Method Article

Een aanpasbare Protocol voor String vergadering gRNA klonen (STAgR)

DOI:

10.3791/58556

⸱

December 26th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1MCN Junior Research Group, Munich Center for Neurosciences, Ludwig Maximilian Universitat, BioMedical Center, 2Institute of Stem Cell Research, Helmholtz Zentrum, German Research Center for Environmental Health, 3Institute of Developmental Genetics, Helmholtz Zentrum, German Research Center for Environmental Health, 4Physiological Genomics, Ludwig Maximilian Universitat, BioMedical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we tekenreeks vergadering gRNA klonen (STAgR), een methode om gemakkelijk multiplex gRNA vectoren voor CRISPR/Cas9 benadert. STAgR maakt gRNA multiplex eenvoudig, efficiënt en klantgericht.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De bacteriële CRISPR/Cas9-systeem is aanzienlijk toegenomen methodologische opties voor leven wetenschappers. Als gevolg van het gebruik, genetische en genomische engineering van toepassing is geworden tot een groot aantal systemen. Bovendien veel transcriptionele en epigenomic engineering benaderingen zijn nu algemeen haalbaar voor de eerste keer. Een van de redenen voor de brede toepasbaarheid van CRISPR ligt in de bipartiete aard. Kleine gRNAs bepalen de genomic doelstellingen van het complex, varianten van het eiwit Cas9, en de lokale moleculaire gevolgen. Veel CRISPR benaderingen hangen echter af van de gelijktijdige levering van meerdere gRNAs in afzonderlijke cellen. Hier presenteren we een aanpasbare protocol voor tekenreeks vergadering gRNA klonen (STAgR), een methode waarmee het eenvoudig, snel en efficiënt genereren van multiplexed gRNA expressievectoren in een enkele klonen stap. STAgR is kosteneffectief, aangezien (in dit protocol) de individuele targeting sequenties zijn geïntroduceerd door korte overhang inleidingen terwijl de lange DNA-sjablonen van de cassettes van de expressie gRNA meerdere malen hergebruikt kunnen worden. Bovendien kunnen STAgR Macrostap opneming van een groot aantal gRNAs, evenals de combinaties van verschillende gRNA varianten, vectoren en initiatiefnemers.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tekenreeks vergadering gRNA klonen (STAgR) is een methode waardoor efficiënte overnachting generatie expressievectoren met meerdere gRNA expressie cassettes in klonen van één enkele stap. Het STAgR-protocol niet afhankelijk is van specialistische kennis of materiaal en biedt meerdere opties voor aanpassing.

De bacteriële CRISPR proteïne Cas9 heeft een unieke capaciteit. Het is in staat om te vinden en binden selectief alleen die DNA-sequenties die zijn gecodeerd in de natuurlijk voorkomende crRNAs of gemanipuleerde gRNAs1. Het gebruik als een moleculaire instrument heeft een groot aantal benaderingen die niet onmogelijk, onhaalbaar waren of slechts beperkt tot bepaalde cellulaire modellen tot voor kort. Het gaat hierbij om gerichte gen mutaties2, genoom engineering3, epigenome4,5,6, transcriptionele activering en gene silencing7,8te bewerken. As far as we know dat CRISPR is universeel inzetbaar, zoals verslagen van de toepassing ervan bestaan voor een breed scala van doel sites, celtypen en soorten. Veel toepassingen van de CRISPR hangen echter direct of indirect de levering van meerdere gRNAs, met inbegrip van een reeks van genomic manipulaties (translocaties9,10, middellange11 en grootschalige genomic veranderingen 12 , 13), genoom engineering (gebruik van Cas9 nickases14), de generatie van voorwaardelijke allelen11,15 of seriële mutaties16en tracering van strategieën17. Bovendien, voor andere benaderingen (transcriptionele engineering18, epigenome engineering19,20) meerdere targeting sites niet zijn strikt verplicht is, maar ze bereiken hun maximale effect vaak alleen onder dit voorwaarde.

Verschillende nuttige methoden zijn beschreven voor het genereren van gRNA vectoren met meer dan één gRNA expressie cassette21,22,23,24,25,26, 27. Hier presenteren we een protocol voor STAgR, tekenreeks vergadering gRNA klonen, die is uitstekend in zijn combinatie van eenvoud en snelheid (slechts één overnachting klonen stap nodig is), lage kosten (zoals DNA sjablonen kunnen meerdere malen worden hergebruikt), aanpasbaarheid (voor verschillende gRNA systemen en de promotoren) en doeltreffendheid (hierdoor de rendering van vectoren met hoge nummers van gRNA cassettes)28.

