Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Hele cel electrofysiologie van primaire gekweekte lymfkliertest Enterochromaffin cellen

10.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58112

⸱

26 september 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Enteric Neuroscience Program, Division of Gastroenterology & Hepatology,Department of Physiology & Biomedical Engineering, Mayo Clinic, 2Division of Gastroenterology, Department of Medicine, University of Massachusetts Medical School

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Enterochromaffin (EG) cellen bestaan uit een kleine subset van gastro-intestinale epitheliale cellen. EG cellen zijn elektrisch prikkelbaar en vrij serotonine, nog moeilijkheden in kweken en het identificeren van de EG cellen hebben beperkte fysiologische studies. De methode die hier gepresenteerd wordt een primaire cultuur model vatbaar voor onderzoek van afzonderlijke cellen van de EG vastgesteld door electrofysiologie.

Samenvatting

Enterochromaffin (EG) cellen in het gastro-intestinaal epitheel (GI) vormen de grootste subpopulatie van enteroendocrine cellen. Als gespecialiseerde zintuigcellen, EG cellen zin luminal prikkels en hen omzetten in serotonine (5-hyroxytryptamine, 5-HT) release gebeurtenissen. De elektrofysiologie van deze cellen is echter slecht begrepen, omdat ze moeilijk te cultuur en zijn te identificeren. De methode voorgesteld in dit papier contouren primaire EG celculturen geoptimaliseerd voor eencellige electrofysiologie. Dit protocol maakt gebruik van een verslaggever van de transgene cyaan fluorescente proteïne (GVB) om te identificeren muis EG cellen in gemengde primaire culturen, bevordering van de aanpak voor het verkrijgen van kwalitatief hoogwaardige opnames van hele cel electrofysiologie in spanning - en stroom-clamp modi.

Inleiding

Het gastro-intestinaal epitheel (GI) is een diverse Gemeenschap, bestaande uit verschillende celtypes. Enteroendocrine cellen bestaan uit ongeveer 1% van alle epitheliale cellen, en enterochromaffin (EG) cellen zijn de grootste enteroendocrine cel bevolking1. Recente studies tonen aan dat enteroendocrine2 en EG3,4 cellen elektrisch prikkelbaar zijn. Wij zijn geïnteresseerd in het begrijpen van de primaire EG cel electrofysiologie. Dus, het doel van deze studie was om primaire EG celculturen geoptimaliseerd voor hele cel electrofysiologie.

Bestaande EG-cel lijnen die produceren en afscheiden van 5-HT (bijvoorbeeld QGP-1-5, BON6, KRJ-1-7) en zijn gebruikt voor het onderzoeken van de elektrofysiologie5,8 zijn meestal gegenereerd op basis van vereeuwigd neoplastische weefsels. Terwijl de informatie overgenomen van deze cellijnen waardevolle5,8 is, zijn studies van de primaire cel electrofysiologie noodzakelijk om goed te begrijpen EG celfysiologie. De elektrofysiologie van primaire cellen van de EG is vereist voor de isolatie en de cultuur van één epitheliale cellen, die heeft is beperkt door lage levensvatbaarheid van epitheliale culturen.

De methode van de cultuur gepresenteerd in deze studie is gebaseerd op transgene muizen met fluorescently geëtiketteerde EG-cellen, zoals Tph1-GVB9, gebruikt in deze studie. De methode optimaliseert gemengde primaire epitheliale culturen ontwikkeld eerder2,,10 voor eencellige electrofysiologie3. Vorige methoden gebruikt combinaties van trypsine/EDTA plus Collagenase A of EDTA en DTT voor enzymatische spijsvertering en dichtheid verlopen te specifiek isoleren en cultuur cavia11 en rat EG cellen12. Meer recentelijk, intestinale organoids werden gegenereerd en mechanisch verstoord voor elektrofysiologische opnames4. Culturen met behulp van deze methoden zijn geschikt voor serotonine loslaat van experimenten, RT-qPCR analyse en, terwijl ze kunnen worden gebruikt voor electrofysiologie, zijn afhankelijk van het succes van tijdrovende organoid generatie, dichtheid verlopen EG cellen, worden geïdentificeerd en de cellulaire vernietigende effecten van trypsine en EDTA. Daarentegen het protocol hier beschreven verbetert enzymatische en mechanische behandelingen, optimaliseert kweken voorwaarden en procedures voor de productie van één gezonde EG cellen en geschikt voor de hoge cellulaire normen die nodig zijn voor de elektrofysiologie stroomlijnt.

