Methodenartikel

In situ Microscopie voor real-time bepaling van eencellige morfologie in bioprocessen

7.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57823

⸱

5 december 2019

 ,  ,  ,  , 
1Chair of Bioprocess Engineering, Department of Biotechnology, Technische Universität Berlin, 2SOPAT GmbH

In dit artikel

Samenvatting

Een foto-optisch in situ microscopie apparaat is ontwikkeld om de grootte van afzonderlijke cellen direct in de celsuspensie te bewaken. De real-time meting wordt uitgevoerd door de foto-optische steriliseerbare sonde te koppelen aan een geautomatiseerde beeldanalyse. Morfologische veranderingen verschijnen met afhankelijkheid van de groei toestand en de teeltomstandigheden.

Samenvatting

In-situ monitoring in microbiële bioprocessen is meestal beperkt tot chemische en fysische eigenschappen van het medium (bijv.pH-waarde en de concentratie opgeloste zuurstof). Niettemin, de morfologie van cellen kan een geschikte indicator voor optimale omstandigheden, omdat het verandert met afhankelijkheid van de groei toestand, product accumulatie en cel stress. Bovendien biedt de eencellige distributie niet alleen informatie over de teelt condities, maar ook over de heterogeniteit van de populatie. Om dergelijke informatie te verkrijgen, werd een foto-optisch in situ microscopie apparaat1 ontwikkeld om de bewaking van de eencellige grootte distributie rechtstreeks in de celsuspensie in bioreactoren mogelijk te maken. Een geautomatiseerde beeldanalyse is gekoppeld aan de microscopie op basis van een Neural Network-model, dat is getraind met afbeeldingen met een gebruiker aantekeningen. Verschillende parameters, die worden opgedaan met de opnamen van de Microscoop, zijn gecorreleerd aan het proces van relevante kenmerken van de cellen, zoals hun metabole activiteit. Tot nu toe werd de gepresenteerde in situ microscopie sonde serie toegepast om de korrelgrootte te meten bij de suspensies van filamenteuze schimmels. Het werd gebruikt om de eencellige grootte in de microalgen teelt te onderscheiden en te relateren aan lipide accumulatie. De vorm van cellulaire deeltjes was gerelateerd aan ontluikende in gist culturen. De microscopie analyse kan over het algemeen in drie stappen worden opgesplitst: (i) beeld verwerving, (II) deeltjes identificatie, en (III) gegevensanalyse, respectievelijk. Alle stappen moeten worden aangepast aan het organisme, en daarom is specifieke geannoleerde informatie vereist om betrouwbare resultaten te bereiken. De mogelijkheid om veranderingen in celmorfologie direct in lijn of op lijn te monitoren (in een by-pass) maakt real-time waarden mogelijk voor bewaking en controle, zowel in procesontwikkeling als op productieschaal. Als de off line gegevens correleert met de real-time gegevens, worden de huidige vervelende off line metingen met onbekende invloeden op de celgrootte onnodig.

Inleiding

Morfologische kenmerken van cellen zijn vaak gerelateerd aan de fysiologische toestand, een verbinding tussen vorm en functie bestaat voor veel toepassingen. De morfologie van een enkele cel wordt beïnvloed door de toestand van de groei, de leeftijd van de cel, osmotische en andere potentiële celspanningen of product accumulatie. Morfologische veranderingen van cellen zijn vaak een maatstaf voor de groei vitaliteit van een cultuur. Intracellulaire product synthese, lipide accumulatie in algen en inclusie lichaam vorming in bacteriën, onder andere, zijn gerelateerd aan de celgrootte ook. Celagglomeratie kan een andere factor zijn die het waard is om te onderzoeken, zoals onlangs samengevat2.

Populatie heterogeneities kunnen worden gekwantificeerd op basis van morfologische kenmerken van individuele cellen. Studies toonden aan dat heterogeniteit binnen een cultuur significant zou kunnen zijn, bijvoorbeeldbij grootschalige productieomstandigheden3 de totale opbrengst kan worden beïnvloed door een lage prestatie van subpopulaties4.

