter filter 530-600 nm).
  4. Operationeel bepalen optimale winst en verschuiving voor beide kanalen.
    Opmerking: Deze instellingen blijft constant in de rest van het experiment.
  5. Neem een confocal Z-stapel door het hele geselecteerde NMJ van HRP-gemarkeerd boven naar beneden van de synaptische terminal.
  6. Neem nota van de NMJ beeld (segment, kant en spieren) om ervoor te zorgen om de exacte dezelfde NMJ overtollige nadat FM kleurstof lossen.

4. hoge [K+] stimulatie: FM kleurstof lossen

  1. Vervanging van Ca2 +-gratis zoutoplossing met de hoge [K+] saline (zonder FM1-43 kleurstof) naar station depolarisatie, SV exocytose en kleurstof vrijlating.
  2. Onmiddellijk beginnen met een digitale timer voor de vooraf vastgestelde duur van de hoge [K+] stimulatie periode (bijv., 2 min; Figuur 2).
  3. Wanneer de timerperiode afloopt, onmiddellijk de hoge [K+] saline verwijderen en te vervangen met Ca2 +-gratis zoutoplossing om te stoppen met SV fietsen.
  4. Wassen ter vlug successie met Ca2 +-gratis saline (5 x voor 1 min) om ervoor te zorgen de hoge [K+] saline is volledig verwijderd.
  5. Handhaven van de larvale voorbereiding in verse Ca2 +-gratis saline voor onmiddellijke beeldbewerking met de confocal microscoop.
  6. Er zeker van zijn om het imago van de FM1-43 kleurstof fluorescentie bij de dezelfde NMJ hierboven met dezelfde confocal instellingen.

5. optie 2: Elektrische stimulatie FM kleurstof laden

  1. Bereiden een zuig Pipetteer met behulp van de micro-elektrode trekker (Tabel of Materials) te verkrijgen van de vereiste conus en tip van grootte.
  2. Brand-Pools het puntje van de micro-elektrode met een micro-forge totdat een interne motor zenuw kan worden opgezogen met een strakke pasvorm.
  3. Schuif zuig pipet op de elektrode-houder op een micromanipulator en hechten aan de lange flexibele kunststof buis en een spuit.
  4. Stimulator parameters instellen (bijv., 15 V, 20 Hz frequentie, 20 ms duur en het tijdstip van 5 min (Figuur 2) of 1 min (Figuur 3)).
  5. Vervang de Ca2 +-gratis zoutoplossing op de larvale voorbereiding met boven FM1-43 saline (4 µM; 1 mM CaCl2) op de elektrofysiologie tuig.
  6. Zet de voorbereiding op het stadium van de Microscoop en verhogen het werkgebied totdat de larve en zuig pipet focus (40 X water-onderdompeling doelstelling zijn).
  7. Zuigen op een lus van gesneden motorische zenuw innervating van de geselecteerde hemisegment met negatieve luchtdruk gegenereerd door de spuit in de zuig elektrode.
  8. De functie van de zuigkracht elektrode met een korte uitbarsting van stimulatie tijdens het visueel monitoring voor de spiercontractie in de geselecteerde hemisegment te testen.
  9. Het stimuleren van de motorische zenuw met behulp van geselecteerde parameters (stap 5.4) rijden SV endocytose en FM1-43 kleurstof opname (Figuur 2).
  10. Wassen ter vlug successie met Ca2 +-gratis saline (5 x voor 1 min) om ervoor te zorgen dat de oplossing van de kleurstof FM1-43 volledig is verwijderd.
  11. Handhaven van de larvale voorbereiding in verse Ca2 +-gratis saline voor onmiddellijke beeldvorming met behulp van de confocal imaging protocol van bovenaf.
  12. Neem nota van de NMJ beeld (segment, kant en spier) om te zorgen voor toegang tot de exacte dezelfde NMJ na FM kleurstof lossen.

6. elektrische stimulatie: FM kleurstof lossen

  1. Vervang de Ca2 +-gratis zoutoplossing met regelmatige saline (zonder FM1-43 kleurstof) en de voorbereiding terug in de elektrofysiologie tuig werkgebied te plaatsen.
  2. De parameters van de stimulator voor lossing (bv15 V, 20 Hz frequentie, 20 ms duur en het tijdstip van 2 min (Figuur 2) of 20 s (Figuur 3)).
  3. Zuigen de dezelfde motor zenuw in de dezelfde elektrode zoals hierboven beschreven, en vervolgens stimuleren SV exocytose en FM1-43 kleurstof versie te activeren.
  4. Wassen ter vlug successie met Ca2 +-gratis saline (5 x voor 1 min) om ervoor te zorgen dat de externe kleurstof wordt volledig verwijderd.
  5. Handhaven van de larvale voorbereiding in verse Ca2 +-gratis saline voor onmiddellijke beeldbewerking met de confocal microscoop.
  6. Zorgen naar image de FM1-43 kleurstof fluorescentie bij de dezelfde NMJ hierboven met dezelfde confocal instellingen.

