Digitale PCR voor het kwantificeren van de circulerende MicroRNAs in acuut myocardinfarct en hart-en vaatziekten

Samenvatting

Circulerende microRNAs is gebleken belofte als biomarkers voor cardiovasculaire aandoeningen en acuut myocardiaal infarcten. In deze studie beschrijven we een protocol voor extractie van miRNA, omgekeerde transcriptie en digitale PCR voor de absolute kwantificering van miRNAs in het serum van patiënten met hart-en vaatziekten.

Samenvatting

Circulerende serum microRNAs (miRNAs) is gebleken belofte als biomarkers voor de hart-en vaatziekten en acuut myocardinfarct (AMI), vrijgelaten uit de cardiovasculaire cellen in de circulatie. Circulerende miRNAs zijn zeer stabiel en kunnen worden gekwantificeerd. De kwantitatieve expressie van specifieke miRNAs kan worden gekoppeld aan de pathologie, en sommige miRNAs Toon hoge weefsel en de specificiteit van de ziekte. Het vinden van nieuwe biomarkers voor cardiovasculaire aandoeningen is van belang voor medisch onderzoek. Vrij recentelijk heeft digitale polymerase-kettingreactie (dPCR) uitgevonden. dPCR, gecombineerd met fluorescerende hydrolyse sondes, kan specifieke directe absolute kwantificering. dPCR vertoont superieure technische kwaliteiten, met inbegrip van een lage variabiliteit, hoge lineariteit en hoge gevoeligheid ten opzichte van de kwantitatieve polymerase chain reaction (qPCR). DPCR is dus een meer nauwkeurige en reproduceerbare methode voor rechtstreeks het kwantificeren van miRNAs, met name voor het gebruik in grote multi center cardiovasculaire klinische proeven. In deze publicatie beschrijven we het effectief uitvoeren van digitale PCR teneinde de absolute exemplaaraantal in serummonsters.

Inleiding

Circulerende miRNAs hebben geïdentificeerd als veelbelovende markers voor een aantal ziekten, waaronder hart-en vaatziekten¹. De miRNAs zijn kleine, niet-coderende single-stranded RNA moleculen (ongeveer 22 nucleotiden lang) betrokken zijn in de post-transcriptional verordening via de wijziging van de boodschapper-RNA vertaling en beïnvloeden gene expression², en worden vrijgegeven in de circulatie in zowel fysiologische en pathologische staten. De kwantitatieve expressie van specifieke miRNAs kan worden gekoppeld aan de pathologie, en sommige miRNAs tonen hoog weefsel en ziekte specificiteit¹. Cardiovasculaire aandoeningen, miRNAs geworden aantrekkelijke kandidaten als nieuwe biomarkers omdat ze opmerkelijk stabiel in het serum zijn en gemakkelijk kunnen worden gekwantificeerd met behulp van PCR methode³. De potentiële waarde van miRNAs als biomarkers voor myocardiaal infarct is geëvalueerd in kleine studies, maar een validatie in grote cohorten ontbreekt². Bijvoorbeeld, miR-499 komt sterk uitgedrukt in de myocardiale spier, en het is aangetoond dat aanzienlijk worden verhoogd in een AMI^4,5,6. Verder regelt het geprogrammeerde celdood (apoptose) en de differentiatie van cardiomyocytes en gaat dus in verschillende mechanismen na een AMI-⁷. Afgezien van enkele kleine studies rapporteren een superioriteit en incrementele waarde van miRNAs voor de diagnose van AMI, is de superioriteit of gelijkheid aan hoog-gevoeligheids cardiale troponins niet nog bewezen in grootschalig onderzoek^{2,5 ,6,8}. Meer prospectieve studies in grote cohorten zijn, daarom, nodig voor de beoordeling van de potentiële diagnostische waarde van miRNAs. Bovendien, methoden van miRNA kwantificering moeten worden geoptimaliseerd en⁹gestandaardiseerde met behulp van vergelijkbare protocollen. Gestandaardiseerde testen inconsistente resultaten kunnen verminderen en kunnen helpen miRNAs te worden van mogelijke biomarkers voor de routinematige klinische toepassing, zoals biomarkers worden gekwantificeerd in een reproduceerbare manier moeten om hun klinische toepasbaarheid.