Gewoonlijk wordt de beoordeling van morfologische kenmerken van cellen uitgevoerd door manuele bemonstering of met een door-Pass-stroom kamer gekoppeld aan een foto-optisch apparaat. Dit leidt tot verschillende beperkingen: de beperkte hoeveelheid verworven gegevens kan nauwelijks statistisch betrouwbare metingen leveren; de tijdsvertraging tussen de bemonstering en de toegankelijkheid van de resultaten kan te lang zijn in vergelijking met de dynamiek van het proces; en belangrijkste, de bemonsteringsprocedure (locatie van de bemonsteringspoort, voor behandeling van het monster vóór de meting, ongunstige omstandigheden in de bemonstering of bypass buis) kan een partijdige fout veroorzaken, omdat de voorbeeldprocedure zelf al van invloed kan zijn op de cel Morfologie. Ten slotte bestaat er altijd een hoog risico op verontreiniging tijdens de bemonstering of in by-pass-oplossingen, als deze niet steriliseerbaar zijn.

De toepassing van in-situ microscopie (ISM) kan verschillende van deze problemen omzeilen. Als cellen automatisch worden gedetecteerd, kan een juiste identificatie van hun morfologische kenmerken worden onderzocht5. Tot nu toe waren de belangrijkste beperkingen van deze methode (i) de evaluatietijd van beelden, die te lang was voor in-situ toepassingen, en (II) de slechte resolutie van beelden, vooral bij hoge celdichtheid. Hoewel eerste oplossingen van ISM omvatte mechanische bemonstering, verdunning van de sonde, of waren beperkt tot een by-pass systeem6,7, verdere benaderingen maken het vastleggen van de cel schorsing rechtstreeks8.

Recente vooruitgang in ISM zorgt voor de in-lijn of on- Line bewaking van cellen op één celbasis, die de verspreiding van morfologische parameters in real-time rechtstreeks in celsuspensies bij aanzienlijk hoge celconcentraties verschaft. Door middel van off line analyses van de belangrijkste parameters van de cellen, kunnen correlaties worden geïdentificeerd met informatie die wordt verstrekt door de gekoppelde geautomatiseerde celdetectie en ism. Vervolgens worden nieuwe soft-sensor ontwerpen bereikt, waarbij een onmeetbaar parameter wordt geschat met de eencellige morfologie.

In dit rapport wordt het ISM uitgevoerd door een fotooptische sonde te koppelen aan een geautomatiseerde beeldanalyse. Het ISM bestaat uit een sensor sonde met één staaf die het mogelijk maakt om beelden binnen een bekende Focus range in een instelbare meet kloof te vangen met een CCD-camera met hoge resolutie [MM-Ho = CCD GT2750 (2750x2200) en MM 2,1 = CMOS G507c (2464x2056)]. De flitslicht verlichting wordt uitgevoerd door transmissie. Daarom is het licht afkomstig van de tegenoverliggende kant van de camera9 en kan de intensiteit ervan worden aangepast. Cellen passeren continu door deze kloof met de vloeistofstroom. Daarom wordt een representatieve steekproefpopulatie verkregen. De sonde kan direct aan de bioreactor worden gemonteerd, zodat deze in de celsuspensie terechtkomt, of kan worden gebruikt in een doorgang gesterseerbaar. De sensor shell is aangesloten op het systeem voorafgaand aan sterilisatie, de optische onderdelen worden daarna in de shell gemonteerd.

Tot nu, relevante industriële micro-organismen, bijvoorbeeld, filamenteeuze schimmels (diameter tot meer dan 200 μm), de heterotrofe microalg Crypthecodinium cohnii (gemiddelde celdiameter van 20 μm), en de gist Saccharomyces cerevisiae (gemiddelde celdiameter van 5 μm), werden onderzocht met deze of soortgelijke apparaten, die binnenkort wordt beschreven.

Filamenteuze schimmels hebben de neiging om pellets te vormen onder bepaalde teeltomstandigheden. Deze zijn van een grootte van maximaal enkele honderden μm. De schimmeldraden van de schimmelcellen ontwikkelen verschillende lengtes in afhankelijkheid van de hydrodynamische spanning in de vloeistoffase. Dit heeft een invloed op de metabole en groei activiteit, substraat opname en product release. ISM werd toegepast om de korrelgrootte verdeling en de breedte van zones van lagere dichtheid van de biomassa aan de randen van de pellets (eigen niet-gepubliceerde gegevens) te identificeren.

