Chronische oculaire hypertensie wordt geïnduceerd door het toepassen van een circumlimbal hechtdraad bij ratten en muizen, wat leidt tot functionele en structurele verslechtering van de retinale peesknoopcellen overeenstemming met glaucoom.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een Model van glaucoom veroorzaakt door Circumlimbal hechtdraad bij ratten en muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De circumlimbal hechtdraad is een techniek om experimentele glaucoom bij knaagdieren door chronisch verheffen intraoculaire druk (IOP), een bekende risicofactor voor glaucoom. Dit protocol toont een geleidelijke gids op deze techniek in C57BL/6 muizen en ratten van de lange Evans. Onder algemene verdoving, wordt een "tas-string" hechtdraad toegepast op het bindvlies, rond de evenaar en achter de limbus van het oog. De collega oog dient als een onbehandeld controlegewas. Gedurende de looptijd van onze studie, die een periode van 8 weken voor ratten en 12 weken voor muizen was, bleef IOP verhoogde, zoals regelmatig gemeten door rebound tonometry in bewuste dieren zonder topische verdoving. In beide soorten toonde de sutured ogen electroretinogram functies consistent met preferentiële innerlijke retinale dysfunctie. Optische coherentie tomografie toonde selectieve dunner worden van de retinale zenuw vezel laag. Histologie van het netvlies van de rat in doorsnede gevonden verminderd celdichtheid in de ganglion cellaag, maar geen verandering in de andere cellulaire lagen. Verkleuring van de flat gemonteerde muis retinae met een specifieke marker voor ganglion cel (RBPMS) bevestigd ganglion cel verlies. De circumlimbal hechtdraad is een eenvoudig, minimaal invasieve en rendabele manier voor het opwekken van oculaire hypertensie die tot de ganglion cel letsel bij zowel ratten en muizen leidt.
Inleiding
Dierlijke modellen bieden dat een belangrijk platform voor laboratorium onderzoek van cellulaire processen onderliggende glaucoom pathogenese, evenals over het evalueren van potentiële therapeutische interventies. Verschillende afleidbare modellen zijn ontwikkeld voor het produceren van aanhoudende intraoculaire druk (IOP) hoogte, de belangrijkste risicofactor voor glaucoom. Methoden die zijn toegepast te verheffen IOP omvatten: hypertonic zoute injectie in episcleral1, photocoagulation van de laser van het trabecular gevlochten2 of van de limbal aderen3, en intracameral injectie van stoffen zoals veins Ghost rode bloedcellen4, microbeads5,6 en visco agenten7. Elke benadering heeft zijn voordelen en beperkingen.
Een goed model voor glaucoom moet het nabootsen van het ziekteproces, met minimale complicatie zoals trauma, ontsteking en media dekking. Deze complicaties worden vaak geassocieerd met de procedures die zijn gebruikt voor het opwekken van IOP hoogte en interpretatie van resultaten kunnen verwarren. Bijvoorbeeld, heeft paracentesis van de voorste kamer, zelfs wanneer vreemde stoffen worden niet ingevoerd, aangetoond dat veroorzaken trauma en ontsteking die niet representatief zijn voor de typische glaucomatous verandering8,9. Naast het belang van het vermijden van de ontsteking, vergemakkelijkt behoud van de optische helderheid in vivo imaging en electrofysiologie te controleren van de progressie van de ziekte. Hoewel het onduidelijk in hoeverre deze complicaties kunnen gevolgen hebben voor onderzoek van de ziekte, is het mogelijk beter om te voorkomen dat het oog doordringen tijdens model inductie. De circumlimbal hechtdraad aanpak vermijdt penetratie van de hele wereld en vergemakkelijkt in vivo longitudinale beoordeling van retinale structuur en functie. Nog belangrijker, verschilt dit model van voorgaande in zijn hoedanigheid van terugkomen IOP basislijnwaarden door verwijdering van de hechtdraad wanneer dit nodig is. IOP normalisatie kunnen nuttig zijn voor de studie van de cellulaire en moleculaire correlaten van omkeerbare en onomkeerbare ganglion cel letsel10,11,12,13,14.
Dit artikel richt zich op de techniek voor het model inductie. Karakterisering van retinale letsel veroorzaakt door dit model bij ratten en muizen vindt u elders uitvoeriger15,16,17,18,19.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimentele procedures werden uitgevoerd volgens de Australische Code of Practice voor de zorg en het gebruik van dieren voor wetenschappelijke doeleinden, ingesteld door de National Health and Medical Research Council in Australië. Ethiek goedkeuring was verkregen van de Howard Florey Instituut dier ethische Commissie (goedkeuring nummer 13-044-UM en 13-068-UM voor ratten en muizen, respectievelijk).