Onlangs, dPCR is ingevoerd als een eindpunt analyse. Het partities van het monster in ongeveer 20.000 individuele reacties¹⁰. Vervolgens het dPCR-systeem maakt gebruik van een wiskundige Poisson statistische analyse van fluorescerende signalen (positieve en negatieve reacties), waardoor een absolute kwantificering zonder een standaard curve¹⁰. Bij het combineren van dPCR met fluorescerende hydrolyse sondes, is de zeer specifieke directe absolute kwantificering van miRNAs mogelijk gemaakt. Digitale polymerase-kettingreactie heeft aangetoond dat het vertonen van superieure technische kwaliteiten (met inbegrip van een verminderde variabiliteit, een grotere dagelijkse reproduceerbaarheid, een hoge mate van lineariteit en een hoge gevoeligheid) voor het kwantificeren van miRNA niveaus in de verkeer in vergelijking met kwantitatieve real-time PCR^10,11. Deze superieure technische kwaliteiten kunnen helpen verlichten van de huidige beperkingen op het gebruik van de circulerende miRNAs als biomarkers en kunnen leiden tot de oprichting van miRNAs als biomarkers in grote multi center cardiovasculaire klinische proeven en als een diagnostische methode in algemene. In een eerdere studie, wij onlangs toegepast dPCR voor de absolute kwantificering van de circulerende miRNAs bij patiënten met een AMI en waren in staat om aan te tonen van superieure diagnostische mogelijkheden in vergelijking met de kwantificering van miRNAs door qPCR¹².

In deze publicatie willen we aantonen dat het gebruik van dPCR een nauwkeurige en reproduceerbare methode is voor rechtstreeks kwantificeren cardiovasculaire miRNAs circuleren. De absolute kwantificering van miRNA niveaus in het serum, met behulp van digitale PCR, toont het potentieel voor het gebruik in grote multi center cardiovasculaire klinische proeven. In deze publicatie beschrijven we in detail hoe effectief uitvoeren van digitale PCR en hoe om te ontdekken de absolute miRNA exemplaaraantal in serum.

Protocol

1. extractie van miRNA van Plasma/Serum

Opmerking: Om te kwantificeren miRNAs op de juiste manier, het juiste microRNA isolement van het plasma/serum is een cruciale stap. Een belangrijkste ding in gedachten te houden, vooral omdat verschillende protocollen bestaan, is zich te houden aan dezelfde werkstroom tijdens de verwerking van de monsters. In dit protocol wordt de miRNA geëxtraheerd uit 50 µL van de serum. Gebruik niet meer dan 200 µL als deze limiet de juiste extractieproces.