De grootte van C. cohnii verandert tussen 15 en 26 μm wanneer cellen accumuleren het meervoudig onverzadigde vetzuur Docosahexaeenzuur (DHA) onder stikstof beperking. Dit biotechnologische DHA-productieproces bestaat uit twee delen, de groeifase, waarin cellen zich delen en kleiner worden, en de productiefase, waarin cellen het product accumuleren en dus groter worden. Daarom werd de celgrootte gebruikt om de processtatus te bepalen, waarbij ofwel groei of DHA-productie gunstig was. Ten slotte is een correlatie tussen de celgrootte en de DHA-inhoud gevonden. In dit geval maakt ISM het mogelijk om de accumulatie van intracellulaire DHA in real time te bewaken zonder de vereiste van bemonstering, celverstoring en de gemeenschappelijke gaschromatografie-analyse10.

Ontluikende gist is meestal van een grootte tussen 3 en 8 μm. Het aandeel van cellen in de rijpings toestand op een tijdstip, zoals beschreven met de ontluikende index (BI), verschaft informatie over de groei vitaliteit11,12, en zelfs een relatie met recombinant eiwit secretie is bewezen13. Met behulp van ISM werden ontluikende en niet-ontluikende gistcellen (cellen met en zonder knop)14onderscheiden. Stress omstandigheden kunnen ook leiden tot een bredere variatie van de celgrootte binnen een gist populatie, zoals onlangs weergegeven in Scale-down cultivaties, waarin de voorwaarden van grootschalige nutriënt-beperkte fed-batch cultivaties werden geïmiteerd3.

Daarom heeft ISM het potentieel om de groei vitaliteit en product vorming op één celniveau te monitoren tijdens alle stadia van een Bioprocess voor de identificatie van optimale kweek condities, of voor het doel van procesbeheersing. De hier beschreven methoden zijn gericht op microbiële toepassingen met enkelvoudige cellen, maar zijn ook toepasbaar op grotere deeltjes zoals menselijke en dierlijke cellen, celagglomeraten en pellets van filamenteuze organismen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Opmerking: de volgende stappen zijn nodig om de parameters aan te passen aan het respectieve micro-organisme en de cultuuromstandigheden. De afstelling van de sonde-instellingen duurt ongeveer 20 minuten voor een ervaren gebruiker. Een gedetailleerde beschrijving van de gereedschappen en stappen wordt gegeven in de bijbehorende sonde handleiding van SOPAT GmbH. In het algemeen zijn de hulpprogramma's die worden weergegeven in het volgende protocol nodig: (i) sonde-controller voor sonde-aanpassingen en beeld verwerving; (II) Fiji (ImageJ) voor aantekeningen op verworven afbeeldingen; (III) Sopat-ondersteuning voor training van kunstmatige neurale netwerken (Ann) en het maken van workflows; (IV) Batcher voor gegevens batchverwerking met behulp van reeds verworven afbeeldingen met een workflow; (v) resultaat analyse voor resultaat visualisatie en evaluatie van batchgewijs verwerkte afbeeldingen; en (VI) monitor voor geautomatiseerde real-time meting en resultaat visualisatie.

1. hardware parameters instellen

  1. Bereid een cultuur met de hoogste celconcentratie die tijdens het experiment kan worden bereikt, of centrifugeer en hervat de pellet om deze concentratie te bereiken. In dit geval werd 65 g L-1 van de droge biomassaconcentratie gekozen voor S. cerevisiae -cultivaties.
  2. Maak verschillende verdunningen, die variëren van de hoogste tot de laagste concentratie, zodat het verwachte bereik volledig bedekt is. Er worden minimaal 4 verschillende concentraties aanbevolen.
  3. Identificeer het celgrootte bereik van het micro-organisme met conventionele microscopie. Definieer de verwachte maximale diameter (dMax) van de respectieve cellen. Deze waarde is ingesteld op 8 μm in het geval van S. cerevisiae.
  4. Kies twee meet kloven van 5x en 10x van de verwachte dMax van de cellen.
  5. Kies de maximale stroboscoop-intensiteit. Kies stroboscoop intensiteiten voor beide openingen met de hoogste celconcentratie, zodat cellen nog steeds zichtbaar zijn op de beelden met de laagste lichtintensiteit (donkerste afbeeldingen).
  6. Kies de minimale stroboscoop-intensiteit en kies vervolgens stroboscoop intensiteiten voor beide openingen, zodat de cellen nog steeds zichtbaar zijn op de afbeeldingen met de hoogste lichtintensiteit (helderste afbeeldingen). Gebruik de laagste celconcentratie, die waarschijnlijk tijdens de meetperiode verschijnt.
  7. Kies één scherpstelpositie, die de scherpste beelden oplevert voor elke meet kloof, voor beide stroboscoop intensiteiten en voor het concentratiebereik dat moet worden getest (zie stap 2 voor meer informatie over scherpstellen). Focus cellen op de juiste wijze zodat de afbeeldingsgegevens achteraf kunnen worden geannoleerd (zie stap 4).
  8. Meet de eerder bereide verdunningsreeks van de celconcentratie (zie stap 2) met zowel de spleet breedten als de stroboscoop intensiteiten.

