Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Detectie van virussen van Bioaerosols met behulp van Anion Exchange hars

7.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58111

⸱

22 augustus 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1High Plains Intermountain Center for Agricultural Health and Safety, Department of Environmental and Radiological Health Sciences, Colorado State University, 2National Wildlife Research Center, Wildlife Services, Animal and Plant Health Inspection Service, United States Department of Agriculture, 3Western Sydney University, 4Leprino Foods, Inc, 5Department of Food Science and Agricultural Chemistry, McGill University, 6Department of Mechanical Engineering, Colorado State University, 7Department of Animal Science, University of Wyoming

In dit artikel

Samenvatting

Een anion wisselen hars gebaseerde methode, aangepast aan vloeistof impingement gebaseerde bioaerosol bemonstering van virussen is aangetoond. Wanneer gekoppeld aan downstream moleculaire detectie, zorgt de methode voor facile en gevoelige detectie van virussen van bioaerosols.

Samenvatting

Dit protocol wordt een aangepaste bioaerosol bemonsteringsmethode voor virussen. Anion uitwisseling hars is in dit systeem, in combinatie met vloeibare impingement-gebaseerde air sampling apparaten voor effectieve concentratie van negatief geladen virussen van bioaerosols. Dus, de hars fungeert als een extra concentratie stap in de werkstroom bioaerosol bemonstering. Nucleïnezuur extractie van de virale deeltjes wordt vervolgens rechtstreeks vanuit de anion uitwisseling hars, met het resulterende monster geschikt voor moleculair analyses uitgevoerd. Verder, dit protocol beschrijft een custom-built bioaerosol kamer geschikt voor het genereren van virus-beladen bioaerosols onder een verscheidenheid van milieu-omstandigheden en rekening houdend met de continue monitoring van omgevingsvariabelen zoals temperatuur, vochtigheid, windsnelheid en de massaconcentratie aërosol. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van dit protocol is verhoogde gevoeligheid van de detectie van virale, zoals beoordeeld via directe vergelijking met een ongewijzigde conventionele vloeibare impinger. Andere voordelen zijn het potentieel te concentreren divers negatief geladen virussen, de lage kosten van anion uitwisseling hars (~$0.14 per monster), en gebruiksgemak. Nadelen onder meer het onvermogen van dit protocol te beoordelen van de infectiviteit van hars-geadsorbeerde virale deeltjes, en potentieel de noodzaak voor de optimalisatie van de vloeistof bemonstering buffer gebruikt binnen de impinger.

Inleiding

Het doel van deze methode is een zeer gevoelige bioaerosol bemonstering platform om moleculaire detectie van virussen negatief geladen bioaerosols te bieden. Micro-organismen, met inbegrip van virale deeltjes, kunnen overleven in bioaerosols voor langere tijd1. Bioaerosols kunnen reizen over relatief lange afstanden en onderhouden van levensvatbaarheid en infectiviteit, zoals blijkt uit een uitbraak van veteranenziekte die afkomstig van industriële koeltorens zijn, gelegen op een afstand van 6 km van de getroffen personen en resulteerde in 18 doden2. Indirecte overdracht van virussen bij de mens gemedieerd door bioaerosols kan voorkomen in meerdere instellingen en heeft aangetoond voor uitbraken van norovirus in scholen en restaurants3,4. Evenzo, bioaerosol transmissie van virussen kan optreden in agrarische instellingen zoals in varkens en pluimvee boerderijen, met deze transmissie route wordt beschouwd als een belangrijke factor in het verkeer van virussen tussen productie faciliteiten5, 6 , 7 , 8 , 9.

