Kalibratie-gratis In Vitro kwantificering van eiwit Homo-oligomerisatie met behulp van commerciële instrumentatie en Software van de analyse van de helderheid van gratis, Open Source

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een kalibratie-vrije aanpak voor het kwantificeren van eiwit homo-oligomerisatie in vitro op basis van fluctuatiemarges Fluorescentiespectroscopie met behulp van commerciële licht scanning microscopie. De juiste overname-instellingen en de analysemethoden worden weergegeven.

Samenvatting

Aantal en helderheid is een kalibratie-vrije fluorescentie schommelingen spectroscopie (FFS) techniek voor het opsporen van eiwit homo-oligomerisatie. Het kan worden gebruikt met behulp van een conventionele confocal microscoop uitgerust met digitale detectoren. Een protocol voor het gebruik van de techniek in vitro wordt weergegeven door middel van een use-case waar nummer en helderheid te nauwkeurig het kwantificeren van de oligomere Braziliaanse deelstaat mVenus-gelabelde FKBP12F36V voor en na de toevoeging van de dimerizing drug AP20187 kunnen worden gezien. Het belang van het gebruik van de juiste Microscoop verwerving parameters en de juiste gegevens voorbewerken en analysemethoden worden besproken. In het bijzonder wordt het belang van de keuze van photobleaching correctie benadrukt. Deze goedkope methode kan worden gebruikt om te studeren van eiwit-eiwitinteractie in veel biologische contexten.

Inleiding

Eiwit-eiwit interacties Ik n Vitro

Traditioneel, zijn kristallografie en nucleaire magnetische resonantie experimenten in combinatie met cryo-elektronenmicroscopie (cryoEM) de technologieën gekozen om te nauwkeurig beschrijven de driedimensionale structuur van eiwitten en hun functie door afleiden onderzoekend hun structurele details in hoge resolutie. Eiwitten, echter zijn niet statisch structuren en een scala aan conformationele wijzigingen en trillingen kunnen ondergaan in tijd en ruimte. Daarom is het structurele informatie uit kristallografische of CryoEM gegevens moet worden aangevuld met andere technieken (bijvoorbeeld moleculaire dynamica simulaties en enkel molecuul technieken): de functie van een eiwit is gerelateerd aan de conformationele wijzigingen en interacties, en deze informatie is niet aanwezig in een statische-structuurdiagram. Om de sonde voor intra moleculaire dynamica, zijn technieken op basis van één molecuul Forster Resonance Energy Transfer (smFRET) zeer effectief¹. Deze benaderingen zijn in staat om te beoordelen van verschillende subpopulaties van moleculen in complexe media. Dit is zeer belangrijk, aangezien deze veranderingen snelle zijn en tijdens de overname van de gegevens (dat wil zeggen, een nanoseconde naar tweede bereik optreden).

Twee van de belangrijkste benaderingen vaak werkzaam zijn voor het detecteren en kwantificeren van deze wijzigingen: eiwitten in oplossing en oppervlakte-immobilisatie. Voor de detectie van Inter moleculaire interacties en in het bijzonder, het proces van dimerisatie geïnduceerd door liganden, is smFRET niet altijd het beste instrument. Inderdaad, FRET niet alleen hangt af van de afstand (≈10 nm) maar ook op de oriëntatie van de twee dipolen (donor en acceptor, χ²) en de overlapping van de emissie van de donor met van de acceptor absorptiespectra², maar misschien deze laatste voorwaarde is minder mits het Vejle kunt koos belangrijk de juiste FRET paar. Een bijzonder nadeel van smFRET voor het sonderen van homo-dimerisatie komt uit de etikettering van de proteïne van belang: voor hetero smFRET, dimerisatie kan alleen worden gedetecteerd tot 50% (dat wil zeggen, hetero-FRET zullen uitsluitend kundig voor speurder donor-acceptor en acceptor-donor homo-Dimeren maar niet donor-donor of acceptor-acceptor, die de overige 50% van de Dimeren). Het gebruik van fluorescentie correlatie spectroscopie (FCS) en derivaten (FCCS, etc.³) vast te stellen eiwit diffusie constanten en bindende constanten in vitro is een ander alternatief. Deze benaderingen zijn niet kundig voor homo-dimerisatie ofwel volledig te kwantificeren, zoals FCS één maatregelen concentratie en verspreiding, en de straal en diffusie coëfficiënt van een diffusing deeltje zijn zeer slecht afhankelijk van het molecuulgewicht; bijvoorbeeld zal een 10-fold verhoging van het molecuulgewicht alleen impliceren een verandering 2.15 vouwen in de diffusie coëfficiënt⁴. In het geval van twee kleuren FCS of FCCS, zal slechts 50% van de homo-Dimeren blijken om dezelfde reden als hierboven. De meest praktische en kwantitatieve benaderingen voor het detecteren van homo-dimerisatie in vitro en in vivo zijn homo-FRET⁵ en nummer en helderheid (N & B)⁶. Gezien het feit dat homo-FRET vereist specifieke instrumentatie herstel van de anisotropie waarde (bijvoorbeeld optische elementen/analysers om te herstellen van de parallelle en loodrechte polarisatie), N & B wordt gepresenteerd als een gunstige techniek om hier het detecteren van eiwitten homo-dimerisatie en aggregatie. Het kan worden gebruikt zowel in vitro als in vivo met een commerciële set-up.