Deze methode zal worden nuttig voor wetenschappers die willen werken aan primaire cellen van de EG in gemengde culturen in plaats van vereeuwigd culturen en willen onderzoeken de elektrofysiologie van afzonderlijke cellen. Echter kan het blijken minder geschikt voor de studie van cel populaties moeten sorteren of op lange termijn culturen waarvoor survival afgelopen 72 h.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Mayo Clinic. De primaire cel cultuur gedeelte van dit protocol is gebaseerd op eerder gepubliceerde methoden waarnaar kunnen worden verwezen voor verder details10. Alle experimentele procedures moeten worden goedgekeurd door de (IACUC), en alle experimenten moeten worden uitgevoerd volgens de relevante richtlijnen en verordeningen.

1. cultuur voorbereiding

  1. Media.
    1. EG cel volledige voedingsbodems bereiden met hoge glucose [4500mg/L] Dulbecco's bewerkt Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 5% foetale runderserum (FBS), 1 L-Glutamine en 1% penicilline-streptomycine (tabel 1).
      Opmerking: Media kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor maximaal een maand.
    2. Filteren van de EG cel volledige cultuurmedia en breng 25 mL van de media in een tube van 50 mL bij 37 ° C.
    3. Bereiden van spijsvertering media met hoge glucose [4.500 mg/L] DMEM aangevuld met 0,1% boviene serumalbumine (BSA) (tabel 1).
    4. De spijsvertering filtermedia en vier 10 mL aliquots van media in aparte 50 mL buizen en broeden in een waterbad 37 ° C.
      Opmerking: Media kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor maximaal een maand.
  2. Enzym.
    1. Weeg 4 mg (jejunum) of 24 mg (dubbele punt) van Collagenase XI [≥800 eenheden/mg] in een tube van 1,5 mL microcentrifuge.
      Opmerking: Collagenase is stabiel bij-20 ° C gedurende maximaal één jaar.
    2. Resuspendeer de aliquote in 1 mL ijs koud PBS met Ca2 + en Mg2 +collagenase. Vortex de oplossing grondig combineren, en plaatsen op het ijs.
  3. Coating cultuur platen.
    1. Ontdooi 150 µL van extracellulaire matrix's nachts op 4 ˚C op ijs.
    2. Maak een oplossing van 5% w/v extracellulaire matrix door het mengen van 100 µL van ontdooide extracellulaire matrix met 2 mL ijskoud serumvrij high-glucose DMEM.
      Opmerking: Extracellulaire matrix stolt bij kamertemperatuur en totdat u aan vacht gerechten met vooraf gekoeld pipetten, buizen en media moet worden behandeld.
    3. Onmiddellijk jas de binnenste cirkel van de glazen van glas-onder 35 mm gerechten met 250 µL van de extracellulaire matrix-oplossing van 5%. Dit recept zal betrekking hebben op maximaal 8 gerechten.
    4. Plaats de glazen-bodem gerechten in een incubator 37 ° C gedurende de resterende cel cultuur isolatie stappen. De extracellulaire matrix neemt minimaal 1 h om in te stellen maar kan worden ge¨ uncubeerd maximaal 2,5 h terwijl andere isolatie stappen uit te voeren.
      Opmerking: Incubations langer dan 3 h kunt maken met een opbouw van extracellulaire matrix waardoor kan worden belemmerd zegel formatie tijdens de hele cel electrofysiologie.