figure-protocol-1
Figuur 1: concentratie kalibratie tool. Linker GUI: set image directories (minimum 3) met bekende concentraties; centrale GUI: Kies functies die moeten worden berekend in de afbeeldingsmap; rechter GUI: Kies de gewogen Root Mean Square error (WRMSE) om het minimum te identificeren. WRMSE en de beste correlatie tussen een afbeeldings functie en de celconcentratie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

  1. Evalueer het experiment van de verdunningsreeks.
    1. Gebruik het hulpmiddel voor concentratie kalibratie (CoCa) (Zie Figuur 1) om de optimale correlatie te identificeren tussen de geëxtraheerde beeld eigenschappen (helderheid of scherpte) en de eerder gemeten concentraties die door de gebruiker zijn verstrekt, bijvoorbeelddroge biomassa of celtellingen. Volg de instructies in de handleiding van de software voor meer informatie.
    2. Identificeer de optimale correlatie tussen de geëxtraheerde informatie uit de beeld functies bij verschillende concentraties in vergelijking met eventuele off line metingen. Zie de legende van Figuur 1.
    3. Kies de meest redelijke meet kloof en stroboscoop intensiteiten in het kader van de correlatie curve van de concentratie met de functies die resulteren in de kleinste gewogen wortel Mean Square error (WRMSE).
      Opmerking: de meet kloof wordt vastgesteld tijdens het experiment, terwijl de intensiteit van de stroboscoop kan worden aangepast volgens de celconcentratie.

2. off line meting

  1. Pas de gewenste meet kloof aan volgens stap 1 met behulp van een diktemeter.
  2. Open de grafische gebruikersinterface probe Control in het sopat dashboard.
  3. Verbind de gewenste sonde met de versterker in de software-Subsectie acties en druk op Connect.
  4. Druk op de afspeel knop om het streamen te starten (livebeeld).
  5. Reinig de meet kloof door ethanol in de opening te spuiten en verwijder stof of vuil voorzichtig met een optisch papier. Controleer of het glas van de sensor vrij is van deeltjes met de Live-weergave in de camcontrol.
    Opmerking: metingen van deeltjes en stofstoren en de automatische identificatie van de cellen.
  6. Plaats een droog optisch papier in de meet kloof. Open het tabblad sonde controle en pas de intensiteit van de stroboscoop aan om het papier te visualiseren. Draai de BIND schroef tot de enkelvoudige vezels van het papier duidelijk zichtbaar zijn.
  7. Vul een buis met kweek Bouillon. Dompel de Microscoop in de kweek Bouillon zodat de spleet volledig bedekt is met celsuspensie. Open het tabblad sonde controle en pas de gewenste intensiteit van de stroboscoop aan overeenkomstig punt 1. Focus op de cellen door fijnafstelling van de focus binding schroef. De focus mag tijdens het experiment niet meer worden gewijzigd
    Opmerking: 5-6 mL kweek Bouillon wordt aan een conische centrifugale buis van 50 mL toegevoegd om de meet kloof voldoende te laten zweven.
  8. Definieer het aantal frames per tijdspunt [-] in de gebruikersinterface in het menu dat wordt geactiveerd in de GUI- frames per trigger. Stel het aantal frames in op 200 frames per trigger.
    Opmerking: het aantal frames kan worden teruggebracht tot de laagste waarde, wat nodig is voor een statistisch betrouwbaar resultaat. Dit is afhankelijk van de steekproefgrootte die nodig is om een representatieve morfologische celgrootte verdeling te verkrijgen (Zie ook stap 5).
  9. Definieer de framesnelheid [Hz] in het menu dat wordt geactiveerd in de framesnelheidvan de GUI. Kies een framesnelheid waarmee wordt gegarandeerd dat bewegende deeltjes uit een vorig frame niet in het volgende frame worden weergegeven.
    Opmerking: dit kan worden bewezen met een test trigger met 200 frames. Inspecteer de afbeeldingen op deeltjes, die herhaaldelijk worden vastgelegd. Als dit het geval is, verlaagt u de framesnelheid. Voor off line metingen wordt 1 Hz aanbevolen.
  10. Stel de map in, waarin de verkregen afbeeldingen worden opgeslagen, in het menu Algemeen.
  11. Voer een Image Acquisition uit door de knop Start Image trigger Acquisition te activeren. Beweeg de buis met cultuur suspensie zachtjes omhoog en omlaag om een stroom door de meet kloof te induceren.
  12. Herhaal stap 2,5 na elke meting.
  13. Controleer de verkregen afbeeldingen. Cellen moeten scherp genoeg zijn voor annotatie. Inspecteer de afbeeldingen op deeltjes, die herhaaldelijk worden vastgelegd. Als dit het geval is, verlaagt u de framesnelheid.
  14. Sla de instellingen op door het volgende pad te selecteren: C:\Program Files\SOPAT GmbH\monitoringPrograms\camcontrol en druk op Save.