Effectieve bemonstering van virus-beladen bioaerosols zorgt voor verbetering in de snelle diagnostiek en paraatheid in geval van uitbraak preventie, zoals wordt weergegeven in de demonstraties in welke H5 influenza een virussen werden waargenomen van bioaerosols in levende dier in China markten en de Verenigde Staten10,11. Huidige bioaerosol bemonstering technologieën omvatten een aantal verschillende deeltje vangen beginselen, en in grote lijnen kunnen worden onderverdeeld in impingers, cyclonen, botslichamen en filters,12. Het valt buiten het toepassingsgebied van dit protocol uitputtend voor alle voordelen en nadelen van deze platforms voor bemonstering van virussen van bioaerosols; echter kan worden gesteld dat de meerderheid van deze bemonstering apparaten niet zijn geoptimaliseerd voor het verzamelen van virussen en bacteriofagen13. Infectiviteit van virale deeltjes is bovendien vaak negatief beïnvloed, met vloeibare impingers beschouwd als virale infectiviteit effectiever dan bemonstering van apparaten zoals solid botslichamen of filters14handhaven. Een nadeel van vloeibare impingement is echter het doel verwateringseffect, die optreedt omdat virussen verzameld in relatief grote hoeveelheden (meestal ≥20 mL) vloeistof in het vat van de collectie worden. Een ander belangrijk nadeel houdt de suboptimaal efficiëntie van vloeibare impingers te concentreren deeltjes < 0,5 µM in grootte15. Echter is dat de efficiëntie van de opname van deze apparaten kan worden verbeterd door immobilisatie op solide matrices, zoals immobilisatie met behoud van virale nucleïnezuren en virale infectiviteit16,17 verbeteren kan.

Wij hebben eerder aangetoond dat anion uitwisseling hars een doeltreffend instrument voor het afvangen en de concentratie van virussen van vloeibare matrices is, met inbegrip van F-RNA bacteriofagen, hepatitis A-virus, menselijke adenovirus en rotavirus18,19 ,20. Zoals omschreven door de fabrikant, is de anion uitwisseling hars gebruikt in dit werk een macroreticular polystyreen sterke base anion uitwisseling hars waarin matiemaatschappij quaternaire amine groepen bemiddelen attractie en de verovering van anionen in een vloeibaar medium21 . Bijgevolg, het anion uitwisseling hars wordt verwacht te vangen van de virussen met net-negatieve oppervlakte kosten, met inbegrip van vele darmen virussen, influenzavirussen en andere virussen die relevant zijn voor de volksgezondheid en diergezondheid.

Het huidige protocol omvat de toevoeging van een vloeibare impinger hars anion uitwisseling. In dit systeem fungeert de hars als een secundaire concentratie stap voor virale deeltjes gevangen in de impinger vloeistof. Nucleic zuren kunnen dan direct in kleine volumes, een geconcentreerde steekproef te voorzien van moleculair analyses worden uitgewassen. Dus, het belangrijkste voordeel van deze methode is de verbetering van de gevoeligheid van de virale detectie, voornamelijk door middel van vermindering van monstervolume. Bovendien, als gevolg van de inherente aspecifieke verovering van negatief geladen virussen, de methode is waarschijnlijk die van toepassing zijn voor de detectie van een groot aantal virussen van belang. Hier is de methode voor de vaccinstammen van type A en type B-influenzavirussen en het FRNA coliphage MS2 (MS2) aangetoond. Deze virussen zijn later ontdekt met behulp van standaard qRT-PCR-testen als eerder beschreven22. De eindpunt-gebruiker moet niet verwachten dat problemen bij het uitvoeren van deze methode, omdat wijzigingen in de momenteel bestaande apparatuur vormen geen grote verstoringen van de conventionele stroom van bioaerosol bemonsterings- en analysemethoden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. installatie van de kamer van Bioaerosol (Zie Figuur 2)