2. de weefsels isolatie

  1. Volgens ethische richtlijnen, offeren een 3om 6 week-oude mannelijke of vrouwelijke Tph1-GVB transgene muis (The Jackson laboratorium voorraad: 028366)9 of een andere verslaggever stam.
    Opmerking: We gebruiken een fatale dosis van stijgende niveaus van kooldioxide en een cervicale dislocatie als een secundaire middel om dood. Het AVAM-Comité op euthanasie ook acht cervicale dislocatie een toegestane primaire euthanasie door personen die zijn opgeleid in het gebruik ervan als de dieren zijn eerst verdoofd.
  2. PIN de euthanized muis die op een piepschuim dissectie podium met 21 G naalden. Ontsmetten van de buik van de muis met 70% ethanol.
  3. Trek muis huid strak met behulp van micro-dissectie pincet (#5), en gebruik vervolgens scherpe chirurgische schaar te maken van een dwarse snede aan de onderkant van de buik van de muis om de intraperitoneaal holte bloot te stellen. Maak een andere snede verticaal omhoog de buik tot de ribbenkast is blootgesteld.
  4. Gebruik de micro-dissectie verlostang om de blindedarm naar links van de muis om een duidelijk beeld van de dikke darm bereiken.
  5. Gebruik de micro-dissectie schaar te knippen de meest distale deel van de dikke darm (maar nog steeds proximale tot en met het rectum) en een tweede distale gesneden aan de maag. Plaats de uitgepakte darmen in een 100 x 15 mm2 petrischaal gevuld met 20 mL ijskoud fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
  6. Een kleine liniaal gebruiken om te meten en uitknippen van 10 cm van beide mid colon of jejunum. Uittreksel dikke darm door het meten van uit het 10 cm-segment van darm proximally gelegen aan de eerste snede boven het rectum genomen. Het jejunum identificeren door de hele dunne darm doormidden vouwen en maken een eerste snede op het halverwege punt en een tweede snede 10 cm proximaal naar de eerste gesneden.
    Opmerking: Blijven alle latere isolatie stappen op het ijs.
  7. Vul een 6 mL injectiespuit met ijs koud PBS en plaats de naald van de spuit in het lumen van het uitgepakte intestinale segment. Gebruik van de verlostang micro-dissectie klem te verzegelen van de darmen om de naald van de spuit, en voorzichtig spoelen 10 mL PBS via de lumen te spoelen weg fecale materie.
  8. Het omkeren van de intestinale weefsel door zachtjes weven van de verlostang micro-dissectie via het lumen, een darmwand knijpen en intrekken van het weefsel proximale naar het uiteinde van de verlostang. Herhaal dit proces totdat het segment binnenstebuiten is met het lumen naar buiten geconfronteerd.
  9. Gebruik micro-dissectie schaar te snijden het weefsel segment in stukjes van 1 cm.
  10. Micro-dissectie pincet gebruiken om de segmenten van het weefsel in een 50 mL-bekerglas gevuld met 5 mL steriele PBS. Gebruik de micro-dissectie schaar om gehakt van de stukjes weefsel tot een vloeibaar consistentie.
  11. Plaats de gehakt weefsel en 15 mL ijs koud PBS in een schone 50 mL-buis door overdracht pipet. Triturate 2 keer met de pipet overdracht, wachten op het weefsel te vestigen, 15 mL van het supernatans dat PBS verwijderen en vervangen door verse PBS. Herhaal dit proces drie keer totdat de PBS duidelijk is.
  12. Plaats de tube 50 mL met gewassen weefsel stukken op het ijs en de ijsemmer brengen een weefselkweek kap.