Aantal en helderheid

N & B is onlangs herziene⁷. Die herziening gericht op de toepassing van de techniek in levende cellen. Het is de moeite waard om te reproduceren het wiskundig formalisme hier als deze vergelijkingen worden toegepast op de gegevens verzameld in vitro. Eerste plaats is het noodzakelijk om enkele voorwaarden en wiskundige hoeveelheden te definiëren:

• Een entiteit is een verzameling van moleculen die met elkaar zijn verbonden.
• De helderheid ε van een entiteit is het aantal fotonen die het stoot per tijdseenheid (per frame).
• n is het aantal entiteiten aanwezig.
• Voor een bepaalde pixel in de loop van een beeld-serie is < i > dat zijn gemiddelde intensiteit en σ² is de afwijking in de intensiteit.

Vervolgens met het foton tellen detectoren en uitgaande mobiele entiteiten en geen achtergrond,

waarbij N staat voor het schijnbare aantal en B is de schijnbare helderheid. Dit resulteert in

Dalal et al. ⁸ bleek dat met analoge apparatuur, drie correctietermen moet: de S-factor, de verschuivingvan de achtergrond en de uitlezing lawaai σ₀-². Vervolgens, wederom ervan uitgaande dat mobiele entiteiten,

geven

Merk op dat de bovenstaande vergelijking voor verschillende dat gegeven in Dalal et al. ⁸ en een latere toetsing. ⁷ in Dalal et al. de S in de noemer als gevolg van een typfout werd weggelaten en deze fout werd gereproduceerd in de review. De bovenstaande vergelijking is de juiste is. Instructies voor het meten van S, offset en σ₀² - samen met een verklaring van hun betekenis - worden gegeven door Dalal et al. ⁸

De helderheid ε is evenredig aan de oligomere staat voor de diffusing entiteiten: ε zullen twee keer zo groot voor Dimeren als voor monomeren, driemaal zo groot voor trimeren als voor monomeren, tweemaal zo groot voor hexamers als voor trimeren, enzovoort. Op deze manier, meten de helderheid ε, kan een het kwantificeren van elk type multimerization.

Als er een mengsel van oligomere Staten aanwezig, nummer en helderheid is niet geschikt voor het herstellen van de individuele oligomere Staten aanwezig. Dit is een beperking van de techniek.

Detrend-algoritme en nandb software

Het belang van het corrigeren van photobleaching geweest eerder benadrukt⁹. Photobleaching onvermijdelijk optreedt tijdens de lichte microscopie van experimenten in time-lapse modus; zowel in levende cellen en in vitro. Vele benaderingen zijn beschreven in de literatuur om te corrigeren voor het bleken van⁷. De exponentiële filteringtechniek met automatische keuze van detrending parameter T is de huidige beste. Het is geïntegreerd in de gratis, open source software nandb⁹. Inderdaad, software die de gebruiker handmatig kiezen hun detrending parameter vereist kan leiden tot onjuiste resultaten omdat deze parameter keuze waarschijnlijk willekeurige en onjuist zullen. De automatische algoritme inspecteert de gegevens en de juiste parameter bepaalt, zonder de noodzaak voor gebruiker interventie⁹. Zelfs met de beste keuze van smoothing parameter, detrending heeft zijn beperkingen en werkt alleen goed met photobleaching percentages lager is dan 25%, zoals met simulaties⁹. Interessant is dat bij het gebruik van de automatische detrending routine, de juistheid ervan is zodanig dat men met lage helderheidswaarden werken kan (zelfs B < 1.01), en dus lage intensiteit, en nog steeds nauwkeurig genoeg om het kwantificeren van homo-dimerisatie.