3. identificatie van de deeltjes

  1. Annoteren van deeltjes voor de training van het kunstmatige neurale netwerk (ANN) (Trainingsset).
    1. Laad de verkregen afbeeldingen in de annotatie tool "Fiji, ImageJ" door het bestand te slepen en neer te zetten in het hoofdvenster "imagej" (Zie de GUI "Fiji" tool in Figuur 2)
    2. Open de ROI Manager door te selecteren: analyseren | Tools | ROI Manager.
    3. Kies een selectiegereedschap. Het gereedschap Toverstaf (tracing), vrije hand-, ovaal-of elliptische selecties wordt aanbevolen.
    4. Teken een cirkel rond het deeltje dat moet worden geannoleerd met de eerder genoemde selectiegereedschappen en Verfijn het met het penseel.
    5. Voeg de aantekening toe aan de ROI Manager door op toevoegen [t]te drukken.
    6. Markeer alle objecten van belang (cellen die moeten worden geïdentificeerd) op ongeveer 15 afbeeldingen.
      Opmerking: om alle benodigde informatie te dekken, d.w.z. verschillende vormen, maten, concentratie van cellen, helderheid, enz., gebruikt u vijf afbeeldingen vanaf het begin, vijf afbeeldingen van daartussen en vijf afbeeldingen vanaf het einde van het experiment.
    7. Bepaal of cellen in verschillende subklassen moeten worden ingedeeld vanwege hun vorm (bijvoorbeeldverschillende fasen van een celcyclus) of dat alle cellen van dezelfde klasse zijn.
    8. Wijzig de naam van elke geselecteerde partikels dienovereenkomstig. Stel één naam of afkorting in voor elke klasse en een teller voor elk deeltje van de klasse (bijv.cell_1, cell_2, enz.). Annoteren ten minste 50 deeltjes per klas.
    9. Maak geen aantekeningen bij objecten, die niet moeten worden gedetecteerd, omdat ze niet relevant zijn voor het proces, zoals gasbellen of andere deeltjes zoals niet-opgeloste mediacomponenten.
      Opmerking: deze gebeurtenissen zullen niet worden opgenomen in de opleidings procedure voor de ANN en worden beschouwd als achtergrond.
    10. Maak geen aantekeningen bij cellen die niet scherp zijn.
    11. Annoteren de afbeeldingen zo consistent mogelijk. Als er twijfels zijn, kan het label negeren worden toegepast. Het wordt ten zeerste aanbevolen om het gebruik ervan niet te misbruiken, omdat de ANN alleen structuren herkent die gelabeld zijn.

figure-protocol-2
Figuur 2: Fiji-tool gebruikersinterface. Er wordt een Trainingsset gemaakt met de geannoleerde afbeeldingen. Een handmatige aantekening bestaande uit twee klassen wordt afgebeeld, de lijst met geannoeerde deeltjes wordt weergegeven in de ROI Manager. Verschillende namen en kleuren kunnen voor verschillende klassen worden ingesteld. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