3. enzymatische en mechanische spijsvertering

  1. Eerste spijsvertering
    1. Ophalen uit het waterbad, een van de 50 mL tubes met 10 mL voorverwarmde spijsvertering media. Om de tube van 50 mL, voeg 250 µL van de PBS collagenase oplossing en gehakt intestinale weefsel stukken.
      Nota: zorg om te voorkomen dat met inbegrip van eventuele PBS van vorige wassen stappen.
    2. Plaats de tube van 50 mL in een waterbad gedurende 5 minuten (colon of jejunum) bij 37 ° C. Schud de buis 2 x per min.
      Opmerking: De optimale timing en intensiteit van mechanische spijsvertering kunnen variëren en zal moeten worden bepaald door de gebruiker. De optimale spijsvertering om voorwaarden te bepalen, kan een hoeveelheid van 10 µL van cellen na elke spijsvertering worden weergegeven. Tijdens 1 van de spijsvertering, moet het supernatant bestaan uit de bosjes van cellen.
    3. Langzaam triturate het weefsel één keer met een serologische pipet 10 mL. Kort laat het weefsel stukken regelen, gebruik dan een pipet overdracht te verwijderen van de gehele 10 mL van het supernatans.
  2. Tweede spijsvertering: Herhaal stap 3.1.1 aan 3.1.3. Verhogen van de incubatietijd aan 10 min als dikke darm verteren en houd de incubatietijd bij 5 min. voor het jejunum.
    Opmerking: Op een observatie, het supernatant moet nog steeds bestaan uit grote bosjes van cellen.
  3. Derde spijsvertering
    1. Herhaal stap 3.1.1
    2. Plaats de buis 50 mL in een waterbad 37 ˚C voor 10 min (colon of kleine jejunum). Schud de buis 2-3 x per min bij een hogere intensiteit dan spijsvertering van 1 en 2.
    3. Pipetteer langzaam op en neer het weefsel met een serologische pipet 10 mL. Laat de stukjes weefsel te regelen voor een korte tijd.
      Opmerking: Het supernatant moet bestaan uit een combinatie van afzonderlijke cellen en kleine bosjes.
    4. Gebruik een pipet overdracht Breng 10 mL van het supernatans dat in een nieuwe tube van 15 mL, voeg toe 2 mL verwarmde EG cel volledige cultuurmedia en eenmaal omkeren als u wilt mengen.
    5. Draaien op 100 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, gebruik dan een overdracht pipet om de bovendrijvende vloeistof verwijderen. Gebruik een pipet overdracht om resuspendeer de resterende pellet in 2.5 mL verwarmde EG cel volledige voedingsbodems.
  4. Vierde spijsvertering: Herhaal stap 3.3.1 aan 3.3.5. Verhogen van de incubatietijd tot 15 min voor dikke darm en blijven op 10 min. voor het jejunum.
    Opmerking: Het supernatant moet nu bestaan uit afzonderlijke cellen.

4. de celkweek

  1. Gebruik een pipet overdracht te combineren van de schorsingen van de cel van spijsvertering van 3 en 4 samengebracht in een nieuwe tube van 15 mL (5 mL totale volume).
  2. Verwijderen van een hoeveelheid van 10 µL van cellen tellen met een hemocytometer en draai de resterende celsuspensie bij 100 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    Opmerking: De uiteindelijke celsuspensie zal bestaan uit kleine bosjes en afzonderlijke cellen.
  3. Verwijder de bovendrijvende vloeistof met een pipet overdracht en resuspendeer de pellet in EG cel volledige voedingsbodems bij een dichtheid van 1.000.000 cellen per mL.
    Let op: Het eindvolume van celsuspensie zal afhangen van de laatste cel tellen. Typische cel telt variëren van 2.000.000 tot 4.000.000.
  4. Verwijder gecoate glazen-bodem cultuur gerechten uit de incubator. Gebruik een pipet P1000 ter vervanging van de extracellulaire matrix van elke cultuur schotel met 250 µL van de definitieve celsuspensie.
    Opmerking: Extracellulaire matrix coating neiging vast te houden aan de randen van de glazen-bodem schotel. Speciale zorg moet men zich verwijdert van de coating uit langs de rand om te voorkomen dat de opbouw van de gel.
  5. Het maken van een stamoplossing van ROCK-remmer Y-27632 op 1 mM. 2.5 µL van stockoplossing aan elk gerecht onder glas tot een concentratie van de werken van 10 µM ROCK-remmer in elk gerecht toevoegen.
    Opmerking: Deze stap is van cruciaal belang voor het voortbestaan van jejunum culturen maar is optioneel voor dikke darm.
  6. Zet de schotel van elke cultuur in een 37 ° C en 5% CO2 incubator voor 24 tot en met 72 h (Figuur 1).