  1. Pre-load van de vloeibare impingers met 20 mL 0,01 M fosfaatgebufferde zoutoplossing, pH 7.5 (PBS).
    1. Voeg toe 0,5 g anion uitwisseling hars en schorten binnen de PBS van één van de vloeibare impingers, met een andere vloeibare impinger bijeenkomen van een besturingselement.
  2. Positie vloeibare impingers parallel in de kamer van de bioaerosol stands van de klem met aërosol inhammen geconfronteerd met de vernevelaar.
    Opmerking: Zie Figuur 2 voor verdere bijzonderheden.
  3. Samen Zoek een monitor direct lezen aërosol in de buurt van de vloeibare impingers voor het meten van massa concentratie (mg/m3) van de bioaerosol.
  4. Extra direct lezen instrumentatie (binnenlucht kwaliteit monitor en thermische anemometer) samen te vinden in de buurt van de vloeibare impingers om te controleren van de omgevingsvariabelen, zoals temperatuur, relatieve vochtigheid en wind snelheid, binnen de bioaerosol-zaal.
  5. Axiaalventilatoren worden uitgevoerd in de hoeken van de kamer van de bioaerosol om de vermenging van aërosol.
    Opmerking: Axiaalventilatoren draaien op een vaste snelheid en zijn niet verstelbaar.

2. model Bioaerosolization experimenten (Zie Figuur 3)

  1. Seriële poort, 10-fold verdunningen van MS2 bacteriofaag en influenza vaccin aan gewenste concentraties in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) uitvoeren.
    Opmerking: Om aan te tonen van de methode hier 103.5 FFU/mL van het type A en B virus vaccin influenzastammen en 105 PFU/mL van de bacteriofaag MS2 worden gebruikt. Om te bepalen titers voor het entmateriaal, zijn bacteriofagen doorgegeven in Escherichia coli HS (pFamp) R en opgesomd als eerder beschreven20. De commerciële vaccin bevat bekende hoeveelheden van de vier levende verzwakte influenza virusstammen, twee type een influenza-virussen en twee typeB influenzavirussen, uitgedrukt in eenheden van fluorescerende focus of FFU.
  2. Bereiden van entmateriaal binnen het glas vaartuig van een vernevelaar 6-jet botsing door het creëren van schorsingen van de gewenste concentraties van virale deeltjes in 100 mL PBS en installeren binnen de aangepaste bioaerosol-zaal.
  3. Initiëren van instrumentatie voor het meten van variabelen in de vergaderzaal van de bioaerosol, zoals temperatuur, % relatieve vochtigheid, CO2-concentratie, en windsnelheid (gegenereerd met behulp van een Axiaal ventilator). Een direct-lezen aërosol monitor gebruiken om bij te houden van de massaconcentratie binnen de bioaerosol kamer en om consistentie binnen en tussen de proeven.
  4. Zegel van de bioaerosol-zaal en purge voor 10 min met HEPA-gefilterd lucht.
  5. Gefilterde, gedroogde lucht leveren aan de vernevelaar op 6.9 kPa.
  6. Een concentratie van de doelgroep van virale bioaerosols (via vernevelaar) genereren in elke proef bioaerosol-zaal. Voor deze demonstratie vormt en worden bioaerosols met een concentratie van 5 mg/m3 gegenereerd.
  7. Zodra de massaconcentratie van de doelstelling van het aërosol is bereikt, stopt de nebulization.
  8. Werken een luchtpomp voor bemonstering voor elke vloeibare impinger die is gekalibreerd met een debiet van 12,5 L/min. gedrag kalibratie met een standaard primaire stroom vóór en na elke bemonstering evenement te zorgen voor samenhang in de bemonstering van volume. Levering verdunning lucht via een HEPA-gefilterd-lijn in de buurt van de vernevelaar en constante druk in de zaal blijven.
  9. Actief genieten van de sfeer van de kamer bioaerosol voor een periode van 40 min tot een volume van de bemonstering van 500 L per monster.
    Opmerking: Bemonstering voor 40 min op 12,5 L/min met twee pompen parallel maakt het mogelijk voor bemonstering van 1.000 L van de bioaerosol. Dus, aan het einde van het experiment verwacht wordt dat de meerderheid van de lucht in de bioaerosol zaal is bemonsterd en in het milieu via een systeem van HEPA-gefilterd vrijgegeven. Dit blijkt uit de afname van de concentratie van het deeltje. Na experiment, oppervlakken worden ontsmet met 10% huishoudelijk bleekmiddel en 70% ethanol. Indicatoren worden gebruikt in deze demonstratie; echter, indien bekend pathogene organismen worden gebruikt in dit systeem, extra bioveiligheid maatregelen kunnen worden uitgevoerd indien nodig.