7. optie 3: Channelrhodopsin stimulatie FM kleurstof laden

  1. ChR2-uiten larven op levensmiddelen die de ChR2 co-factor all-trans retinal (opgelost in ethanol; 100 µM eindconcentratie) te verhogen.
  2. Plaats de larvale voorbereiding in de zaal plexiglas werkgebied een dissectie Microscoop voorzien van een poort van de camera.
  3. Hechten van een blauwe LED (470 nm; Tabel van materialen) aan een programmeerbare stimulator met behulp van een coaxiale kabel en plaats de LED in de poort van de camera.
  4. Focus de blauwe LED lichtbundel op de ontleed larvale functie met behulp van de Microscoop zoom-functie.
  5. Vervang de Ca2 +-gratis zoutoplossing op de larvale voorbereiding met boven FM1-43 saline (4 µM; 1 mM CaCl2) in het werkgebied optogenetic.
  6. Instellen van de parameters van de LED met behulp van de stimulator (bv15 V, 20 Hz frequentie, 20 ms duur en het tijdstip van 5 min (Figuur 2)).
  7. Start de lichte stimulatie en bijhouden met een timer voor de vooraf vastgestelde duur van de periode van optogenetic stimulatie (bijv., 5 min; Figuur 2).
  8. Wanneer de timer stopt, snel de FM kleurstof oplossing verwijderen en vervangen met Ca2 +-gratis zoutoplossing om te stoppen met de SV fietsen.
  9. Wassen snel achter elkaar met de Ca2 +-gratis saline (5 x voor 1 min) om de FM kleurstof oplossing volledig is verwijderd.
  10. Handhaven van de larvale voorbereiding in verse Ca2 +-gratis saline voor onmiddellijke beeldbewerking met de confocal microscoop met behulp van imaging protocol van bovenaf.
  11. Neem nota van de NMJ beeld (segment, kant en spier) om te zorgen voor toegang tot de exacte dezelfde NMJ na FM kleurstof lossen.

8. Channelrhodopsin stimulatie: FM kleurstof lossen

  1. Vervanging van Ca2 +-gratis zoutoplossing met regelmatige saline (zonder kleurstof FM1-43) in het werkgebied van de Microscoop dissectie met camera poort LED gericht op de larve.
  2. De stimulator parameters instellen voor lossen (bijvoorbeeld 15 V, 20 Hz frequentie, 20 ms duur en het tijdstip van 2 min (Figuur 2)).
  3. Start de lichte stimulatie en bijhouden met een timer voor de vooraf vastgestelde duur van de periode optogenetic stimulatie (bijvoorbeeld 2 min; Figuur 2).
  4. Wanneer de timerperiode afloopt, snel de FM kleurstof oplossing verwijderen en vervangen met Ca2 +-gratis zoutoplossing om te stoppen met de SV fietsen.
  5. Wassen ter vlug successie met Ca2 +-gratis saline (5 x voor 1 min) om ervoor te zorgen dat de externe kleurstof wordt volledig verwijderd.
  6. Handhaven van de larvale voorbereiding in verse Ca2 +-gratis saline voor onmiddellijke beeldbewerking met de confocal microscoop.
  7. Zorgen naar image de FM1-43 kleurstof fluorescentie bij de dezelfde NMJ hierboven met dezelfde confocal instellingen.