  1. Sla de geannoeerde objecten en de afbeelding op in een ZIP-formaat en stuur het bestand naar het trainingsnetwerk, hetzij via uploaden naar het platform of door het zip-bestand via e-mail te verzenden.
    Opmerking: meestal duurt het een aantal iteratieve trainings rondes om adequate voorspellingen van de geclassificeerde objecten op de afbeeldingen te identificeren. Elke trainingsronde leidt tot een workflow die door het programma wordt geretourneerd.
  2. Gebruik de werkstroom (*. WF) met de getrainde object herkennings algoritme voor het analyseren van testinstallatie kopieën met de gegevens batch vordert programma Batcher die kan worden gestart in het dashboard.
  3. Controleer de objectdetectie op de testafbeeldingen door de kwantificering van vals positieve en negatieve gebeurtenissen.
    1. Kwantificeer de detectie van vals-positieve gebeurtenissen: deeltjes die foutief zijn gedetecteerd als cellen, cellen die niet correct zijn geclassificeerd en cellen waarvan de contour niet goed is geïdentificeerd.
    2. De valse negatieve gebeurtenissen kwantificeren (cellen die niet als zodanig worden herkend).
  4. Visualiseer de resultaten in de tool Result Analyzer door het programma in het dashboard te starten.
    1. Importeer de gewenste resultaten bestanden met File | Bestand of bestand importeren | Importeer mappen.
    2. Visualiseer de resultaten per grafiek | Grafiek maken in de GUI van de grafieken.
    3. Selecteer een van de volgende opties: distributie grafiek, gevoeligheids plot, karakteristiek in de loop van de tijd, karakteristiek boven enquête punten en functie versus functie.
      Opmerking: een handleiding met betrekking tot het gebruik van de resultaten Analyzer wordt geleverd met het systeem en is ook beschikbaar via de ondersteuning.
    4. Als de resultaten aanvaardbaar zijn, voert u de werkstroom in de Batcher op alle verkregen afbeeldingen van het experiment. Tegelijkertijd kan het bewakingsprogramma worden gemaakt door de opgeslagen instellingen van de sonde controller (*. pcfg) te combineren met de workflow (*. WF), zie ook de handleiding.
      Opmerking: de workflow kan ook worden gebruikt voor het bewaken van toekomstige experimenten voor deze cultuur media.
    5. Als de resultaten niet acceptabel zijn, controleert u de aantekening op de Trainingsset en/of gaat u verder met een andere iteratieve trainingsronde (zie stap 4,2).

4. kwantificering van steekproefgrootte

  1. Stel de standaarddeviatie (σ) in, die aanvaardbaar is onder de gedetecteerde deeltjes.
    Opmerking: de standaarddeviatie verandert parallel aan de homogeniteit van de celgrootte. De maximale standaarddeviatie geeft het monster aan met de hoogste mate van heterogeniteit.
  2. Stel de amplitude van het betrouwbaarheidsinterval of de gewenste nauwkeurigheid in ten opzichte van de verwachte variantie van metingen (e).
  3. Stel de toegelaten fout (α) in tussen 5% (z1-α/2 = 1,96) en 10% (z1-α/2 = 1,64).
  4. Bereken het aantal cellen dat van elke klasse moet worden geïdentificeerd uit vergelijking 1.
    figure-protocol-3[Vergelijking 1]
    Opmerking: op basis van het aantal cellen, kan het aantal afbeeldingen dat moet worden aangeschaft voor elk gegevenspunt worden gedefinieerd.
  5. Voer een gevoeligheidsanalyse uit op willekeurige tijdpunten van het experiment om te controleren of de analyse van n-deeltjes leidt tot een variabiliteit van de gemiddelde Feret-diameter en de Dv90 van minder dan 5%. Het kan automatisch worden berekend in de Analyzer result.

5. on line (by-pass) of in lijn meting

  1. Voer eerst de procedure voor off line meting uit (zie stap 2) om de hardware-en software-instellingen als functie van het organisme en het proces (concentratie of media) in te stellen.
  2. Upload de opgeslagen instellingen uit de vorige sectie door het selecteren van de knop laden en selecteer het volgende traject: C:\Program Files\SOPAT GmbH\monitoringPrograms\camcontrol.
  3. Verbind de sonde met de stroomcel of met de bioreactor.
    Opmerking: in situ kunnen metingen worden uitgevoerd met een knijp flens.
  4. Sterilisatie uitvoeren.
    Opmerking: alleen het sonde-bevoafd materiaal van het instrument is steriliseerbaar door middel van stoomsterilisatie. De sonde bevoafde lengte kan gaan van 6 tot 222 mm (Figuur 3).

figure-protocol-4
Figuur 3: schets van de ISM-apparaten. De sonde MM-Ho (A) is direct in de bioreactor te installeren, terwijl de sonde mm 2,1 (B) als een by-pass kan worden gebruikt. De cultuur circulatie is gemarkeerd met pijlen in elke foto. De omrekeningsfactoren zijn 0,166 μm pix-1 voor mm-Ho en 0,087 μm pix-1 voor mm 2,1. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