3. nucleïnezuur extractie en qRT-PCR detectie

  1. Isoleren van nucleïnezuren rechtstreeks vanuit anion uitwisseling hars en, voor vergelijkingsdoeleinden, uit de vloeistof binnen de vloeibare impingers gebruikt. In dit voorbeeld een RNA isolatie procedure wordt beschreven, maar een vergelijkbaar protocol kan worden gebruikt voor DNA-virussen.
    1. Nucleïnezuur afscheiding van de anion uitwisseling hars.
      1. Alle van de anion uitwisseling hars-bevattende vloeistof van de vloeibare impinger overbrengen in een steriele 50 mL conische buis.
      2. Laat de hars te regelen, en langzaam decanteren in de vloeibare monster uit de hars van de uitwisseling anion. Gebruik een 1 mL pipet tip alle van de resterende vloeistof van het anion uitwisseling hars te verwijderen.
      3. Een virale RNA isolatie kit, voeg 560 µL van virale lysis-buffermengsel met vervoerder RNA rechtstreeks naar de anion uitwisseling hars en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur met periodieke mengen.
      4. Met behulp van een 1 mL pipet tip, transfer de virale lysate (de virale lysis-buffermengsel) tot een steriele 1,5 mL conische buis en ga verder met RNA isolatie met behulp van een virale RNA-isolatie kit (Zie Tabel van materialen) volgens instructies van de fabrikant, behalve dat RNA wordt geëlueerd in een totaal volume van 60 µL van elutie buffer.
    2. Nucleïnezuur afscheiding van vloeibare impingers.
      1. Pipetteer 140 µL van het vloeibare monster in een steriele 1,5 mL conische buis en het uitvoeren van RNA isolatie met behulp van de virale RNA isolatie kit overeenkomstig de instructies van de fabrikant, met uitzondering van eluerende RNA in een totaal volume van 60 µL van elutie buffer.
        Opmerking: 140 µL is het maximale monstervolume dat met de specifieke virale RNA isolatie kit hier tewerkgesteld in een-voor-stapmodus preparaat kan worden verwerkt.
  2. Uitvoeren qRT-PCR voor detectie van MS2 en influenza-A en B-virussen als eerder beschreven23,24. In deze demonstratie vormt en 5 µL van nucleïnezuur eluaten gebruikt voor qRT-PCR.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Figuur 1 toont het beginsel achter kosten gebaseerde vangst van de virussen van bioaerosols via opneming van hars in vloeistof gebaseerde impingers. Figuur 2 toont de setup van de op maat gemaakte bioaerosol kamer. Figuur 3 beschrijft de stappen die betrokken zijn bij het opzetten van het experiment van de aerosolization en de maatregelen om te zorgen voor kwaliteitscontrole. Fig...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol beschrijft een methode voor gevoelige virale vangen van bioaerosols met behulp van gemodificeerde vloeibare impingers. De methode is geoptimaliseerd voor de detectie en kwantificering van de virale lading in bioaerosols. De specifieke wijziging hier gedemonstreerd omvat de toevoeging van vloeibare deel uitmaakt van een gemeenschappelijke vloeibare impinger hars anion uitwisseling. Deze methode werd ontwikkeld voor zijn eenvoud in verwerking stroomafwaarts monster, terwijl andere verwerkingstechnieken monster...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door de financiering van het CDC/NIOSH High Plains Intermountain centrum voor landbouw en gezondheid (5U54OH008085) en de Colorado Bioscience Discovery evaluatie Grant programma (14BGF-16).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Escherichia coli bacteriofaag MS2 (ATCC 15597-B1)American Type Culture CollectionATCC 15597-B1
FluMist QuadrivalentAstraZenecaContact opnemen met de fabrikantDe virale bestanddelen van dit vaccin kunnen jaarlijks veranderen
CFX96 Touch Real-Time PCR-detectiesysteemBio-Rad1855195
Primers en probesIntegrated DNA TechnologiesNA
0,2 µM steriele filterNANA
1 L pyrex-flessen of equivalentNANA
1 mL pipetpuntenNANA
1 mL pipettorNANA
50 mL serologische pipetNANA
PCR-buisjesNANA
Pipet-aid of equivalentNANA
QIAamp Viral RNA Mini KitQiagen52904
QuantiTect Probe RT-PCR KitQiagen204443
Amberlite IRA-900 chloridevormSigma-Aldrich216585-500G
Fosfaatgebufferde zoutoplossingSigma-AldrichP5368-10PAK
Water (moleculaire biologie kwaliteit)Sigma-AldrichW4502-1L
Eppendorf DNA LoBind microcentrifugebuisjesThermoFisher13-698-791
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes ThermoFisher14-432-22
Falcon Polypropylene Centrifuge TubesThermoFisher05-538-62
SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit met ROXThermoFisher11745100
SKC Biosampler 20 mL, 3-delige glazen setSKC Inc.225-9593
Vac-u-Go monsterpompenSKC Inc.228-9695
Collison vernevelaar (6-jet)BGI Inc.NA
HEPA-capsulePALL12144
Q-TRAK indoor air quality monitor 8554TSI Inc.NA
Alnor velometer thermische anemometer AVM440-ATSI Inc.NA
SidePak AM510 persoonlijke aerosolmonitorTSI Inc.NA
BioaerosolkamerNANA