5. bereiding van de cellen van de EG gehele cel electrofysiologie

  1. Lijn de binnendiameter van de Microscoop fase met twee 5 x 0,5 cm stroken van wax film maken van een O-ring. Monteer de schotel cultuur 35-mm cel binnen de O-ring (Figuur 2A-B).
  2. Spoel zowel zwevend puin, zoals niet-vastgemaakte extracellulaire matrix of dode cellen en cultuurmedia serum volledig uit de buurt van EG cellen om te voorkomen hetzij uit belemmeren zegel vorming tussen de cel van de EG en de elektrode. Gebruik van de drie volgende opties om grondige cel wassen voldoende voor electrofysiologie:
    1. Optie 1: Uitwisseling van de oplossing is efficiënter in een lange kamer meer nog dan een circulaire kamer. Aangezien de EG-cellen werden gekweekt in ronde 35 mm gerechten, maken een kunststof elliptische invoegen voor de schotel.
      1. De toevoeging maken door 3D printen of frezen van de traditionele methoden. De insert we gebruikten werd gemalen van acryl kunststof met de volgende afmetingen (in mm): buitendiameter, 34,5; innerlijke ellips, 20 x 9; Hoogte uitwendig, 10; binnenste hoogte, 1.5; brug span, 3 x 3; brug van mijnen, 1.5; inlaat en uitlaat, 4 x 4.
      2. Verlaag het invoegen in de cultuur-schotel (Figuur 2A-B) en veilig naar de top van het podium van de microscoop met twee 0.15 tot 0,2 g stukken van het modelleren van klei gedrukt in 1.2 x 0.3 x 0,1 cm rechthoeken (Figuur 2A-C).
      3. Met een kunststof transfer pipette, Voeg langzaam extracellulaire oplossing aan de ene kant van de schotel (inlaat) terwijl het zuigen van de andere kant (stopcontact).
    2. Optie 2: Zonder een gemanipuleerde plastic invoegen, voeg extracellulaire oplossing overdracht Pipetteer van de ene kant van de schotel (inlaat) terwijl het zuigen van de overkant (stopcontact). Langzaam draaien de locatie van de Pipet van overdracht (bijvoorbeeld N tot en met E tot S) terwijl de spiegeling van de plaatsing van de naald aspiratie aan de overkant (bijvoorbeeld S naar W tot N).
    3. Optie 3: Jas extracellulaire matrix op rechthoekige coverslips in stap 1.3.3., en cultuur van de celsuspensie op deze coverslips in stap 4.4. Deze dekglaasje aan overbrengen in een rechthoekige kamer gevuld met extracellulaire oplossing, weglaten stap 5.1 en 5.3 stap overslaan. Spoel de kamer met de extracellulaire oplossing van een kunststof transfer pipette, zoals beschreven in optie 1 (5.2.1.3).
  3. Opnieuw aansluit het podium met de cultuur van de cel boven de omgekeerde Microscoop (Figuur 2D). Incubeer de EG celcultuur in serumvrij extracellulaire oplossing bij kamertemperatuur.
  4. Na 4 uur, spoel de cultuur weer met extracellulaire oplossing zoals hierboven beschreven. Ga verder met de hele cel electrofysiologie.