  1. Definieer het verzamelings percentage voor afbeeldingen in de GUI- Activering in het veld trigger-interval [s].
    Opmerking: afhankelijk van de proces dynamiek kan het beeld bijboekings percentage worden aangepast. Als bijvoorbeeld een vertragingsfase van 3 uur wordt verwacht, kan het acquisitie percentage lager zijn dan wanneer een verschuiving van het metabolisme of de accumulatie van een product wordt gemonitord. Meestal vereist dit een veel kortere acquisitie tijd in het minuten bereik. Een sequentie voor het verzamelen van afbeeldingen tussen 5 en 10 minuten tijdens een batch gist teelt geeft bijvoorbeeld voldoende informatie om de proces dynamiek vast te leggen.
  2. Definieer de framesnelheid zoals uitgelegd in stap 2,10.
    Opmerking: bij on-line en in lijn metingen kan de framesnelheid worden verhoogd, omdat het mechanisch roeren de stroomsnelheid door de opening kan verhogen.
  3. Start Image Acquisition door het activeren van de knop Start Streaming van geselecteerde probe.
  4. Acquisitie stoppen wanneer het experiment is voltooid met de knop stoppen met streamen van geselecteerde sonde.
    Opmerking: voor de 1St run, start de overname net voor de inoculatie van de cultuur en ga verder naar stap 4. Open voor de volgende uitvoeringen de programma bewaking in het dashboard en selecteer de gemaakte werkstroom (zie stap 4). Start de bewaking net voor de inoculatie van de cultuur door op de knop afspelen te drukken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De celgrootte detectie in gist culturen met de ISM en geautomatiseerde beeld detectie om onderscheid te maken tussen ontluikende en niet-ontluikende cellen werd met succes uitgevoerd. Zowel de intensiteit van de stroboscoop als de keuze van de meet kloof hebben een tolerantiebereik, waarbij de deeltjes identificatie niet wordt aangetast. Bijvoorbeeld, S. cerevisiae cellen werden gemeten met verschillende stroboscoop intensiteiten binnen een variatie bereik van 11% bij een droge b...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

ISM zoals hier gepresenteerd met dezelfde of zeer soortgelijke apparaten werd gebruikt voor het meten van de morfologische dynamiek van schimmels, microalgen, en gistcellen, die de bepaling van de groei activiteit mogelijk, en in het geval van algen, intracellulaire product accumulatie. De sensor heeft geen beweegbare onderdelen en is rechtstreeks toepasbaar in elke standaard geroerd tank bioreactor, hetzij via een standaard poort of in een steriliseerbare by-pass. Omdat gist veel kleiner is dan algen, vereiste de afname...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te verklaren.

Dankbetuigingen

De auteurs zijn dankbaar voor de steun van het Duitse federale ministerie van economie en energie binnen het kader van ZIM-koop, project "Smart process inspectie", Grant No. ZF 4184201CR5.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Sensor MM 2.1 - MFCSOPAT GmbH, Duitslandn.v.t.Inline Monocular Microscopic probe Version 2.1 met een Mirco Flow Cell
Sofware versie v1R.003.0092SOPAT GmbH, Duitslandn.v.t.
Diktemetern.n.Het kan van elke leverancier zijn, DIN 2275:2014-03
Ethanol 70%n.n.Het kan van elke leverancier zijn
SOPAT-handleiding Versie 2.0.5SOPAT GmbH, Duitsland
Optisch lenspapierVWR470150-460
Fiji, ImageJopen source
50 mL conische centrifugeerbuisjesHet kan van elke leverancier zijn

