Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Voorbereiding van een 68Ga-geëtiketteerden Arginine Glycine aspartaat (RGD)-peptide voor angiogenese

6.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58218

⸱

7 januari 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Applied RI, Korea Institute of Radiological and Medical Sciences

In dit artikel

Samenvatting

De αvβ3 integrine is een soort hechting eiwit dat zeer wordt uitgedrukt op geactiveerde endotheliale cellen ondergaan van angiogenese. Evaluatie van de integriteit van het integrine is dus van groot belang in de oncologie. Hier introduceren we een methode voor het bereiden van 68Ga-label radiopeptides en een methode om haar biologische effectiviteit te beoordelen.

Samenvatting

De αvβ3 integrine is een heterodimeric hechting molecule die betrokken zijn bij de tumor cel migratie en angiogenese. Het integrine is overexpressie in angiogenic tumor endotheliale cellen, waar het doorgaans een lage concentratie heeft. Deze specifieke expressie van αvβ3 maakt het een geldige biomerker voor antiangiogenic en imaging drugs. Als een functionele beeldvorming modaliteit biedt positron emissie tomografie (PET) informatie over biochemische en fysiologische veranderingen in vivo, vanwege haar unieke hoge gevoeligheid op de schaal van de nanomolar. Vandaar, op basis van radiometal PET radiofarmaceutica heb ontvangen veel aandacht voor de niet-invasieve kwantificering van tumor angiogenese. Dit witboek biedt een systemische protocol ter voorbereiding van een nieuwe radiometal-geëtiketteerden peptide van de evaluatie van angiogenese. Dit protocol bevat informatie over radiochemische betrouwbaarheid, lipofiel cel opname, serum stabiliteit en farmacokinetische eigenschappen. De 68Ga-RGD-peptide is één van de representatieve PET liganden naar αvβ3 integrine. Hier introduceren we een protocol ter voorbereiding van een 68Ga-RGD-peptide en de evaluatie van de biologische werkzaamheid.

Inleiding

Angiogenese is een biologisch proces, dat wordt gekenmerkt door de ontwikkeling van nieuwe bloedvaten. Onder de vele angiogenetic factoren, αvβ3 integrine wordt geassocieerd met invasiviteit, omdat het integrine zeer wordt uitgedrukt in angiogenic tumor schepen maar ontbreekt in normale weefsel1.

Radiolabeled receptor-bindende peptiden met het arginine glycine aspartaat (RGD) domein, die heeft een hoge affiniteit naar αvβ3 integrine receptoren, worden beschouwd als veelbelovende angiogenese imaging agenten2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. verschillende radiofarmaceutica zijn gemaakt voor huisdier en de biologische eigenschappen zijn gevalideerd in verschillende diermodellen8,9,10,11. In termen van een radionuclide heeft 68Ga verschillende voordelen ten opzichte van andere radioactieve isotopen. Ten eerste, het heeft een hoge toegankelijkheid voor gebruikers en is economisch voordeligste omdat een cyclotron niet vereist is. Ten tweede, 68Ga gebaseerde radiofarmaceutica produceren hoge ruimtelijke resolutie in vergelijking met single-photon emission berekend tomografie (SPECT), waardoor meer accurate kwantificering. Tot slot kan de 67.71 minuten halveringstijd van 68Ga volstaan voor de bereiding van kleine peptiden of eiwitten.

Voor de productie van een stabiele complex met 68Ga, zijn vele chelaatvormers ontwikkeld. Representatieve chelaatvormers zijn diethylenetriaminepentaacetic, 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecanetetraacetic zuur (TETA), 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-Dinatriumethyleendiaminetetra-azijnzuuroplossing (DOTA), 1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic zuur (NOTA) zuur (DTPA), en N, N'-di(2-hydroxybenzyl) ethyleendiamine-N, N'-diacetic zuur (HBED). NOTA heeft gemeld om te vormen een zeer stabiele complex met 68Ga (log stabiliteit constante 30.98)12,13,14.