6. de hele cel electrofysiologie EG cellen van primaire cultuur

  1. Bereiken van een hele cel Giga-zegel
    1. Trek een dozijn elektroden naar een weerstand van 1-5 MΩ.
      OPMERKINGEN: Pipetten van 1 – 2 MΩ verzet dat de opbrengst van 10-100 GΩ zeehonden beste presteren. Fire polijsten van de elektrode tips is niet nodig om GΩ zeehonden.
    2. Jas gelijkmatig de neus kegel van alle pipetten met polymeer. Houd de pipet horizontaal op de grond en loodrecht op de voorzijde van een warmte-pistool. Langzaam draaien de pipet totdat het polymeer verhardt.
    3. Giet een aliquoot gedeelte van het intracellulaire oplossing in een conische buis 15 mL. Pipetteer 1.2 mL van deze oplossing in een tube van 1,5 mL microcentrifuge via 1 mL spuit. Trekken een ander 0,7 mL van intracellulaire oplossing in de spuit. Wegnemen van lucht uit het einde van de spuit. Hechten van een flexibele 34 G, 67 mm naald op de spuit, en spoelen van eventuele resterende lucht door deze naald.
    4. Identificeren van een Tph1-GVB + cell thats niet in contact met een andere cel of puin.
    5. Vul de elektrode-tip met intracellulaire oplossing. Aanvulling van de funderingsput de pipet door spuit. Zorgvuldig flick de pipet met een vingernagel om te verjagen de zeepbel air-interface.
    6. Met de plunjer opgesteld met 0.3 mL lucht, een 6 mL spuit aan de uitlaat van de houder van de buizen te koppelen. Monteer de elektrode in de houder.
      Opmerking: Sluit de spuit om de buis voordat de elektrode de bad-oplossing treedt te handhaven van neutrale of positieve druk binnen de intracellulaire oplossing vóór de afdichting.
    7. Laad een tweestaps spanning-clamp-protocol die records steady-state activerend stromingen door een ladder van de spanning op de eerste stap en registreert de beschikbare stromingen door een interne spanning op de tweede stap. Open de zegel-test (5 mV bij 50 kHz).
    8. Lager de elektrode in de oplossing van het bad. Manoeuvreren met de micromanipulators, de elektrode tip in-plane met en direct horizontale uit de cel. Verdrijven de 0.3 mL van lucht van de spuit.
    9. Zachtjes gaan de elektrode horizontaal langs de x-as aan te raken van de cel. Kijk voor een kuiltje te verschijnen op de EG-cel en/of een toename in membraan weerstand op de zegel-test. Zo nodig passen de elektrode naar beneden langs de z-as en/of horizontaal langs de x-as, beweegt niet voorbij de middellijn van de cel.
    10. Toepassen van 0,1-0,2 mL zuig op de 6-mL spuit. Houd de plunjer gestage totdat 100 MΩ is bereikt, dan greep uit de plunjer vrijgeven. Wacht totdat de cel giga-zegel. Koppel de spuit met een inbus beweging voorzichtig los.
      Opmerking: Als een EG-cel in eerste instantie niet verzegelen doet, het mogelijk te verzegelen het opnieuw met een volgende poging. Om dit te doen, Trek voorzichtig aan de elektrode uit de buurt van een EG-cel met < 20 MΩ zegel weerstand. Besturing van de verbruikte elektrode met de micromanipulators, rond de gerichte EG cel handmatig duidelijke weg matrix of puin. Dan, proberen te verzegelen van de cel van de EG met een verse elektrode.
  2. Record hele cel spanning-gated nb+ huidige.
    1. Hechten van een 3 mL spuit opgesteld met 0,5-1,0 mL lucht. Een snelle Tik van zuiging van toepassing (0,1-0,5 mL) op een 3 mL spuit. Herhaal totdat de hele cel toegang wordt bereikt, dan voorzichtig het verbreken van de spuit.
      Opmerking: als de prestaties van een spuit kan aanvankelijk variëren en geleidelijk met de tijd en gebruik, praktijk vooraf met de 3 mL spuit (verzegeling het einde met een wijsvinger veranderen) om ervoor te zorgen dat de plunjer zal terugslag binnen 0,1-0,2 mL van de langetermijnproblemen plaats. Als dat niet het geval is, dan wisselen de spuit voor een nieuwe.