1. Bereiden van serum of ontdooien van bevroren monsters.
2. Voeg toe 250 µL (5 volumes) commerciële lysis reagens aan 50 µL van de serum. Steun de lysis van vortexing. Plaats de buis met de lysate op de Bank bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
3. Spike de lysate met 3,5 µL van spike-controle (1.6 x 10⁷ kopieën/µL) en meng ze door vortexing.
4. Voeg 50 µL chloroform (dat wil zeggen, een gelijke hoeveelheid over het eerste serummonster) voor de fase-separatie zichtbaar. Goed schudden de buis voor 15 s. plaats de buis op de Bank bij kamertemperatuur gedurende 2-3 minuten.
5. Voor de fasescheiding, centrifugeer de buis bij 12.000 x g bij 4 ° C gedurende 15 minuten.
   Opmerking: De monsters zijn nu opgedeeld in een bovenste waterige fase met de RNA, een witte interfase en een lagere, roze organische fase.
6. Overdracht van de bovenste waterfase (100 µL) met de RNA in een nieuwe buis. Witte interfase materiaal niet overdragen als dit de juiste RNA-telling geschrift.
7. Voeg 150 µL (d.w.z., 1.5 x de hoeveelheid van de overgebrachte monster) van 100% ethanol. Meng de materialen door pipetteren hen op en neer. Geen Centrifugeer ze en snel gaan naar de volgende stap.
8. Pipetteer 250 µL van het monster op een commerciële spin-kolom in een collectie tube van 2 mL. Sluit het deksel. Centrifugeer de kolom > 8000 x g bij kamertemperatuur voor 15 s. negeren de doorstroming.
9. 700 µL van commerciële wassen buffer nummer 1 aan de spin kolom toevoegen. Sluit het deksel en centrifugeer de kolom > 8000 x g bij kamertemperatuur voor 15 s. negeren de run-through wassen buffer.
10. Voeg toe 500 µL van commerciële wassen buffer nummer 2 aan de spin-kolom. Sluit het deksel en centrifugeer de kolom > 8, 000 x g bij kamertemperatuur voor 15 s. negeren de run-through wassen buffer.
11. Pipetteer 500 µL van 80% ethanol naar de spin-kolom. Sluit het deksel, de kolom Centrifugeer > 8, 000 x g bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten negeren de buis van de collectie met de doorstroming.
12. De spin kolom overbrengen in een nieuwe collectie-tube van 2 mL. Centrifugeer de kolom op volle snelheid met een geopende deksel te drogen van het membraan. Gooi de buis van de collectie met de doorstroming.
13. Breng de spin-kolom in een nieuwe 1,5 mL collectie buis. Elueer de RNA door toepassing van de 30 µL van RNase-gratis water rechtstreeks naar het midden van het membraan. Sluit het deksel. Centrifugeer de kolom op volle snelheid voor 1 min.
14. Opslag van RNA bij 70 ° C.
    Opmerking: De opslag van gezuiverde RNA in RNase-gratis water tussen-70 ° C tot-20 ° C garandeert geen afbraak van het RNA voor 1 jaar. Na het protocol van de fabrikant is de minimale hoeveelheid water RNase-vrij om te verdunnen van het RNA 10 µL. met behulp van minder dan 10 µL kan onvoldoende hydrateren het membraan en verminderen de totale opbrengst van RNA.

2. omgekeerde transcriptie

Opmerking: CDNA (cDNA) werd gesynthetiseerd met behulp van de volgende 15 µL omgekeerde transcriptie (RT) protocol (totale reactie volume).

1. Ontdooi de RT kit op ijs. Houd de enzymen in de vriezer, zolang mogelijk om te verhinderen dat ze vernederende en draai ze naar beneden vóór gebruik. RT inleidingen op ijs ontdooien en draai ze naar beneden vóór gebruik.
2. De master mix bereiden zoals beschreven in tabel 1.
3. Combineer 10 µL van master mix en 5 µL van uitgepakte RNA per putje in een 96 well-plate.
4. Centrifugeer het goed plaat bij 2.000 x g bij 4 ° C gedurende 2 minuten.
5. Het protocol van de thermische cyclus wordt beschreven in tabel 2 voor de omgekeerde transcriptie gebruiken.
   Opmerking: Zoals hieronder beschreven, cDNA kan direct worden verwerkt in de digitale PCR machine (Zie Tabel van materialen); Als alternatief kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C.

3. droplet generatie en digitale PCR

Opmerking: Digitale PCR werd uitgevoerd met behulp van het volgende 40 µL-protocol.