Referenties

  1. Maaß, S., Rojahn, J., Hänsch, R., Kraume, M. Automated drop detection using image analysis for online particle size monitoring in multiphase systems. Computers & Chemical Engineering. 45, 27-37 (2012).
  2. Lemoine, A., Delvigne, F., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. Tools for the determination of population heterogeneity caused by inhomogeneous cultivation conditions. Journal of biotechnology. 251, 84-93 (2017).
  3. Marbà-Ardébol, A. M., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. Sterol synthesis and cell size distribution under oscillatory growth conditions in Saccharomyces cerevisiae scale-down cultivations. Yeast. 35 (2), 213-223 (2017).
  4. Xiao, Y., Bowen, C. H., Liu, D., Zhang, F. Exploiting nongenetic cell-to-cell variation for enhanced biosynthesis. Nature chemical biology. 12 (5), 339-344 (2016).
  5. Beutel, S., Henkel, S. In situ sensor techniques in modern bioprocess monitoring. Applied microbiology and biotechnology. 91 (6), 1493(2011).
  6. Belini, V. L., Wiedemann, P., Suhr, H. In situ microscopy: A perspective for industrial bioethanol production monitoring. Journal of microbiological methods. 93 (3), 224-232 (2013).
  7. Havlik, I., et al. Monitoring of microalgal cultivations with on-line, flow-through microscopy. Algal Research. 2 (3), 253-257 (2013).
  8. Suhr, H., Herkommer, A. M. In situ microscopy using adjustment-free optics. Journal of biomedical optics. 20 (11), 116007(2015).
  9. Panckow, R. P., Reinecke, L., Cuellar, M. C., Maaß, S. Photo-Optical In-Situ Measurement of Drop Size Distributions: Applications in Research and Industry. Oil Gas Sci. Technol. - Rev. IFP Energies. 72 (3), 14(2017).
  10. Marbà-Ardébol, A. -M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. Single-cell-based monitoring of fatty acid accumulation in Crypthecodinium cohnii with three-dimensional holographic and in situ microscopy. Process Biochemistry. 52, 223-232 (2017).
  11. Porro, D., Vai, M., Vanoni, M., Alberghina, L., Hatzis, C. Analysis and modeling of growing budding yeast populations at the single cell level. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 75 (2), 114-120 (2009).
  12. Brauer, M. J., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Molecular biology of the cell. 19 (1), 352-367 (2008).
  13. Puxbaum, V., Gasser, B., Mattanovich, D. The bud tip is the cellular hot spot of protein secretion in yeasts. Applied microbiology and biotechnology. 100 (18), 8159-8168 (2016).
  14. Marbà-Ardébol, A. M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. Vol. P2. Prozessmesstechnik. 13. Dresdner Sensor-Symposium 201, Hotel Elbflorenz, Dresden, , 222-225 (2017).
  15. Marbà-Ardébol, A. -M., Emmerich, J., Muthig, M., Neubauer, P., Junne, S. Real-time monitoring of the budding index in Saccharomyces cerevisiae batch cultivations with in situ microscopy. Microbial cell factories. 17 (1), 73(2018).
  16. Marquard, D., Schneider-Barthold, C., Düsterloh, S., Scheper, T., Lindner, P. Online monitoring of cell concentration in high cell density Escherichia coli cultivations using in situ Microscopy. Journal of biotechnology. 259, 83-85 (2017).
  17. Marquard, D., et al. In situ microscopy for online monitoring of cell concentration in Pichia pastoris cultivations. Journal of biotechnology. 234, 90-98 (2016).
  18. Camisard, V., Brienne, J., Baussart, H., Hammann, J., Suhr, H. Inline characterization of cell concentration and cell volume in agitated bioreactors using in situ microscopy: application to volume variation induced by osmotic stress. Biotechnology and bioengineering. 78 (1), 73-80 (2002).
  19. Böhm, A., Ücker, A., Jäger, T., Ronneberger, O., Falk, T. ISOODL: Instance segmentation of overlapping biological objects using deep learning. 2018 IEEE 15th International Symposium on Biomedical Imaging, , 1225-1229 (2018).
  20. Davey, H. M. Life, Death, and In-Between: Meanings and Methods in Microbiology. Applied and environmental microbiology. 77 (16), 5571-5576 (2011).
  21. Lodolo, E. J., Kock, J. L., Axcell, B. C., Brooks, M. The yeast Saccharomyces cerevisiae-the main character in beer brewing. FEMS yeast research. 8 (7), 1018-1036 (2008).
  22. Albertin, W., et al. Population size drives industrial Saccharomyces cerevisiae. alcoholic fermentation and is under genetic control. Applied and environmental microbiology. 77 (8), 2772-2784 (2011).
  23. Gomes, J., Chopda, V. R., Rathore, A. S. Integrating systems analysis and control for implementing process analytical technology in bioprocess development. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 90 (4), 583-589 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

BioprocesbewakingGeautomatiseerde BeeldanalyseNeuraal NetwerkmodelParticle identificatieData analyseCelgrootteverdelingMorfologische BeoordelingReal time Meting

Gerelateerde artikelen