1. de intraoculaire druk meting bij bewuste ratten
- Het laboratorium rebound tonometer ingesteld op de instelling van de rat. Swaddle wakker ratten in een stuk zachte doek om de rust van het dier. Het blootstellen van het hoofd en de nek. Zachtjes Houd de romp in de ene hand, met het dier terug rust tegen de borst van de onderzoeker.
Opmerking: Topische verdoving is niet nodig. - Gebruik de andere hand te brengen de rebound tonometer in de buurt van de rat's oog, zodat het uiteinde van de sonde IOP ongeveer 2-3 mm weg van zijn en loodrecht staan op het hoornvlies apex is. Gebruik de rechterhand te meten IOP rechter oog van het dier, en de linkerhand voor het linker oog.
- Wacht een paar seconden voor de rat om te kalmeren en druk eenmaal op de knop van de meting. Observeer dat het uiteinde van de sonde IOP zachtjes sloeg het hoornvlies apex eens; en hoor de rebound tonometer pieptoon eens.
Opmerking: Een enkele pieptoon van de tonometer bevestigt succesvolle meting, die van het LCD-scherm kan worden gelezen. Een dubbele pieptoon geeft een meetfout. Meetfouten kunnen voortvloeien uit factoren zoals ongepast afstand tussen de sonde en het hoornvlies, een buitensporige kantelen in de richting van de tonometer of de sonde opvallend het ooglid of een niet-centrale deel van het hoornvlies. Raadpleeg de rebound tonometer handleiding van de fabrikant voor verdere details met betrekking tot meetfouten. - Herhaal stap 1.3 tien keer met een tussenpoos van 1-2 seconden, deze metingen afgeleid een gemiddelde waarde van het IOP voor dat tijdstip. Reset de tonometer na de 5th -lezing.
- Meten voor seriële monitoring, IOP op hetzelfde moment van de dag en onder consistente lichtomstandigheden te minimaliseren variatie als gevolg van de diurnale IOP cyclus20,-21.
2. de intraoculaire druk meting in bewuste muizen
- De rebound tonometer ingesteld op de muisinstelling van de volgens de instructie van de fabrikant.
- Beperken de muis met de hand, plaatst u de muisaanwijzer boven op een grill kooi en trek voorzichtig de staart achteruit.
Opmerking: Dit zal het dier om grip op de metalen grill met zijn voorpoten en de poging te trekken zelf naar voren, die zal iets rek haar lichaam prompt.- Gebruik de andere hand te begrijpen van de losse huid onmiddellijk achter de oren. Beveilig het onderlichaam van het dier door het ingedrukt houden van de staart tussen de middelvinger en ringvinger (of tussen de kleine vinger en uw palm).
Opmerking: Probeer niet te begrijpen van de huid te strak, te voorkomen dat verstikking en toepassen Druk op de ogen.
- Gebruik de andere hand te begrijpen van de losse huid onmiddellijk achter de oren. Beveilig het onderlichaam van het dier door het ingedrukt houden van de staart tussen de middelvinger en ringvinger (of tussen de kleine vinger en uw palm).
- Met het nu vrije hand (in eerste instantie houden de staart), brengen de rebound tonometer in de buurt van de muis oog, zodat het uiteinde van de sonde IOP ongeveer 2-3 mm uit zijn en loodrecht staan op het hoornvlies apex is. Voor het meten van het andere oog, door de muis te draaien zodat het andere oog nu voor de tonometer ligt.
- Wachten op de muis om te kalmeren en druk eenmaal op de knop van de meting. Observeer dat het uiteinde van de sonde IOP zachtjes sloeg het hoornvlies apex; met een enkele pieptoon bevestigt succesvolle meting.
Opmerking: Een dubbele pieptoon geeft een meetfout. Het kan helpen om een tweede experimentator lezen en document het IOP lezingen terwijl de eerste experimentator de metingen neemt. - Herhaal stap 2.4 tien succesvolle lezingen te ontlenen een IOP verkrijgen. Reset de tonometer na de 5th -lezing. Een interval van 1-2 seconden tussen lezingen toestaan.
- Meten vanaf de seriële meting bij ratten, muis IOP op hetzelfde moment van de dag en onder consistente lichtomstandigheden.