STAgR kan in principe worden gebruikt voor het genereren van expressievectoren met enkele (1-2 gRNAs), verschillende (3-5 gRNAs) en een aantal van de hoogste aantal expressie cassettes gemeld tot nu toe (6-8 gRNAs)28. Ook is de STAgR die van toepassing zijn voor gRNA reeks, ruggengraat of promotor. Aangezien echter STAgR is voornamelijk gebaseerd op de polymerase-kettingreactie (PCR) en Gibson vergadering, moet gRNAs met hoge reeks overeenkomsten worden gegenereerd met behulp van een alternatieve methode.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ontwerp van STAgR klonen van strategie

  1. Besluiten op hoeveel gRNA cassettes zal worden opgenomen in een expressie vector en in welke volgorde. Bepalen welke initiatiefnemers en gRNA steigers moeten worden gebruikt voor elk van de gRNAs. De gRNAs ontwerpen met behulp van een online hulpmiddel (bijvoorbeeld www.benchling.com).

2. ontwerp van STAgR klonen Primers met overhangen

Opmerking: De volgorde van de protospacer zin van het laatste gRNA en de antisense van de eerste gRNA respectievelijk worden toegevoegd aan de PCR inleidingen gebruikt voor versterking van de ruggengraat van de vector (Figuur 1). De resterende sequenties zijn versterkt uit de strijkers, daarmee verbonden de betekenis en antisense gRNAs in de gewenste volgorde. De eerste tekenreeks stuk wordt versterkt met een voorwaartse primer met de eerste gRNA N20 reeks als een luifel en een omgekeerde primer met de tweede gRNA N20 volgorde (omgekeerde aanvulling) als een overstek. Alle van de volgende stukken worden dienovereenkomstig gegenereerd.

  1. N20 gRNA sequenties toevoegen aan de versterking van de voorwaartse inleidingen voor STAgR DNA tekenreeks zoals overhangt (tabel 1). Zin gRNA sequenties 5' aan de voorwaartse primer "scf-FP" (voor een conventionele steiger) of "sam-FP" (voor een MS2 met steiger) toevoegen. Ontharden van de FP inleidingen aan het schavot/MS2 deel van de respectieve STAgR-tekenreeks (Figuur 1).
  2. De omgekeerde aanvulling N20 gRNA reeks toevoegen aan het omgekeerde primer sequenties. Kies RP inleidingen afhankelijk van de specifieke initiatiefnemers en tekenreeksen gebruikt (hU6-RP, mU6-RP, 7sK-RP, H1-RP).

3. generatie van STAgR klonen van fragmenten

  1. Voor het genereren van de individuele klonen fragmenten voor Gibson montage, door PCRs uit te voeren door het opzetten van 10 µL van high-fidelity (HF) buffer, 1 µL van 10 mM dNTPs, 0,25 µL van overhang-primer (100 µM), 10 ng van de sjabloon (tekenreeks of vector), 0,5 µL HF polymerase van DNA , 1.5 µL van dimethylsulfoxide (DMSO) en H2O zodat een eindvolume van 50 µL toe te voegen.
    Opmerking: De plasmide "STAgR_Neo" als sjabloon gebruiken voor de backbone PCR te nemen de gRNA steiger voor de laatste gRNA, als de SAM Scaffold is gekozen, gebruikt u "STAgR_SAM". Bijvoorbeeld, voor een plasmide STAgR met zes gRNA cassettes zijn zes PCRs nodig, dat vijf met DNA snaren als sjablonen en één met de ruggengraat van de vector als de sjabloon.
  2. Incubeer reacties op een thermocycler met behulp van de volgende voorwaarden: 1 cyclus van 98 ° C voor 1 min 30 s; 38 cycli van 98 ° C voor 10 s, 59 ° C (voor gRNA steiger) / 68 ° C (voor SAM lus) voor 10 s, 72 ° C gedurende 30 s (voor inserts) / 1 min 30 s (voor vectoren); 1 cyclus van 72 ° C gedurende 10 minuten.
  3. 5.5 µL van het PCR-reactie verwijderen, toevoegen van laden kleurstof en analyseren van de versterkte fragmenten op een 1% agarose gel. Belasting een geschikte DNA-ladder voor grootte (100 bp DNA ladder/1 kb DNA ladder) en run de gel in een passende gel actief buffer (b.v., TLE buffer) op 120 V voor 30 min.
  4. Terwijl de gel wordt uitgevoerd, voeg 5 µL van de buffer die is voorzien van het beperkingsenzym en 0,5 µL DpnI (10 eenheden) bij de resterende 44,5 µL PCR reactie en incubeer gedurende 30 minuten tot 1 uur bij 37 ° C.
  5. Uitvoeren van DNA zuivering met behulp van magnetische kralen.
    1. 1.8 µL magnetische kralen per 1 µL van het PCR-product toevoegen en meng door pipetteren omhoog en omlaag. Incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur (RT).
    2. Kralen en DNA-fragmenten van de resterende vloeistof met een magneet te scheiden. Wassen kralen tweemaal met 70% ethanol door de pellet spoelen zonder resuspending volledig.
    3. Verwijder alle ethanol met een pipet en laat de pellet lucht drogen.
    4. Los van de pellet in 15-20 µL H2O door omhoog en omlaag pipetteren en scheiden de kralen van de vloeistof met behulp van een magneet. Het supernatans dat duidelijk overbrengen in een nieuwe buis.
      Opmerking: Als alternatief, kolom gebaseerde reactie schoonmaakoperaties kits kunnen worden gebruikt.
  6. DNA concentraties met een spectrofotometer zoals elders beschreven29bepalen.