1. Ontdooi de commerciële dPCR-mix, bereid cDNA en de PCR inleidingen op ijs. Centrifugeer ze kort voor gebruik.
2. De master mix bereiden zoals beschreven in tabel 3.
3. Voeg 1,33 μl per putje van de RT-product en het kort centrifugeren.
4. Pipetteer 20 μL van het monster in elk putje van de 8-well cassette (middellange rij).
   Opmerking: Als de 8-well cassette niet volledig is gevuld, vul de resterende putjes met niet-template besturingselementen (NTC) die weglaten van cDNA (dat wil zeggen, het product van de RT geproduceerd met water in plaats van uitgepakte RNA) of commerciële buffer dPCR. De NTC dient als een controle van de besmetting. Water mag niet worden gebruikt in de overige wells, want dat zal afbreuk doen aan de kwaliteit van de vorming van de druppel.
5. Pipetteer 70 μL van de druppel generatie olie voor de sondes in de oliebronnen (onderste rij) van de 8-well-cassette.
6. Plaats een pakking op de top van de 8-well cassette en plaats de cassette in de droplet-generator. Sluit de droplet-generator. Wacht totdat de 3 indicatorlampjes stevige groen zijn.
   Opmerking: Druppels nu worden gegenereerd.
7. Zorgvuldig en langzaam Pipetteer 40 μL van de druppel gevormde monster (bovenste rij) in aparte wells van een 96-wells-plaat door pipetteren.
8. Na het voltooien van de vorming van de druppel op de monsters, het zegel van de PCR-plaat met een pierceable dPCR folie bij 180 ° C voor 4 s.
9. Plaats de folie-verzegeld PCR-plaat in de cycler en cyclus het zoals beschreven in tabel 4, met een snelheid van de helling van 2,5 ° C/s.

4. droplet lezen en analyseren

1. De plaat van de thermische cycler overbrengen aan de basis van de houder van de plaat. Draai de PCR-plaat door het plaatsen van de bovenkant van de plaat houder op het bord van de PCR.
2. Start de commerciële dPCR software.
3. Voer de naam van het monster, de naam van het experiment, en het doel in de setup. Selecteer de absolute kwantificering.
4. Start de druppel lezen door te klikken op uitvoeren. Selecteer FAM/HEX of FAM/VIC als detectie chemie bij het werken met hydrolyse sondes.
   Opmerking: De commerciële dPCR software zal vervolgens auto-analyseren van de gegevens.
5. Controleer de nummers van de druppel in de tabel van de resultaten om ervoor te zorgen een juiste druppel-generatie.
6. Selecteer alle putjes met de dezelfde gekwantificeerde miRNA en klik op analyseren. Gebruik de 2D vlek om te markeren van positieve druppels en handmatig corrigeren de auto-geanalyseerd gegevens (Figuur 1).

5. de juiste berekeningen van de steekproef

1. Normaliseren van het monster door het monster met de normalisatie-factor (NF) te vermenigvuldigen.
   NF = mediaan [C. elegans miR-39 metingen]_{alle samples}/ [C. elegans miR-39]_monster
2. Bereken de definitieve miRNA serum-concentratie, aanpassen voor verdunningsfactoren (DF).
   [miRNA] _laatste = [miRNA]_{ruwe waarde} x DF_RT x DF_dPCR x DF_Ex
   Waar:
   [miRNA] _{ruwe waarde} = de miRNA gekwantificeerd door commerciële dPCR software;
   DF_RT = de verdunningsfactor van de sjabloon in omgekeerde transcriptie;
   DF_dPCR = de verdunningsfactor van de sjabloon in dPCR;
   DF_Ex = de verdunningsfactor bij de extractie.

6. synthetische Oligonucleotide verdunningsreeks

1. Ontdooi gelyofiliseerd synthetische oligonucleotide op ijs. Kort na het centrifugeren.
2. Verdun de gelyofiliseerd synthetische oligonucleotide in nuclease-gratis water met een eindconcentratie van 10 pmol / µL. kort centrifugeren het.
3. Verdun het in nuclease-gratis water zoals beschreven in tabel 5. Centrifugeer de verdunning kort tussen elke verdunning stap bij 8.000 x g gedurende 10 s.
4. Doorgaan met de omgekeerde transcriptie, zoals beschreven in stap 2 en analyseren van de monsters met digitale PCR, zoals beschreven in stap 3 en stap 4.