3. de inductie van verhoging van de oogboldruk bij narcose ratten en muizen
- Schoonmaken van het chirurgische bankje met 0,5% chloorhexidine in 70% ethanol. Betrekking hebben op de Bank met steriele doeken. Autoclaaf alle chirurgische apparatuur vooraf. Zorgen dat alle onderzoekers dragen passende persoonlijke beschermingsmiddelen (chirurgische maskers, toga's en gesteriliseerde handschoenen).
- Plaats het dier in een inductie-zaal om te induceren narcose. 3-3.5% Isofluraan met O2 leveren bij een debiet van 3 L/min.
- Anesthesie met 1,5% Isofluraan op 2 L/min geleverd via een knaagdier gezichtsmasker gedurende de chirurgie te handhaven. Zorgen voor voldoende diepte van verdoving door het ontbreken van een poot snuifje reflex.
- Respiratoire depressie voorkomen door aanpassing van de stroomsnelheid wanneer dat nodig is om de luchtwegen tempo ongeveer 60 ademhalingen/min.
- Willekeurig één oog voor het opwekken van oculaire hypertensie, met het contralaterale oog om te dienen als een onbehandeld controlegewas. Inboezemen een daling van 0,5% proxymetacaine ophthalmic oplossing voor topische verdoving. Voor de reiniging van het oogbeschadigingen en/of oppervlak, spoel het oog met 3 mL steriele normale zout.
- Dekking van het dier met een steriele, fenêtré chirurgische gordijn, blootstelling van het oog om te worden ingehecht.
- Een portemonnee-snarige Sutuur (geologie) uitvoeren op de bulbaire bindvlies rond de hele wereld. Bij ratten, weven de 7/0 nylon hechtdraad parallelle en 2 mm posterieure aan de limbus (Figuur 1). Plaats in muizen, de 10/0 nylon hechtdraad aan 1 mm posterieure aan de limbus.
- Wees voorzichtig niet te doordringen van de sclera. Een plotselinge bestaat dilatatie tijdens de chirurgische procedure toont u dat de sclera is waarschijnlijk zijn doorgedrongen.
- Anker de hechtdraad op het bindvlies met 5-6 ankerpunten bij ratten en 4-5 ankerpunten in muizen.
- Vermijd directe compressie op de grote episcleral aderen door threading van de hechtdraad onder het bindvlies op de kruising van deze aderen.
Opmerking: Terwijl het is raadzaam om het vermijden van compressie van de ader van de grote episcleral bij ratten, dit is niet routinematig gedaan in muizen als gevolg van lage zichtbaarheid van deze aderen in de ogen van de muis. Hoewel de grote aderen niet rechtstreeks worden gecomprimeerd, is het waarschijnlijk dat de kleinere vaartuigen in het episcleral veneuze plexus staan onder druk, die mogelijk een factor die bijdraagt tot de duurzame IOP kanteling (zie discussie voor mechanisme IOP hoogte).
- Zet vast de portemonnee-snarige hechtdraad door koppelverkoop van een slipknot dan gevolgd door een tweede eenvoudige knoop (Figuur 1). Om te voorkomen dat een te hoge post chirurgische IOP spike, hebt u een assistent meten van het IOP onmiddellijk vóór de sluiting van de tweede knoop.
- Als het IOP is gevonden te hoog, past u de slip knoop door het gedeeltelijk het vrijgeven van de spanning aan de ene kant van de hechtdraad (pijl in Figuur 1A).
- Nadat de gewenste IOP is bereikt (idealiter 30-60 mmHg in ratten- of 30-40 mmHg bij muizen), gelijkspel uit de tweede knoop terwijl het handhaven van een continue trekken kracht aan die kant van de hechtdraad (pijl in Figuur 1A).
- Na de tweede knoop is strakker geworden, trim de uiteinden van de hechtdraad om te minimaliseren van de sensatie van een vreemd lichaam. Het dier volgen tijdens het herstellen van de narcose.
Opmerking: Het is belangrijk dat het gebruik van de slipknot wanneer koppelverkoop de knoop eerste om voldoende innerlijke compressie op het oog. Na enkele weken wordt meestal opgemerkt dat de uiteinden worden ingebed in het bindvlies.
4. toezicht IOP
- Neem de eerste meting van het IOP op 2 minuten post-operatively onder Isofluraan verdoving. Vervolgens controleren IOP wanneer het knaagdier heeft herwonnen bewustzijn volgens de bovengenoemde stappen 1 en 2.
Opmerking: Controleren het IOP tweemaal tijdens de eerste dag (2 minuten en 1 uur), dagelijks in de eerste week en eenmaal of tweemaal per week daarna.