9. fluorescentie kwantificering

  1. Laden van de afbeelding in afbeelding J (NIH open bron) en een maximale intensiteit projectie maken door te klikken op afbeelding | Stapels | Z-Project.
  2. Met behulp van de anti-HRP:647 kanaal, ga naar afbeelding | Aanpassen | Drempel en schuif de bovenste werkbalk totdat alleen de NMJ is ge-highlight.
  3. Klik met het gereedschap Toverstaf op de NMJ. Als de NMJ discontinue, houd de Shift-knop en selecteer alle onderdelen.
  4. Wijzig de afbeelding naar het kanaal van de kleurstof FM1-43 en gaan analyseren | Maatregel te verkrijgen van de fluorescentie-meting.
  5. Herhaal stap 9.1-9.4 voor het "gelost" beeld van de dezelfde NMJ (geïdentificeerde segment, kant en spieren).
  6. Nemen voor het verkrijgen van het percentage van de kleurstof die werd gelost, de verhouding van de intensiteit van de fluorescentie gelost/geladen.
    Opmerking: Deze procedure kan worden aangepast voor het analyseren van de fluorescentie op basis van bouton-per-bouton met behulp van de "ovale" of "freehand" selectiegereedschappen. Achtergrond-fluorescentie kan worden afgetrokken door bemonstering van de fluorescentie van de spier. Agenten kunnen ook worden toegevoegd aan het verminderen van deze achtergrond.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 1 toont de werk-stroom voor de activiteit-afhankelijke FM kleurstof imaging protocol. Het experiment begint altijd met de zelfde larvale lijm dissectie, ongeacht de methode van de stimulatie vervolgens gebruikt. Figuur 1a is een schematische voorstelling van een ontleed larve, toont het ventrale zenuw snoer (VNC), zenuwen en herhaalde hemisegmental spier patroon te stralen. De VNC wordt verwijderd en de voorbereiding baden...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hoge [K+] zoute depolarizing stimulatie is veruit de eenvoudigste van de drie opties voor activiteit-afhankelijke FM kleurstof fietsen, maar waarschijnlijk de minste fysiologische29. Deze eenvoudige methode depolarizes elke toegankelijk cel in het hele dier, en dus kan geen gerichte studies. Het mogelijk toe te passen lokaal hoog [K+] zoutoplossing met een micropipet, maar dit zal nog steeds depolarize pre/postsynaptisch cellen en waarschijnlijk synapse-geassocieerde glia

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken Broadie Lab leden voor bijdragen aan dit artikel. Dit werk werd gesteund door de NIH R01s MH096832 en MH084989 naar K.B., en NIH predoctoraal fellowship F31 MH111144 te D.L.K.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
SylGard 184 Silicone Elastomer KitFisher ScientificNC9644388Om op dekglas te leggen voor dissecties
Microscope Cover Glass 22x22-1Fisherbrand12-542-BOm SylGard op te leggen voor dissecties
Aluminum Top Hot Plate Type 2200ThermolyneHPA2235MOm de SylGard te laten uitharden
Plexi glass dissectiekamerN/AN/AHandgemaakt
Borosilicate Glass CapillariesWPI1B100F-4Om zuig- en lijmsmicropipetten te maken
Laser-Based Micropipette PullerSutter InstrumentP-2000Om zuig- en lijmsmicropipetten te maken
Tygon E-3603 Laboratory TubingComponent Supply Co.TET-031AVoor mond- en zuigpijpje
P2 pipette tipUSA Scientific1111-3700Voor mondpijpje
0.6-mL Eppendorf tube capFisher Scientific05-408-120Gebruikt om lijm in te leggen voor dissectie
Vetbond 3MWPIvetbondLijm gebruikt voor dissecties
Potassium ChlorideFisher ScientificP-217Voor saline
Sodium ChlorideMillipore SigmaS5886Voor saline
Magnesium ChlorideFisher ScientificM35-500Voor saline
Calcium Chloride DihydrateMillipore SigmaC7902Voor saline
SucroseFisher ScientificS5-3Voor saline
HEPESMillipore SigmaH3375Voor saline
HRP:Alexa Fluor 647Jackson ImmunoResearch123-605-021Om neuronale membranen te labelen
PaintbrushWinsor & Newton94376864793Om de larven te manipuleren
Dumont Dumostar Tweezers #5WPI500233Gebruikt tijdens dissectie
7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm)WPI14177Gebruikt tijdens dissectie 
FM1-43Fisher ScientificT35356Fluorescente styryl kleurstof
Digital TimerVWR62344-641Voor timing FM kleurstof laden/lossen 
LSM 510 META laser-scanning confocale microscoopZeissVoor beeldvorming van de fluorescente markers
Zen 2009 SP2 versie 6.0ZeissSoftware voor beeldvorming op confocale
HeNe 633nm laserLasosOm HRP:647 tijdens beeldvorming te exciteren
Argon 488nm laserLasosOm de FM kleurstof tijdens beeldvorming te exciteren
Micro-ForgeWPIMF200Om glas micropipetten te polijsten
20mL Syringe Slip TipBD301625Om het axon op te zuigen voor elektrische stimulatie.
Micro Manipulator (magnetische basis)NarishigeMMN-9Om de zuigelektrode voor elektrische stimulatie te bedienen
StimulatorGrassS48Om de LED en elektrische stimulatie te bedienen
Zeiss Axioskop MicroscoopZeissGebruikt tijdens elektrische stimulatie.
40X Achroplan Water Immersion ObjectiefZeissGebruikt tijdens elektrische stimulatie en confocale beeldvorming
All-trans RetinalMillipore SigmaR2500Essentiële co-factor voor ChR2
Zeiss Stemi Microscoop met camerapoortZeiss2000-CGebruikt tijdens channelrhodopsine stimulatie
LED 470nmThorLabsM470L2Gebruikt voor ChR activatie
T-Cube LED DriverThorLabsLEDD1BOm de LED te bedienen
LED Power SupplyCincon Electronics Co.TR15RA150Om de LED van stroom te voorzien
Optical Power and Energy MeterThorLabsPM100DOm LED intensiteit te meten