Resultaten

Digitale PCR gecombineerd met fluorescerende hydrolyse sondes kan onderzoekers de absolute bedragen van specifieke miRNAs in kopieën/µL rechtstreeks te kwantificeren. Als het monster in dPCR is gepartitioneerd in ongeveer 20.000 afzonderlijke PCR reacties, dPCR vereist geen technische repliceert¹⁰. Het dPCR-systeem maakt gebruik van een wiskundige Poisson statistische analyse van fluorescerende signalen (verschillen tussen positieve en negatieve reacties) een absol...

Discussie

Digitale PCR is een relatief nieuwe eindpunt methode van PCR waarmee de directe absolute kwantificering van nucleïnezuren binnen een steekproef. De methode heeft bepaalde voordelen, zoals een verminderde variabiliteit, een grotere dagelijkse reproduceerbaarheid en een superieure gevoeligheid^11,12. Verder, als gevolg van het partitioneren van het monster in ongeveer 20.000 enkele reacties en eindpunt analyses, dPCR is robuuster aan storende stoffen in PCR in verge...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
RNA-Extractie
miRNeasy Serum/Plasma Kit (50)	Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland	217184	Kit voor microRNA extractie. Kit bevat commerciële buffer RWT (genoemd nummer één in het manuscript)  en RPE (genoemd nummer twee in manuscript).
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in-Control; Syn-cel-miR-39 miRNA; 10pmol	Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland	219610	Spike-in voor normalisatie, Sequence: 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3'
Omgekeerde transcriptie
TaqMan MicroRNA Omgekeerde transcriptie kit (1000 reacties)	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4366597	Kit voor microRNA omgekeerde transcriptie
TaqMan MicroRNA Assays M	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	Assays gebruikt bij omgekeerde transcriptie
hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR reacties)	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	Assay Nummer 001352
cel-miR-39 (750 RT/750 PCR reacties)	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	Assay Nummer 000200
PCR-plaat, 96-well, gesegmenteerd, half-omzoomd	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	AB0900	96 well plaat voor omgekeerde transcriptie
Microseal ‘B’ seal Seals	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	MSB1001	Folie om juiste opslag te garanderen
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1851196	Cycler gebruikt voor omgekeerde transcriptie
Droplet Digital PCR
100 nmol RNA oligo hsa-miR-499-5p	Integrated DNA Technologies	Custom	Sequence: 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3'
ddPCR Supermix voor Probes (geen dUTP)	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863024	Supermix gebruikt bij druppelgeneratie
TaqMan MicroRNA Assays	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	Assays gebruikt in digitale PCR (fluorescente hydrolyse sonde)
hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR reacties)	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	Assay Nummer 001352, commerciële primers
cel-miR-39 (750 RT/750 PCR reacties)	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	Assay Nummer 000200, commerciële primers
DG8 Cartridges en pakkingen	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1864007	Cartridge neemt maximaal 8 monsters op voor druppelgeneratie
DG8 Cartridge Holder	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863051	Houdt cartridges vast bij druppelgeneratie
Droplet Generation Olie voor Probes	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863005	Olie gebruikt bij druppelgeneratie
ddPCR 96-Well Plates	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	12001925	96 well plaat voor ddPCR
PCR Plate Heat Seal, folie, doorboorbaar	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1814040	Doorboorbare folie, compatibel met druppellezer
ddPCR Druppel Reader Olie	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863004	Olie gebruikt bij druppellezing
QX100 of QX200 Druppel Generator	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863002	Druppel Generator, genereert de druppels uit monster/olie emulsie
PX1 PCR Plate Sealer	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1814000	Verzegeld de plaat voor PCR
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1851196	Cycler gebruikt voor ddPCR
QX100 of QX200 Druppel Reader	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863003	Lees PCR-positieve en PCR-negatieve druppels met een optische detector
ddPCR Buffer Control voor Probes	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863052	Blanco controle en om de resterende putjes van 8-putjes cassette te vullen
Software
QuantaSof Software	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1864011	Programma voor druppellezing
Prism Windows 5	GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA		Programma voor statistische analyse