Referenties

  1. Pirtle, E. C., Beran, G. W. Virus survival in the environment. Revue scientifique et technique (International Office of Epizootics). 10 (3), 733-748 (1991).
  2. Nguyen, T. M., et al. A community-wide outbreak of legionnaires disease linked to industrial cooling towers--how far can contaminated aerosols spread? The Journal of Infectious Diseases. 193 (1), 102-111 (2006).
  3. Marks, P. J., et al. Evidence for airborne transmission of Norwalk-like virus (NLV) in a hotel restaurant. Epidemiology and Infection. 124 (3), 481-487 (2000).
  4. Marks, P. J., et al. A school outbreak of Norwalk-like virus: Evidence for airborne transmission. Epidemiology and Infection. 131 (1), 727-736 (2003).
  5. Corzo, C. A., Culhane, M., Dee, S., Morrison, R. B., Torremorell, M. Airborne detection and quantification of swine influenza a virus in air samples collected inside, outside and downwind from swine barns. PLoS One. 8 (8), e71444(2013).
  6. Anderson, B. D., et al. Bioaerosol sampling in modern agriculture: A novel approach for emerging pathogen surveillance. The Journal of Infectious Diseases. 214 (4), 537-545 (2016).
  7. Hietala, S. K., Hullinger, P. J., Crossley, B. M., Kinde, H., Ardans, A. A. Environmental air sampling to detect exotic Newcastle disease virus in two California commercial poultry flocks. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 17 (2), 198-200 (2005).
  8. Jonges, M., et al. Wind-mediated spread of low-pathogenic avian influenza virus into the environment during outbreaks at commercial poultry farms. PLoS One. 10 (5), e0125401(2015).
  9. Otake, S., Dee, S. A., Jacobson, L., Torremorell, M., Pijoan, C. Evaluation of aerosol transmission of porcine reproductive and respiratory syndrome virus under controlled field conditions. The Veterinary Record. 150 (26), 804-808 (2002).
  10. Wu, Y., et al. Aerosolized avian influenza A (H5N6) virus isolated from a live poultry market, China. The Journal of Infection. 74 (1), 89-91 (2017).
  11. Choi, M. J., et al. Live animal markets in Minnesota: A potential source for emergence of novel influenza A viruses and interspecies transmission. Clinical Infectious Diseases. 61 (9), 1355-1362 (2015).
  12. Haig, C. W., Mackay, W. G., Walker, J. T., Williams, C. Bioaerosol sampling: Sampling mechanisms, bioefficiency and field studies. The Journal of Hospical Infection. 93 (3), 242-255 (2016).
  13. Anderson, B. D., Lednicky, J. A., Torremorell, M., Gray, G. C. The use of bioaerosol aampling for airborne virus surveillance in swine production facilities: A mini review. Frontiers in Veterinary Science. 4, 121(2017).
  14. Verreault, D., Moineau, S., Duchaine, C. Methods for sampling of airborne viruses. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 72 (3), 413-444 (2008).
  15. Hogan, C. J. Jr Sampling methodologies and dosage assessment techniques for submicrometre and ultrafine virus aerosol particles. Journal of Applied Microbiology. 99 (6), 1422-1434 (2005).