5. het analyseren van retinale structuur en functie
- Meten op het gewenste experimentele eindpunt (in dit geval na 8 weken bij ratten en 12 weken in muizen), onder algemene verdoving intraperitoneale injectie met ketamine/xylazine, retinale functie met de dark-adapted electroretinogram (ERG) zoals beschreven meer in detail elders15,16,17.
Opmerking: We hebben gevonden robuuste ganglion cel dysfunctie, het netvlies zenuw vezels laag dunner en de ganglion cel verlies voor een duur tussen 8-12 weken. Anderen hebben met succes werkzaam langere IOP hoogte14,15. - Onmiddellijk na ERG meting, meet de dikte van de laag van de retinale zenuw vezels (RNFL) en de totale retinale dikte met behulp van spectrale domein optische coherentie tomografie (SD-OCT) 16,18.
- Aan het eind van de longitudinale studie, euthanaseren de dieren onder diepe verdoving.
- Ontleden van het netvlies voor histologie18, bijvoorbeeld immunokleuring van geheel-mount netvlies met behulp van een specifiek antilichaam van retinale ganglion cel (regering van Cambodja) zoals RNA-bindende eiwit met meerdere splicing antilichaam (RBPMS) of hersenen-specifieke homeobox/POU domein eiwit 3A (Brn3a)16,19,22.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De volgende resultaten in ratten muizen en18 16 eerder gemeld en zijn hier samengevat. De circumlimbal hechtdraad geproduceerd een vergelijkbaar patroon IOP hoogte bij ratten en muizen (Figuur 2). Een korte piek van IOP, tot 58.1 ± 2,7 mmHg bij ratten en 38.7 ± 2.2 mmHg bij muizen, bleek onmiddellijk na de ingreep van de hechtdraad. Bij ratten, IOP omvang geleidelijk verminderd na verloop van tijd die 44 ± 6 mmH...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De circumlimbal hechtdraad is een nieuw model van chronische oculaire hypertensie. Naast de studies waaruit de representatieve resultaten afkomstig16,18 zijn, is deze diermodel gebruikt in een aantal recente studies15,23,24,25 ,26. Vergelijking over deze vorige verslagen blijkt dat de methode herhaalb...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk wordt gefinancierd door nationale gezondheids- en medische onderzoek Raad van Australië projectsubsidie (1046203), Australisch onderzoek Raad toekomst Fellowship (FT130100338).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| normal saline | Baxter International Inc | AHB1323 | Behouden hoornvocht tijdens operatie |
| Chlorhexadine 0,5% | Orion Laboratories | 27411, 80085 | Desinfectie van chirurgisch instrument |
| Isoflurane 99,9% | Abbott Australasia Pty Ltd | CAS 26675-46-7 | Merknaam: Isoflo(TM) Inhalatieanestheticum. Farmaceutische kwaliteit inhalatieanestheticum gemengd met zuurstofgas voor hechtprocedure |
| oculair smeermiddel | Alcon Laboratories | 1618611 | Merknaam: Genteal, oculair smeermiddel om het andere oog vochtig te houden |
| Naadlehouder (microchirurgie) | World Precision Instruments | 555419NT | Om naald vast te houden tijdens oogoperatie |
| Proxymetacaine 0,5% | Alcon Laboratories | CAS 5875-06-9 | Topische oculaire analgese |
| Schaar (microchirurgie) | World Precision Instruments | 501232 | Om overtollige hechtstront te snijden tijdens ligatie |
| Chirurgisch doek | Vital Medical Supplies | GM29-612EE | Zorgen voor steriele omgeving tijdens operatie |
| Hechtnaald voor ratten (microchirurgie) | Ninbo medical needles | 151109 | 8-0 nylon hechtdraad bevestigd met ronde naald, snijkant 3/8, dubbel-naald, hechtlengte 30cm |
| Hechtnaald voor muizen (microchirurgie) | Ninbo medical needles | 160905 | 10-0 nylon hechtdraad bevestigd met ronde naald, snijkant 3/8, dubbel-naald, hechtlengte 30cm |
| Pincet (microchirurgie) | World Precision Instruments | 500342 | Weefsels manipuleren tijdens oogoperatie |
| rebound tonometer | TONOLAB, iCare, Helsinki, Finland | TV02 | voor intraoculaire drukbewaking |
Referenties
- Morrison, J. C., et al. A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage. Experimental Eye Research. 64 (1), 85-96 (1997).
- Feng, L., Chen, H., Suyeoka, G., Liu, X. A laser-induced mouse model of chronic ocular hypertension to characterize visual defects. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Chiu, K., Chang, R., So, K. F. Laser-induced chronic ocular hypertension model on SD rats. Journal of Visualized Experiments. (10), 549(2007).