Het doel van de huidige studie is een beknopte protocol voorzien in de ontwikkeling van een nieuwe radiopeptide (Figuur 1). Zo bereiden we 68Ga-geëtiketteerden RGD-peptiden en huidige methoden voor de biologische evaluatie van deze analogen in een xenograft model.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd met inachtneming van de richtsnoeren voor de zorg en het gebruik van onderzoek dieren onder protocollen door het Korea Instituut voor radiologische en medische wetenschappen Animal Studies Comité goedgekeurd. Alle reagentia en de oplosmiddelen werden gekocht en gebruikt zonder verdere zuivering. NOTA-RGD-peptiden opgesteld volgens literatuur methoden15.

Let op: 68Ga straalt zowel positron en gammastralen. Alle experimenten, met inbegrip van directe of indirecte contact met radioactieve stoffen, moeten worden uitgevoerd door opgeleid en personeel alleen toegestaan. Bij de behandeling van radioactieve materialen, moeten de juiste beschermende uitrusting, afscherming, straling dosismeters badge en ringen en een enquête meter worden gebruikt.

1. radiolabeling RGD-peptiden met 68GaCl3

Opmerking: 68Ga (t-1/2 = 68 min, β+ = 89%, en de EG = 11%) was afkomstig van de 68Ga /68Ge generator.

  1. Elueer de 68GaCl3 van de generator met 4 mL 0,05 M HCl.
  2. Purge met stikstofgas bij 80 ° C gedurende 30 minuten drogen 68GaCl3 (333 kBq, 1 mL) in een flesje van 5 mL reactie.
  3. Toevoegen van een oplossing van RGD-peptide (100 µg) in 1 M Natriumacetaat (100 µL, pH 5-6) op de flacon van de reactie met 68GaCl3 vanaf stap 1.2.
  4. Verwarm het reactiemengsel bij 80 ° C gedurende 5 min. Vervolgens afkoelen tot kamertemperatuur.
  5. Het zuiveren van het ruwe product met krachtige vloeibare chromatografie (HPLC). Gebruik het volgende systeem: een C-18 kolom, een debiet van 0,5 mL/min, een kleurovergang helling van acetonitril van 1.17%/min (5% - 40% in 30 min), en elutie onderdelen: A = 0,1% trifluorazijnzuur (TFA) in acetonitril, B = 0,1% TFA in water.
    Opmerking: De HPLC is uitgerust met een fotodiode array detector en een detector radioactiviteit. De 68Ga-RGD-peptide werd verzameld op een retentietijd van 12,5 min (Figuur 2).
  6. Zuiveren van de resulterende 68Ga-RGD-peptide met behulp van een systeem van vaste fase extractie.
    1. Laat de oplossing door een cartridge van de omgekeerde-phase C18 en wassen met 2 mL zoutoplossing.
    2. Elueer 68Ga-RGD-peptide met 0,7 mL 95% ethanol. Verwijder het oplosmiddel bij 80 ° C onder stikstofgas voor 20 min en reconstrueren met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) vóór gebruik.
    3. Filtreer het radiolabeled product door een 0,22 µm steriele filter en formuleren in 1 mL steriele zoutoplossing.
  7. Controleer de radiochemische opbrengst door radio-dunne-laag chromatografie (TLC).
    1. Ter plaatse 1 µL op een onmiddellijke dunne laag chromatografie plaat (ITLC, 10 cm in lengte). Ontwikkelen van de plaat in een cupje met het eluent (waterige 0,1 M citroenzuur, pH 5.0) tot 9 cm afstand van de plek.
      Opmerking: De retentie factor voor 68Ga-RGD-peptide is 0 en de retentie-factor voor spoorverontreiniging 68Ga3 + 1.
  8. Bereken de laatste specifieke activiteit van de verhouding van radioactiviteit die overeenkomt met de niet-radioactiviteit als MBq/nmol.
    Opmerking: Na de injectie van 100 µL van de geformuleerde 68Ga-RGD-peptide aan HPLC, de hoeveelheid niet-radioactieve component werd berekend op basis van de standaard kalibratiecurve met behulp van nonradioactive Ga-RGD-peptide.