4. Gibson vergadering reactie en bacteriële transformatie

Opmerking: De volgende stappen zijn aangepast van Gibson et al. 30.

  1. Een zelfgemaakte Gibson reactie mix of gebruik een commerciële Gibson klonen kit voor te bereiden.
    1. Combineren van 3 mL 1 M Tris (Tris (hydroxymethyl) aminomethane)-HCl bij pH 7.5, 300 µL van 1 M MgCl met 60 µL van 100 mM dGTP (deoxyguanosine-trifosfaat), 60 µL van 100 mM dATP (deoxyadenosine-trifosfaat), 60 µL van 100 mM dTTP (deoxythymidine-trifosfaat), 60 µL van 100 mM dCTP () deoxycytidine trifosfaat), 300 µL van 1 M DTT (dithiothreitol), 1.5 g van PEG-8000 (polyethyleenglycol), 300 µL van 100 mM NAD (nicotinamide adenine dinucleotide) en H2O om te verkrijgen van 6 mL 5 × isothermische reactie buffer toe te voegen.
      Opmerking: Aliquoted buffer kan worden opgeslagen bij-20 ° C gedurende ten minste 12 maanden.
    2. Voor de Gibson vergadering meester Meng, 320 µL van 5 x isothermische reactie buffer combineren met 697 µL van H2O en voeg 3 µL van 10 U/µL T5 exonuclease, 20 µL van 2 U/µL DNA-polymerase en 160 µL van 40 U/µL polymerase van DNA ligase.
      Opmerking: Deze mix kan worden aliquoted en opgeslagen bij-20 ° C gedurende ten minste 12 maanden.
  2. 7.5 µL van vergadering master mix gebruiken met 2,5 µL van donormateriaal en vector. Gebruik een molaire vector verhouding van 1:1, maar niet meer dan 0,2 pmol van DNA in totaal invoegen voor een 2 x STAgR reactie. Voor meer dan 2 gRNA expressie cassettes, gebruiken om een vector te voegen verhouding 1:3, maar overschrijd niet een totaal bedrag van het DNA van 0.5 pmol.
    Opmerking: Alle versterkte gRNA expressie cassettes moeten worden gebruikt in mengsel bedragen. Een plasmide-besturingselement met de identieke hoeveelheid vector maar geen inzetstukken aan besturingselement voor onverteerd sjabloon vector (en/of zelf Afbinding) opnemen.
  3. Incubeer monsters bij 50 ° C voor 45 tot 60 min. winkel monsters op ijs of bij-20 ° C voor latere transformatie.
    Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
  4. Direct Transformeer de helft van de mix in chemisch bevoegde bacteriën.
    1. Ontdooi chemisch bevoegde TOP10 E. coli bacteriën op ijs.
    2. Voeg toe 5 µL van het mengsel van Gibson aan 50 µL van bevoegde bacteriën. Meng zachtjes door flicking de onderkant van de buis. Incubeer op ijs gedurende 30 minuten.
    3. Uitvoeren van een warmte-schok door het plaatsen van de buis in een waterbad van 42 ° C of een warmte blok voor 45 s.
    4. Zet de buizen terug op ijs. Voeg 250 µL van SOC medium voor de bacteriën en laat ze herstellen bij 37 ° C in een schudden incubator voor 30-45 min.
  5. Na herstel, plaat de getransformeerde bacteriën op 1,5% lysogenie Bouillon (LB) agar platen met ampicilline (100 µg / mL) en na een nacht bebroeden bij 37 ° C.