    2. Schadeloosstelling van de capaciteit van de hele cel inschakelen. Aanpassen precisiecapaciteit en serie weerstand. Serie weerstand compensatie inschakelen. Aanpassen met vertraging ingesteld op 60 ms, voorspelde dan gecorrigeerde serie weerstand compensatie. Sluit de test zegel.
    3. Het opnemen van een gemiddelde van 5 punten van geheel-cel spanning-gated nb+ huidige (Figuur 3A).
    4. Snel neem nota van twee parameters van spanning-gated nb+ huidige: de spanning aan venster huidige (Figuur 3B, rode symbolen, het snijpunt van activering en inactivering curven van de stationaire toestand) en de huidige piek nb+ dichtheid.
      Opmerking: De cellen van de EG met piek nb+ stromen meer dan-50 pA in spanning klem modus vaak gaat op aan het vuur ontlokte potentieel in huidige modus van de klem. Bovendien stromingen groter dan-200 pA in spanning klem (Figuur 3A) dan meestal brand actie potentieel spontaan in huidige klem van membraan potentieel (rode lijn, Figuur 3D) in de buurt van de spanning van de venster huidige (rode symbolen, Figuur 3B).
  3. Record ontlokte actie potentieel.
    1. De serie weerstand compensatie uitschakelen. Uitschakelen van de externe opdracht. Overschakelen van de modus van V-clamp-clamp. Aanpassen van de winst. Het laden van een episodische huidige klem-protocol. Pas de hoeveelheid bedrijf huidige op 0 pA. Schakel de externe opdracht.
      Let op: Schakel niet van V-clamp-clamp (of omgekeerd) eerste zonder uit te schakelen de externe opdracht.
    2. Opmerking de rustpotentiaal membraan. Het huidige bedrijf input zodat de membraanpotentiaal onder het huidige venster leest aanpassen (bijvoorbeeld -80 te-100 mV). De episodische huidige klem protocol zodanig aanpassen dat het interval van de stap van huidige input is kleiner dan de waarde van het huidige bedrijf (Figuur 3C inzet, + 2 pA stappen voor-3 pA bedrijf huidige).
    3. Record ontlokte actie potentieel. Opmerking de minste hoeveelheid stroom geïnjecteerd om het vuur af een actiepotentiaal (Figuur 3C, vegen 3 van 5, een + 4 pA stap van-3 pA bedrijf = + 1 pA).
  4. Record spontane actie potentieel.
    1. Uitschakelen van de externe opdracht. Een gap-vrije (niet-episodische) huidige klem-protocol laden.
      Opmerking: Zet niet de externe opdracht terug op totdat het bedrag van het huidige bedrijf in de huidige kloof-vrije klem-protocol is geverifieerd dat ze geschikt zijn voor de cel.
    2. Wijzigen van de huidige als de hoeveelheid stroom die geïnjecteerd in de laatste vegen in het elicited protocol dat deed een actiepotentiaal niet brand bedrijf (Figuur 3D, de huidige ingang tijdens de tweede sweep, een + 2 pA stap van-3 pA bedrijf =-1 pA).
    3. Schakel de externe opdracht. Controleer dat het huidige voorspelde bedrijf brengt de membraanpotentiaal de drempel tot de brand van een actiepotentiaal. Het huidige bedrijf aanpassen indien nodig. Record spontane activiteit.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Culturen:
Primaire lymfkliertest epitheliale cellen gemaakt van een transgene Tph1-GVB model hechten aan gerechten na 4 uur en zijn klaar voor fysiologische experimenten tussen 24 tot en met 72 h. Toen kweekomstandigheden had niet geoptimaliseerd, bestond de epitheliale celcultuur uit grote bosjes, drijvende cellulaire puin, beschadigde membranen en zwak signaal van het GVB in de cellen van de EG(Figuur 1). Culturen die zi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Volledig inzicht in functie van de cel EG vereist een kwalitatief hoogwaardige primaire cultuur-methode voor het genereren van cellen voor hele cel electrofysiologie. Primaire culturen van GI epitheel had van oudsher moeilijk als gevolg van lage overleven. Deze storende factor te verlichten, levert de huidige methode culturen van enkelvoud EG cellen uit kleine of grote darm die kunnen overleven voor meerdere dagen.