  16. Yu, K. -P., Chen, Y. -P., Gong, J. -Y., Chen, Y. -C., Cheng, C. -C. Improving the collection efficiency of the liquid impinger for ultrafine particles and viral aerosols by applying granular bed filtration. Journal of Aerosol Science. 101, 133-143 (2016).
  17. Perez-Mendez, A., et al. Evaluation of a simple and cost effective filter paper-based shipping and storage medium for environmental sampling of F-RNA coliphages. J Virol Methods. 194 (1-2), 60-66 (2013).
  18. Chandler, J. C., et al. Field-based evaluation of a male-specific (F+) RNA coliphage concentration method. Journal of Virological Methods. 239, 9-16 (2017).
  19. Perez-Mendez, A., Chandler, J. C., Bisha, B., Goodridge, L. D. Concentration of enteric viruses from tap water using an anion exchange resin-based method. Journal of Virological Methods. 206, 95-98 (2014).
  20. Perez-Mendez, A., Chandler, J. C., Bisha, B., Goodridge, L. D. Evaluation of an anion exchange resin-based method for concentration of F-RNA coliphages (enteric virus indicators) from water samples. Journal of Virological Methods. 204, 109-115 (2014).
  21. Kammerer, J., Carle, R., Kammerer, D. R. Adsorption and ion exchange: Basic principles and their application in food processing. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 59 (1), 22-42 (2011).
  22. Chandler, J. C., et al. A method for the improved detection of aerosolized influenza viruses and the male-specific (F+) RNA coliphage MS2. Journal of Virological Methods. 246, 38-41 (2017).
  23. Friedman, S. D., Cooper, E. M., Calci, K. R., Genthner, F. J. Design and assessment of a real time reverse transcription-PCR method to genotype single-stranded RNA male-specific coliphages (Family Leviviridae). Journal of Virological Methods. 173 (2), 196-202 (2011).
  24. Selvaraju, S. B., Selvarangan, R. Evaluation of three influenza A and B real-time reverse transcription-PCR assays and a new 2009 H1N1 assay for detection of influenza viruses. Journal of Clinical Microbiology. 48 (11), 3870-3875 (2010).
  25. Cademartiri, R., et al. Immobilization of bacteriophages on modified silica particles. Biomaterials. 31 (7), 1904-1910 (2010).
  26. Michen, B., Graule, T. Isoelectric points of viruses. Journal of Appled Microbiology. 109 (2), 388-397 (2010).
  27. Turgeon, N., Toulouse, M. J., Martel, B., Moineau, S., Duchaine, C. Comparison of five bacteriophages as models for viral aerosol studies. Applied and Environmental Microbiology. 80 (14), 4242-4250 (2014).
  28. Vergara, G. G., et al. Evaluation of FRNA coliphages as indicators of human enteric viruses in a tropical urban freshwater catchment. Water Research. 79, 39-47 (2015).
  29. Tung-Thompson, G., Libera, D. A., Koch, K. L., de Los Reyes, F. L. 3rd, Jaykus, L. A. Aerosolization of a human norovirus surrogate, bacteriophage MS2, during simulated vomiting. PLoS One. 10 (8), e0134277(2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Bemonstering van bioaerosolenvirusdetectievloeistofimpingerextractie van nucleïnezurenqRT-PCR-detectiebioaerosolkamermilieumonitoringvirale concentratieMS2-bacteriofaag
Detectie van virussen van Bioaerosols met behulp van Anion Exchange hars
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.