Photobleaching veroorzaakt ook een ander probleem: de aanwezigheid van photobleached fluorophores in een complexe multimer. Dit maakt bijvoorbeeld een trimeer verschijnen als een dimeer wanneer één van de drie units in de trimeer is niet-belichting fluorescerende. Hur en Mueller¹⁰ toonde hoe te corrigeren voor dit en deze correctie werd ook benadrukt in een latere herziening⁷. De software van de nandb bevat deze correctie⁹.

De FKBP12 F36V systeem

FKBP12F36V is een proteïne die doet natuurlijk niet oligomerize, maar is bekend dat bij de toevoeging van de AP20187 drug (gemeenzaam bekend als de BB dimerizing ligand)^11,12dimerize. Dit maakt het een ideale testcase voor nummer en helderheid: met gelabelde FKBP12F36V, een verdubbeling van de oligomere staat moet worden nageleefd bij toevoeging van BB.

Protocol

1. FKBP12 F36V - mVenus zuivering

1. Tover het geluid (DE3) pLysS cellen met pET22b vector met monomerized menselijke FKBP12F36V¹² en N-terminal His6 en mVenus tags (vector beschikbaar op aanvraag). De cellen van de plaat op LB agar aangevuld met 50 µg/mL ampicilline en 34 µg/mL chlooramfenicol.
2. Pipetteer getransformeerde kolonies in 100 mL LB starter cultuur en groeien voor 16-20 uur bij 37 ° C met schudden.
3. Verdun dichte starter cultuur (OD600 > 1) 1:100 in LB medium (2 x 500 mL partijen) en groeien voor 2-3 uur tot OD600 = 0,6 - 0,8 (37 ° C, 200 rpm).
4. Cool culturen op het ijs. Met 250 µM IPTG veroorzaken en groeien voor 16-20 uur bij 21 ° C, 200 rpm.
5. Oogsten van cellen door centrifugeren op 2.000 x g gedurende 20 minuten.
6. Resuspendeer de pellet in 40 mL IMAC buffer (20 mM natriumfosfaat pH 7.5, 500 mM NaCl, imidazool 3 mM, 1 mM β-mercaptoethanol) aangevuld met EDTA-vrije proteaseinhibitors (1 tablet per cel pellet).
7. Bewerk ultrasone trillingen ten cellen (500 watt, 20 kHz, 40% amplitude, 9 s op, 11 s uit voor 15 min) op ijs en oogst oplosbaar materiaal door centrifugeren op 20.000 x g.
8. Overdracht oplosbare lysate over in een erlenmeyer en voeg 2 mL hars (Zie Tabel van materialen). Incubeer gedurende 1 uur met 105 rpm rotatie
   Opmerking: Nikkel sepharose kan ook worden gebruikt voor deze stap van de IMAC.
9. Oogsten van hars en wassen met 250 mL IMAC buffer A gevolgd door 500 mL IMAC buffer B (imidazol 7 mM, 20 mM natriumfosfaat pH 7.5, 500 mM NaCl, 1 mM β-mercaptoethanol).
   Opmerking: Oplopen tot 50 mM imidazool als nikkel sepharose hars gebruikt.
10. Elueer His6-gelabeld eiwit met IMAC buffer C (20 mM natriumfosfaat pH 7.5, 500 mM NaCl, imidazool 300 mM, 1 mM β-mercaptoethanol).
11. Injecteren op de uitsluiting van een grootte kolom (Zie Tabel van materialen) geëquilibreerd in 10 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT. FKBP12F36V heeft haar piek elutie bij 87.71 mL op de kolom die we gebruikten.
12. Beoordelen van zuiverheid via SDS-pagina en zwembad en concentreren zoals vereist.