2. in Vitro cellulaire opname

Opmerking: Uppsala 87 kwaadaardige Glioma (U87MG) menselijke glioblastoma cellen werden gekweekt in Dulbecco van gemodificeerde Eagle's media (DMEM), aangevuld met 10% foetale boviene serum en 1% penicilline-streptomycine. Cellen werden gekweekt in 150 mm gerechten bij 37 ° C in een bevochtigde sfeer van 5% CO2. Cellen werden geoogst of splitsen door trypsinebehandeling: 0,25% (m/v) trypsine en 0,02% (m/v) ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) in PBS bij 37 ° C gedurende 3-5 min.

  1. Zaad U87MG cellen in 6-Wells-platen bij een dichtheid van 1 x 106 cellen per putje.
  2. Incubeer de cellen met 68Ga-RGD-peptide (111 kBq) bij 37 ° C gedurende 30, 60, 90 en 120 min. voorbereiden monsters in drievoud.
  3. Wassen van de cellen 2 x met 2 mL PBS en oogst door trypsinebehandeling. Gebruik 0,25% (m/v) trypsine en 0,02% (m/v) ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) in PBS bij 37 ° C gedurende 3-5 minuten.
  4. Het verzamelen van de celsuspensie (500 µL) en de maatregel in een γ-teller.
  5. Bereken het percentage opname van de stof door de cellen door % (graven in cellen/totaal graven).

3. in Vitro Serum stabiliteit

  1. Voeg 500 µL van vers bereide muis serum, 500 µL van menselijk serum en 500 µL van PBS. Incubeer het mengsel bij 37 ° C gedurende 2 uur.
  2. Evalueren door ITLC met de opgegeven tijdsintervallen (30, 60, 90 en 120 min). Ter plaatse van 1-2 µL aliquoot gedeelte van het mengsel aan de ITLC plaat (mobiele fase: 0,1 M citroenzuur). Ontwikkelen van de plaat zoals in stap 1.7.
    Opmerking: 68Ga3 + wordt verwacht om te gaan met het oplosmiddel front, overwegende dat de gelabelde stof aan de oorsprong blijven zal.

4. bepaling van lipofiel

  1. 68Ga-RGD-peptide (3.7 MBq, 3.7 µL) toevoegen aan het systeem van de octanol-PBS (1:1, v/v, totale 1 mL).
  2. Meng de flesjes krachtig gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en centrifuge op 10.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  3. 100 µL monsters nemen van elke laag en meten van de radioactiviteit met een γ-teller. De gerapporteerde log P-waarde is gebaseerd op het gemiddelde van de drie monsters.

5. tumor Model

Opmerking: BALB/c naakt muizen (6-8 weken oud, vrouw, n = 23) werden gebruikt voor deze studie. De muizen werden vervolgens gebruikt voor PET studies (n = 3) en ook (n = 20) wanneer de tumor volumes bereikt 200-300 mm3 (1-2 weken na implantatie).

  1. Laad tumorcellen in 28 octies, 1/2 inch insuline spuiten.
  2. Injecteren U87MG cellen (5 x 106) in 100 µL van PBS in de linker arm-regio.
  3. Anesthetize de muis met 2% Isofluraan in zuurstof gas tijdens cel injectie.
    1. Zorg ervoor dat de muis heeft zijn verdoofd door het verlies van de pedaal terugtrekking reflex volgende knijpen met een tang tussen de tenen van de voet recht hind. Laat niet een dier zonder toezicht totdat het voldoende bewustzijn te handhaven sternale lighouding heeft herwonnen.