Wij vonden dat essentieel is voor de verbetering van de kwaliteit van culturen ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Dankbetuigingen

De auteurs bedanken Mrs. Lyndsay Busby voor administratieve bijstand en Mr. Robert Highet van Mayo Clinic Division of Engineering voor ontwerp en 3D-printen van de cultuur schotel invoegen. Dit werk werd gesteund door de NIH K08 AB (DK106456), piloot en haalbaarheid subsidie aan AB van Mayo Clinic Center voor cel signalering in de gastro-enterologie (NIH P30DK084567) en 2015 Amerikaanse Gastoenterologische vereniging Research Scholar Award (AGA RSA) AB en NIH R01 aan GF (DK52766).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
100 mm x 15 mm kweekschaaltjeCorning (Falcon)351029
TransferpipetFisherbrand13-711-7M
10 mL serologische pipetCorning (Falcon) 357551
50 mL ConicalCorning (Falcon) 352098
15 mL ConicalCorning (Falcon) 352097
1.000 mL Barrier Pipet TipsThermo Scientific (Art)2079ESteril bewaren
MatTek Glass Bottom DishesMatTek CorporationP35G-1.5-14-CSteril bewaren
Micro-dissectie pincet - Zeer fijn, extra lange puntenFine Science ToolsSB12630M
Chirurgische schaar - scherpNasco14002-14
Micro-dissectieschaarNascoSB46568M
Monoject Hypo-naald, 21 G x 1" A, 100/BXCovidien8881250172
 Tg(Tph1-CFP)1Able/J MuizenJacksonStock # 028366Gebruik mannelijke of vrouwelijke muizen tussen de leeftijden van 4-7 weken
Microfil niet-metalen spuitnaalden (34 gauge, 67 mm)World Precision InstrumentsMF34G-5
Parafilm "M" LaboratoriumfoliePechiney Plastic Packaging
R6101Dow Corning
6 mL spuit met normale luer tipMonoject
3 mL spuit met normale luer tipMonoject
Elektrofysiologisch apparatuur
VersterkerMolecular DevicesAxopatch 200B
Data-acquisitiesysteem (daq)Molecular DevicesDigidata 1440A
Signaal conditionerMolecular DevicesCyberAmp 320
SoftwareMolecular DevicespClamp 10.6

Referenties

  1. Rindi, G., Leiter, A. B., Kopin, A. S., Bordi, C., Solcia, E. The "normal" endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences. Annals of the New York Academy of Sciences. 1014, 1-12 (2004).
  2. Rogers, G. J., et al. Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells. The Journal of Physiology. 589, Pt 5 1081-1093 (2011).
  3. Strege, P. R., et al. Sodium channel NaV1.3 is important for enterochromaffin cell excitability and serotonin release. Scientific Reports. 7 (15650), (2017).
  4. Bellono, N. W., et al. Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways. Cell. 170 (1), 185-198 (2017).
  5. Alcaino, C., Knutson, K., Gottlieb, P. A., Farrugia, G., Beyder, A. Mechanosensitive ion channel Piezo2 is inhibited by D-GsMTx4. Channels. 11 (3), 245-253 (2017).
  6. Kim, M., Javed, N. H., Yu, J. G., Christofi, F., Cooke, H. J. Mechanical stimulation activates Galphaq signaling pathways and 5-hydroxytryptamine release from human carcinoid BON cells. Journal of Clinical Investigation. 108 (7), 1051-1059 (2001).
  7. Modlin, I. M., Kidd, M., Pfragner, R., Eick, G. N., Champaneria, M. C. The functional characterization of normal and neoplastic human enterochromaffin cells. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 91 (6), 2340-2348 (2006).
  8. Wang, F., et al. Mechanosensitive ion channel Piezo2 is important for enterochromaffin cell response to mechanical forces. The Journal of Physiology. 595 (1), 79-91 (2017).
  9. Li, H. J., et al. Distinct cellular origins for serotonin-expressing and enterochromaffin-like cells in the gastric corpus. Gastroenterology. 146 (3), 754-764 (2014).
  10. Psichas, A., Tolhurst, G., Brighton, C. A., Gribble, F. M., Reimann, F. Mixed primary cultures of murine small intestine intended for the study of gut hormone secretion and live cell imaging of enteroendocrine cells. Journal of Visualized Experiments. (122), 55687(2017).
  11. Raghupathi, R., et al. Identification of unique release kinetics of serotonin from guinea-pig and human enterochromaffin cells. The Journal of Physiology. 591, Pt 23 5959-5975 (2013).
  12. Nozawa, K., et al. TRPA1 regulates gastrointestinal motility through serotonin release from enterochromaffin cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3408-3413 (2009).
  13. Reimann, F., et al. Characterization and functional role of voltage gated cation conductances in the glucagon-like peptide-1 secreting GLUTag cell line. The Journal of Physiology. 563, Pt 1 161-175 (2005).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Primaire celcultuurCFP-reportermuizenvoltage clampcurrent clampweefseldigestiecelisolatieregistratie van natriumstroomdetectie van actiepotentialen
Hele cel electrofysiologie van primaire gekweekte lymfkliertest Enterochromaffin cellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.