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 647-670 (2013).
  2. Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools. Nat Rev Neurosci. 6 (1), 57-69 (2005).
  3. Long, A. A., et al. Presynaptic calcium channel localization and calcium-dependent synaptic vesicle exocytosis regulated by the Fuseless protein. J Neurosci. 28 (14), 3668-3682 (2008).
  4. Kopke, D. L., Lima, S. C., Alexandre, C., Broadie, K. Notum coordinates synapse development via extracellular regulation of Wingless trans-synaptic signaling. Development. 144 (19), 3499-3510 (2017).
  5. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
  6. Richards, D. A., Bai, J., Chapman, E. R. Two modes of exocytosis at hippocampal synapses revealed by rate of FM1-43 efflux from individual vesicles. J Cell Biol. 168 (6), 929-939 (2005).
  7. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the drosophila neuromuscular junction. Methods Mol Biol. 440, 349-369 (2008).
  8. Dickman, D. K., Horne, J. A., Meinertzhagen, I. A., Schwarz, T. L. A Slowed Classical Pathway Rather Than Kiss-and-Run Mediates Endocytosis at Synapses Lacking Synaptojanin and Endophilin. Cell. 123 (3), 521-533 (2005).
  9. Verstreken, P., et al. Endophilin Mutations Block Clathrin-Mediated Endocytosis but Not Neurotransmitter Release. Cell. 109 (1), 101-112 (2002).
  10. Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. -Y., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of synaptic vesicle recycling using FM dyes during evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities. J Vis Exp. (85), (2014).
  11. Sandell, J. H., Masland, R. H. Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product. J Histochem Cytochem. 36 (5), 555-559 (1988).
  12. Opazo, F., Rizzoli, S. O. Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes. J Vis Exp. (36), e1790(2010).
  13. Sabeva, N. S., Bykhovskaia, M. FM1-43 Photoconversion and Electron Microscopy Analysis at the Drosophila Neuromuscular Junction. Bio-protocol. 7 (17), (2017).
  14. Sabeva, N., Cho, R. W., Vasin, A., Gonzalez, A., Littleton, J. T., Bykhovskaia, M. Complexin Mutants Reveal Partial Segregation between Recycling Pathways That Drive Evoked and Spontaneous Neurotransmission. J Neurosci. 37 (2), 383-396 (2017).
  15. Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11 (4), 713-724 (1993).
  16. Ramaswami, M., Krishnan, K. S., Kelly, R. B. Intermediates in synaptic vesicle recycling revealed by optical imaging of Drosophila neuromuscular junctions. Neuron. 13 (2), 363-375 (1994).
  17. Trotta, N., Rodesch, C. K., Fergestad, T., Broadie, K. Cellular bases of activity-dependent paralysis in Drosophila stress-sensitive mutants. J Neurobiol. 60 (3), 328-347 (2004).
  18. Long, A. A., et al. The nonsense-mediated decay pathway maintains synapse architecture and synaptic vesicle cycle efficacy. J Cell Sci. 123 (Pt 19), 3303-3315 (2010).
  19. Parkinson, W., Dear, M. L., Rushton, E., Broadie, K. N-glycosylation requirements in neuromuscular synaptogenesis. Development. 140 (24), 4970-4981 (2013).
  20. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), (1993).
  21. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos. Proc Natl Acad Sci. 79 (8), (1982).
  22. Paschinger, K., Rendić, D., Wilson, I. B. H. Revealing the anti-HRP epitope in Drosophila and Caenorhabditis. Glycoconj J. 26 (3), 385-395 (2009).
  23. Ramachandran, P., Budnik, V. Fm1-43 labeling of Drosophila larval neuromuscular junctions. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (8), (2010).
  24. Yawo, H., Kandori, H., Koizumi, A. Optogenetics: light-sensing proteins and their applications. , (2015).
  25. Pulver, S. R., Pashkovski, S. L., Hornstein, N. J., Garrity, P. A., Griffith, L. C. Temporal dynamics of neuronal activation by Channelrhodopsin-2 and TRPA1 determine behavioral output in Drosophila larvae. J Neurophysiol. 101 (6), 3075-3088 (2009).