- Quigley, H. A., Addicks, E. M. Chronic experimental glaucoma in primates. I. Production of elevated intraocular pressure by anterior chamber injection of autologous ghost red blood cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 19 (2), 126-136 (1980).
- Bunker, S., et al. Experimental glaucoma induced by ocular injection of magnetic microspheres. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Weber, A. J., Zelenak, D. Experimental glaucoma in the primate induced by latex microspheres. Journal of Neuroscience Methods. 111 (1), 39-48 (2001).
- Moreno, M. C., et al. A new experimental model of glaucoma in rats through intracameral injections of hyaluronic acid. Experimental Eye Research. 81 (1), 71-80 (2005).
- Hoyng, P. F., Verbey, N., Thorig, L., van Haeringen, N. J. Topical prostaglandins inhibit trauma-induced inflammation in the rabbit eye. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 27 (8), 1217-1225 (1986).
- Kezic, J. M., Chrysostomou, V., Trounce, I. A., McMenamin, P. G., Crowston, J. G. Effect of anterior chamber cannulation and acute IOP elevation on retinal macrophages in the adult mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (4), 3028-3036 (2013).
- Waisbourd, M., et al. Reversible structural and functional changes after intraocular pressure reduction in patients with glaucoma. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 254 (6), 1159-1166 (2016).
- Foulsham, W. S., Fu, L., Tatham, A. J. Visual improvement following glaucoma surgery: a case report. BMC Ophthalmology. 14, 162(2014).
- Anderson, A. J., Stainer, M. J. A control experiment for studies that show improved visual sensitivity with intraocular pressure lowering in glaucoma. Ophthalmology. 121 (10), 2028-2032 (2014).
- Ventura, L. M., Feuer, W. J., Porciatti, V. Progressive loss of retinal ganglion cell function is hindered with IOP-lowering treatment in early glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (2), 659-663 (2012).
- Zhao, D., et al. ARVO abstract number 3696 - B0043. annual meeting of Association for Research in Vision and Ophthalmology, Honolulu, Hawaii, USA. , (2018).
- Liu, H. H., et al. Chronic ocular hypertension induced by circumlimbal suture in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (5), 2811-2820 (2015).
- Zhao, D., et al. Characterization of the Circumlimbal Suture Model of Chronic IOP Elevation in Mice and Assessment of Changes in Gene Expression of Stretch Sensitive Channels. Frontiers in Neuroscience. 11, 41(2017).
- Nguyen, C. T., et al. Simultaneous Recording of Electroretinography and Visual Evoked Potentials in Anesthetized Rats. Journal of Visualized Experiments. (113), (2016).
- Van Koeverden, A. K., He, Z., Nguyen, C. T., Vingrys, A. J., Bui, B. V. Systemic hypertension is not protective against chronic IOP elevation in a rodent model. Scientific Reports. 8 (1), 7107(2018).
- Rodriguez, A. R., de Sevilla Muller, L. P., Brecha, N. C. The RNA binding protein RBPMS is a selective marker of ganglion cells in the mammalian retina. Journal of Comparative Neurology. 522 (6), 1411-1443 (2014).
- Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Twenty-four-hour pattern of mouse intraocular pressure. Exp Eye Research. 77 (6), 681-686 (2003).
- Jia, L., Cepurna, W. O., Johnson, E. C., Morrison, J. C. Patterns of intraocular pressure elevation after aqueous humor outflow obstruction in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (6), 1380-1385 (2000).
- Nadal-Nicolas, F. M., Jimenez-Lopez, M., Sobrado-Calvo, P., Nieto-Lopez, L., Canovas-Martinez, I., Salinas-Navarro, M., Vidal-Sanz, M., Agudo, M. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3860-3868 (2009).
- Liu, H. H., Flanagan, J. G. A Mouse Model of Chronic Ocular Hypertension Induced by Circumlimbal Suture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (1), 353-361 (2017).
- Liu, H. H., He, Z., Nguyen, C. T., Vingrys, A. J., Bui, B. V. Reversal of functional loss in a rat model of chronic intraocular pressure elevation. Ophthalmic & Physiological Optics. 37 (1), 71-81 (2017).
- Liu, H. H., Zhang, L., Shi, M., Chen, L., Flanagan, J. G. Comparison of laser and circumlimbal suture induced elevation of intraocular pressure in albino CD-1 mice. PLoS One. 12 (11), 0189094(2017).
- Shen, H. H., et al. Intraocular Pressure Induced Retinal Changes Identified Using Synchrotron Infrared Microscopy. PLoS One. 11 (10), 0164035(2016).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