2. voorbereiding van Multiwell plaat Array

1. Het gezuiverde FKBP12F36V ontdooien (of het label van de proteïne van belang) van-80 ° C.
2. Bereiden van een oplossing van 100 nM gezuiverd FKBP12F36V (middellange, 10 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT). Bewerk ultrasone trillingen ten samen en centrifugeer (snelle spin voor 13.000 rpm) om te voorkomen dat de vorming van aggregaten.
3. Pipetteer 100-200 µL in een kamer 8 goed observatie met een glazen bodem.
4. De BB-dimerizer aan de eindconcentraties van 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 en 500 nM^12,13toevoegen.
5. Als referentie, bereid een oplossing van 100 nM van mVenus alleen om te evalueren van potentiële effecten van de globalisatie en neerslag en een helderheidswaarde voor het monomeer met dezelfde overname-instellingen herstellen.

3. kalibratie-gratis Confocal overname

1. Beginnen met de confocal systeem (Figuur 1). Geen licht scanning microscoop confocal systeem voorzien van digitale detectoren of goed gekarakteriseerd analoge detectoren⁸, en staat houden een constante Nadruktijd voor elke pixel verworven zou werken.
2. Het pad van de lichtbundel van de excitatie instellen:
   1. Zet de 514 nm laser en reeks het op 20-100 nW macht bij de uitgang van de doelstelling (voor FKBP12F36V-mVenus).
   2. Selecteer het 63X1.4NA doel of een kraag correctie water onderdompeling doel ontworpen voor FCS.
   3. Zet één HyD, APD of gekalibreerde bet detector. Detectoren staat foton-tellen zijn te verkiezen boven, zoals in dit geval, berekening van S, offset en σ₀² zijn overbodig.
   4. Selecteer het venster van de emissie van 520-560 nm
   5. Het gaatje vastgesteldop 1 luchtige eenheid voor de overeenkomstige emissie ~ 545 nm.
   6. De overname-modus instellen op 16 x 16 pixels
   7. De pixel Nadruktijd tijd t_wonen zo ingesteld dat het voldoet aan t_frame >> T_D >> t_wonen, waar _D de verblijftijd van de diffusing eiwitten en t is _frame wordt de framerate. Dit kwam overeen met het instellen van de nadruktijd op ~ 13 µs.
      Opmerking: Sommige commerciële fabrikanten had scanners die niet constant te de nadruktijd per pixel houden waren. Deze standvastigheid is cruciaal voor de methode om te werken.
   8. De pixelgrootte vastgesteldop ~ 120 nm.
   9. De xyt acquisitie-modus selecteren en selecteer het aantal frames aan te schaffen per acquisitie en goed (bijvoorbeeld 5000).
   10. Als het systeem is uitgerust met high-throughput modus, nemen de coördinaten van elk putje en het aantal overnames per putje om het proces te automatiseren.
       Opmerking: Wees voorzichtig om de aanwezigheid van een water dispenser voor als een streven naar onderdompeling.
   11. Als het systeem is uitgerust met een systeem van perfusie, laden de BB-oplossing en program de perfusie om te beginnen rechts-na het 5000^th frame te evalueren van de kinetiek van dimerisatie terwijl bijvoorbeeld 10.000 afbeeldingen ophalen.
3. Voeg een druppel olie in de olie-immersie-doelstelling / water als met behulp van een kraag correctie water onderdompeling doel ontworpen voor FCS.
4. Monteer de zaal 8 goed observatie in het werkgebied.
5. Selecteer de juiste bron en zich richten op de oplossing.
   Opmerking: Belangrijk: voorkomen gericht dicht bij het onderste glas om reflectie en verstrooiing te voorkomen. Bij het scherpstellen dieper in de oplossing, ontkoppel de optie Automatische focus.
6. Start van de overname en de resulterende stapel afbeeldingen opslaan in TIFF-indeling.