6. in Vivo kwantificering van αvβ3 integrine met behulp van huisdier

  1. Anesthetize van de muizen met 2% Isofluraan in zuurstof.
    1. Zorg ervoor dat de muis heeft zijn verdoofd door het verlies van de pedaal terugtrekking reflex volgende knijpen met een tang tussen de tenen van de voet recht hind. Laat niet een dier zonder toezicht totdat het voldoende bewustzijn te handhaven sternale lighouding heeft herwonnen.
  2. Plaats het hoofd in het midden van de PET gantry.
  3. Intraveneus toedienen de 68Ga-RGD-peptide-oplossing (7.4 MBq, 200 µL) aan de xenograft muis model via de staart ader voor 1 min.
  4. Op hetzelfde moment, uitvoeren van een PET-scan in de lijst modus (dynamische scan) voor 150 min.
    Opmerking: De ruwe gegevens van de PET werden gereconstrueerd door een gebruiker gedefinieerde tijdsbestek (dat wil zeggen, elke 30 min). Na de PET-scan, een micro-berekend tomografie (CT) scan (50 kVp van X-ray, 0.16 mA) werd uitgevoerd voor demping correctie.

7. Ex Vivo ook

  1. 68Ga-RGD-peptide (0.37 MBq, 200 µL) injecteren in de ader van de staart van de muismodel van xenograft. Anesthetize de muis met 2% Isofluraan in zuurstof gas tijdens de injecties.
    Opmerking: BALB/c naakt muizen, zoals beschreven in sectie 5, waren verdeeld in vier groepen en geofferd op verschillende tijdstippen (n = 5 per groep).
  2. De muizen wakker onmiddellijk na de toediening van 68Ga-RGD-peptide en offeren ze op 30, 60, 90 en 120 min postinjection met kooldioxide euthanasie.
    Opmerking: De weefsels van belang werden gehaald. Geselecteerde doelen waren de bloed, spieren, hart, Long, lever, milt, maag, darm, nieren, bot en tumor.
  3. Weeg het weefsel en meten van de radioactiviteit met een γ-teller.
    Opmerking: Resultaten werden uitgedrukt als het percentage ingespoten dosis per gram weefsel (% ID/g).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De chelatie van 68GaCl3 met de NOTA-RGD-peptide was eenvoudig, en het radiolabeling rendement was 99%. Reactie onzuiverheden werden verwijderd zoals afgebeeld in Figuur 2. De radiochemische zuiverheid van 68Ga-RGD-peptide was meer dan 99%, en de specifieke activiteit aan het einde van de synthese was 90-130 MBq/nmol (Figuur 3).

De opname...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In de huidige studie, introduceerden we een protocol ter voorbereiding van een radiopeptide dat targeting αvβ3 integrine en haar biologische evaluatie. Traditionele Geneesmiddelenontwikkeling impliceert een ingewikkelde procedure. Het vereist een grote hoeveelheid referentiemateriaal en een relatief lange evaluatietijd. Hoewel de voorgestelde methodologie niet het delicate evaluatieproces vervangen, kan dit systeem worden gebruikt voor screeningonderzoek. Deze voorgestelde systeem zou aanzienlijk mi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door een nucleaire onderzoeks- en ontwikkelingsprogramma van de subsidie van de National Research Foundation van Korea (NRF) gefinancierd door de Koreaanse overheid (nr. 2017M2A2A6A02019904).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
68Ga/68Ge generatorITG Company-10 mCi 
Hydrogen chloride solutionSigma-aldrich84429
Sodium acetateSigma-aldrichS2889
C18 reverse-phase cartridgeWatersWAT020515
0.22-μm sterile filterMillliporeSLGV033RS
Radio-TLC scannerBioscanAR2000
ITLC paperAgilentSGI001
Citric acidSigma-aldrich251275
HPLCWaters-Waters 1525 systeem met binaire pomp, fotodiode array (Waters 2998), radioactiviteitsdetector (Raytest, Gabi)
AcetonitrileJ.T. Baker14-650-359
Trifluoroacetic acidSigma-aldrich302031
Dulbecco's modified Eagle media Thermo fisher scientific11965092
fetal bovine serumThermo fisher scientific16000044
T175 flasks CorningCLS431080
Trypsin-EDTA (0.25%)Thermo fisher scientific25200072
penicillin-streptomycinThermo fisher scientific15240112
γ-counterPerkin Elmer-1480 Wizard 3
Insunlin syringeBecton Dickinson326105
Synringe pumpHarvard Apparatus70-4500
micro-PET/CTSiemens Inveon-