  26. Hornstein, N. J., Pulver, S. R., Griffith, L. C. Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions. J Vis Exp. (25), e1133(2009).
  27. Britt, J. P., McDevitt, R. A., Bonci, A. Use of channelrhodopsin for activation of CNS neurons. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 2, Unit 2.16 (2012).
  28. Lin, J. Y. A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
  29. Vijayakrishnan, N., Woodruff, E. A., Broadie, K. Rolling blackout is required for bulk endocytosis in non-neuronal cells and neuronal synapses. J Cell Sci. 122, 114-125 (2009).
  30. Honjo, K., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Optogenetic manipulation of neural circuits and behavior in Drosophila larvae. Nat Protoc. 7 (8), 1470-1478 (2012).
  31. Dear, M. L., Shilts, J., Broadie, K. Neuronal activity drives FMRP- and HSPG-dependent matrix metalloproteinase function required for rapid synaptogenesis. Sci Signal. 10 (504), (2017).
  32. Baldwin, M. L., Rostas, J. A. P., Sim, A. T. R. Two modes of exocytosis from synaptosomes are differentially regulated by protein phosphatase types 2A and 2B. J Neurochem. 85 (5), 1190-1199 (2003).
  33. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  34. Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
  35. Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
  36. Lin, J. Y. A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
  37. Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 5942-5947 (2000).
  38. Narahashi, T., Moore, J. W., Scott, W. R. Tetrodotoxin Blockage of Sodium Conductance Increase in Lobster Giant Axons. J Gen Physiol. 47 (5), 965-974 (1964).
  39. Narahashi, T. Chemicals as tools in the study of excitable membranes. Physiol Rev. 54 (4), 813-889 (1974).
  40. Kuromi, H., Yoshihara, M., Kidokoro, Y. An inhibitory role of calcineurin in endocytosis of synaptic vesicles at nerve terminals of Drosophila larvae. Neurosci Res. 27 (2), 101-113 (1997).
  41. Seamon, K. B., Daly, J. W. Forskolin, cyclic AMP and cellular physiology. Trends Pharmacol Sci. 4, 120-123 (1983).
  42. Zhang, D., Kuromi, H., Kidokoro, Y. Synaptic Transmission at the Drosophila Neuromuscular Junction: Effects of Metabotropic Glutamate Receptor Activation. Slow Synaptic Responses Modul. , 260-265 (2000).
  43. Kuromi, H., Kidokoro, Y. The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae. J Neurosci. 19 (5), 1557-1565 (1999).
  44. Kuromi, H., Kidokoro, Y. Selective Replenishment of Two Vesicle Pools Depends on the Source of Ca2+ at the Drosophila Synapse. Neuron. 35 (2), 333-343 (2002).
  45. Kay, A. R., et al. Imaging Synaptic Activity in Intact Brain and Slices with FM1-43 in C. elegans, Lamprey, and Rat. Neuron. 24 (4), 809-817 (1999).
  46. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Choi, S., Tsien, R. W. Visualization of Synaptic Activity in Hippocampal Slices with FM1-43 Enabled by Fluorescence Quenching. Neuron. 24 (4), 803-808 (1999).
  47. Denker, A., Rizzoli, S. O. Synaptic vesicle pools: an update. Front Synaptic Neurosci. 2, 135(2010).
  48. Denker, A., Kröhnert, K., Rizzoli, S. O. Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction. J Physiol. 587 (12), 2919-2926 (2009).
  49. Wucherpfennig, T., Wilsch-Bräuninger, M., Gonz ález-Gait án, M. Role of Drosophila Rab5 during endosomal trafficking at the synapse and evoked neurotransmitter release. J Cell Biol. 161 (3), 609-624 (2003).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Synaptische vesiclecyclusneuromusculaire junctie van Drosophilaelektrische stimulatieconfocale microscopietransmissie elektronenmicroscopieFM1 43 kleurstofopnameFM1 43 kleurstofvrijgave

Gerelateerde artikelen