4. detrend en helderheid analyse met behulp van de nandb R Package

1. Als een pre-processing kwaliteitscontrole, gebruikt u ImageJ¹⁴ Neem een kijkje op de beelden en het herstellen van het profiel van de intensiteit, zoals weergegeven in Figuur 2een. Dit is handig om te bepalen al dan niet teveel photobleaching opgetreden. Als er teveel bleken, zijn de gegevens niet geschikt voor verdere analyse.
   Opmerking: ImageJ kan ook bruikbaar om afbeeldingen te converteren naar TIFF van commerciële formaten. De software van de nandb hieronder beschreven kan alleen functioneren met TIFF-bestanden.
2. Download en installeer R en RStudio^15,16. Het is het beste om te downloaden en installeren van R eerst, dan RStudio.
   Opmerking: Wat volgt is een beschrijving van het gebruik van de nandb R-pakket. Kennis van de taal R is niet verplicht te gebruiken nandb, maar het zal het leven makkelijker maken.
3. Installeer het pakket nandb.
   1. Open RStudio en typ install.packages("nandb") in de console en wacht tot de installatie.
4. Maak kennis met nandb
   1. Bekijk de handmatige¹⁷.
   2. Bekijk de ingebouwde RStudio help voor verschillende functies. De meest waarschijnlijke functie worden gebruikt zal worden met behulp van brightness() zal worden. Het help-bestand voor deze functie weergeven door te typen? Brightness() bij de console.
5. Berekenen van de helderheid
   1. Men moet zeggen een image-bestand op het bureaublad genaamd img001.tif (merk op dat 'nandb' alleen met de TIFF-bestanden werkt). Men kan de helderheid van dat beeld berekenen:
      b <-helderheid ("~/Desktop/img001.tif", tau = "auto")
      1. Dit wordt de helderheid van de afbeelding toegewezen aan de variabele b in R. De tau = "auto" zorgt ervoor dat de afbeelding voorafgaand aan helderheid berekening correct is detrended. De meest voorkomende ding te doen vanaf hier is het berekenen van het gemiddelde of de mediaan helderheid van de afbeelding. Men kan dit doen door mean(b) of median(b) te typen. Men kan ook de helderheid afbeelding naar de desktop gebruiken schrijven
         ijtiff::write_tif (b, "~/Desktop/whatever_img_name")
   2. Zeggen een map vol afbeeldingen images_folder op het bureaublad heeft en men moet berekenen van de helderheden van deze beelden en de beelden van de helderheid als TIFF-bestanden schrijven. Dan zien? brightness_folder(). Deze functie verwerkt ineens een hele map:
      brightness_folder ("~/Desktop/images_folder", tau = "auto")
      Dit is met name goed voor degenen die hebben een software die zij te R verkiezen, omdat alle bestanden worden verwerkt in één enkele opdracht, en vervolgens een blijven met de output helderheid TIFF-afbeeldingen in hun gekozen software werken kunt, worden het ImageJ¹⁴ , Python of iets anders.

Resultaten

Detrending en monomeer helderheid

Zodra de gegevens heeft verkregen, kan men beginnen de helderheid berekeningen om te bepalen van de oligomere staat voor de proteïne van belang in de oplossing. Zelfs als het effect van bleken in oplossing mogelijk niet zo drastisch kan als het in vivo, de intensiteit trace zal waarschijnlijk niet nog stationaire bedoel, mogelijk als gevolg van fotofysische effecten aan...

Discussie

N & B is een techniek voor het detecteren van multimerization met behulp van commerciële licht scannen confocal microscopen uitgerust met digitale detectoren. Deze aanpak is heel aantrekkelijk in vergelijking met aanspreekpunt FCS, FCCS en smFRET omdat het gratis kalibratie en de berekening van de helderheid is eenvoudig en concentratie onafhankelijke⁶. Het is van groot belang, echter om te corrigeren voor bleken en lange termijn intensiteit schommelingen voordat u helderheid berekeningen

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
RosettaTM (DE3) pLysS cellen	Novagen	70956-3
Ampicillin	Sigma Aldrich	PubChem Substance ID 329824407
Chloramfenicol	Sigma Aldrich	PubChem Substance ID: 24892250
LB-startcultuur	QIAGEN
LB-medium	QIAGEN	https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/head/search/external-link-icon.gif
IPTG	Sigma Aldrich	PubChem Substance ID 329815691
IMAC-buffer	Medicago	09-1010-10
EDTA-vrije proteaseremmers	Sigma Aldrich	11873580001
TALON-hars	Clonetech
Nikkel-sepharose	GE Healthcare
S200 16/60 kolom	GE Healthcare
Observatiebak met glazen bodem en 8 putjes	Ibidi	80827