Referenties

  1. Friedlander, M., et al. Definition of Two Angiogenic Pathways by Distinct alpha v integrins. Science. 270 (5241), 1500-1502 (1995).
  2. Janssen, M. L., et al. Tumor Targeting with Radiolabeled alpha v beta 3 Integrin Binding Peptides in a Nude Mouse Model. Cancer Research. 62, 6146-6151 (2002).
  3. Kok, R. J., et al. Preparation and functional evaluation of RGD-modified proteins as αvβ3 integrin directed therapeutics. Bioconjugate Chemistry. 13 (1), 128-135 (2002).
  4. Garanger, E., et al. New multifunctional molecular conjugate vector for targeting, imaging, and therapy of tumors. Molecular Therapy. 12 (6), 1168-1175 (2005).
  5. Dijkgraaf, I., et al. PET imaging of αvβ3 integrin expression in tumours with 68Ga-labelled mono-, di- and tetrameric RGD peptides. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 38 (1), 128-137 (2011).
  6. Liu, Z., et al. 68Ga-labeled cyclic RGD dimers with Gly3and PEG4linkers: Promising agents for tumor integrin αvβ3 PET imaging. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 36 (6), 947-957 (2009).
  7. Li, Z. B., Chen, K., Chen, X. 68Ga-labeled multimeric RGD peptides for microPET imaging of integrin αvβ3expression. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 35 (6), 1100-1108 (2008).
  8. Liu, S., et al. Isomerism and solution dynamics of 90Y-labeled DTPA-biomolecule conjugates. Bioconjugate Chemistry. 12 (1), 84-91 (2001).
  9. Haubner, R., et al. Glycosylated RGD-containing peptides: tracer for tumor targeting and angiogenesis imaging with improved biokinetics. Journal of Nuclear Medicine. 42 (2), 326-336 (2001).
  10. Sivolapenko, G. B., et al. Imaging of metastatic melanoma utilising a technetium-99m labelled RGD-containing synthetic peptide. Euroean Journal of Nuclear Medicine. 25 (10), 1383-1389 (1998).
  11. Haubner, R., et al. Noninvasive Imaging of αvβ3 Integrin Expression Using 18 F-labeled RGD-containing Glycopeptide and Positron Emission Tomography. Cancer Research. 61, 1781-1785 (2001).
  12. Clarke, E. T., Martell, A. E. Stabilities of trivalent metal ion complexes of the tetraacetate derivatives of 12-, 13- and 14-membered tetraazamacrocycles. Inorganica Chimica Acta. 190 (1), 37-46 (1991).
  13. Clarke, E. T., Martell, A. E. Stabilities of the Fe(III), Ga(III) and In(III) chelates of N,N′,N″-triazacyclononanetriacetic acid. Inorganica Chimica Acta. 181 (2), 273-280 (1991).
  14. Shetty, D., Lee, Y. S., Jeong, J. M. 68Ga-labeled radiopharmaceuticals for positron emission tomography. Nuclear Medicine Molecular Imaging. 44 (4), 233-240 (2010).
  15. Shin, U. C., et al. Synthesis and Preliminary Evaluation of 68Ga-NOTA-Biphenyl-c(RGDyK) for the Quantification of Integrin αvβ3. Bulletin of the Korean Chemical Society. 38 (12), 1415-1418 (2017).
  16. Cai, W., Chen, X. Multimodality Molecular Imaging of Tumor Angiogenesis. Journal of Nuclear Medicine. 49, suppl2 113-128 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Gallium 68-markeringRGD-peptide syntheseangiogenese-beeldvormingPET-radiofarmacahogedrukvloeistofchromatografiecelopname-assayserumstabiliteitstestlipofiliteitsmetingtumorbiodistributieradiochemische opbrengst
Voorbereiding van een 68Ga-geëtiketteerden Arginine Glycine aspartaat (RGD)-peptide voor angiogenese
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.