5. het selecteren van STAgR klonen door bacteriële PCR van de kolonie

  1. Voorbereiden op ten minste twee sets van 200 µL PCR reactie buizen (tussen 3 en 24) elke constructie, die worden aangeduid als identiek.
  2. Vul één set met 100 µL LB medium dat 100 µg / mL ampicilline.
  3. Gebruik een steriele Pipetteer tip krassen uit het biologisch materiaal van een bacteriële kolonie en verspreid het op de bodem van de lege 100 µL PCR reactiebuis. Onmiddellijk overdracht de tip om de tweede overeenkomstige reactiebuis met het LB-medium.
  4. Swirl de tip rond zachtjes om enkele van de bacteriën worden overgedragen aan de LB-media en Incubeer bij 37 ° C voor later gebruik.
  5. Instellen van een PCR master mix (10 µL per reactie).
    1. Voor 10 reacties, combineer 10 µL Taq buffer, 2 µL 10 mM dNTPs, 0,5 µL primer (100 µM), 0,5 µL van Taq polymerase en H2O toevoegen aan een volume van 100 µL.
    2. Gebruik de volgende inleidingen: StAgR_seq_fwd2: ACTGGATCCGGTACCAAGG, StAgR_seq_rev: TTACGGTTCCTGGCCTTTTG.
  6. Voeg toe 10 µL van het PCR master mix aan de gelabelde PCR reactie buizen zonder de LB-media.
  7. Incubeer reacties op een thermocycler met behulp van de volgende voorwaarden: 1 cyclus van 94 ° C gedurende 5 minuten, 38 cycli van 94 ° C voor 30 s, 55 ° C gedurende 30 s, 72 ° C gedurende 2 minuten; 1 cyclus van 72 ° C gedurende 10 minuten.
    Opmerking: Rek tijd (72 ° C-stap) moet worden verhoogd met het aantal gRNA expressie cassettes. Berekenen van theoretische omvang van inzetstukken met behulp van tabel 2 en 1 min per 1 kb gebruiken bij 72 ° C.
  8. Voeg laden kleurstof en analyseren van de versterkte fragmenten op een 1% agarose gel. Laden van een geschikte DNA-ladder voor de dimensionering (1kb DNA-Ladder) en stel het in passende gel buffer (bijvoorbeeldTLE Buffer) lopen bij 120 V voor 30 min.
  9. De theoretische omvang van de amplicon met behulp van tabel 2 berekend door optelling van de individuele maten van gebruikte initiatiefnemers, gRNA steigers en aantal N20 sequenties. Identificeren van de resultaten van de PCR van de kolonie, de bacteriële klonen gebaseerd op de grootte van de juiste band en of ze kunnen haven juiste vectoren.
  10. Inoculeer een 2,5 mL overnachting-LB cultuur (met 100 µg/mL ampicilline) met de overeenkomstige 100 µL cultuur, eerder hebt ingesteld. Incubeer bij 37 ° C gedurende 12 uur.
  11. Uittreksel plasmide DNA met behulp van een commerciële plasmide mini kit en31instructies van de fabrikant.
  12. Volgnummer van de plasmiden met behulp van de volgende inleidingen: StAgR_seq_fwd1 (GAGTTAGGGGCGGGACTATG), StAgR_seq_fwd2 (ACTGGATCCGGTACCAAGG) en StAgR_seq_rev (TTACGGTTCCTGGCCTTTTG) door Sanger Sequencing.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Volgens het protocol bij de hand maakt het genereren van aangepaste multiplexing gRNA vectoren haalbaar (Figuur 1). Representatieve resultaten van STAgR benaderingen met behulp van zes verschillende gRNA cassettes zijn afgebeeld in Figuur 2. Figuur 2 A toont een typische uitkomst van de PCRs gebruikt voor het verkrijgen van de STAgR stukken (protocol 3.1-3.3). De zes waarbij (BB, S1-S5) vertegenwoordigen lineaire DNA stukken met de individuele gRNA N20 sequenties op hun doeleinden. De ruggengraat van de plasmide (BB) is nu uitgebreid met de targeting sequenties van gRNA1 en gRNA6 en dus bezit de vereiste overlappingen aan twee andere PCRs (S1 en S5) voor montage van de Gibson (Figuur 2A, tabel 3). Na zuivering kan een DNA-rendement van ten minste 1 µg voor vectoren en inserts worden bereikt.

Na assemblage van Gibson, bacteriële transformatie moet leiden tot bacteriële kolonies van 100 tot 700. Figuur 2 B toont een representatieve analyse van 10 bacteriële kolonies via PCR, volgens een protocol van de STAgR met zes gRNA cassettes van de kolonie. De gelelektroforese van het geeft aan dat drie klonen Toon de grootte van de verwachte amplicon voor volledige montage (tabel 2). Andere klonen waarschijnlijk ontvangen STAgR vectoren met één tot vijf gRNA cassettes, overwegende dat een kloon (Figuur 2B, No.18) leeg is.

figure-results-1
Figuur 1 : Overzicht van STAgR primer ontwerp. Eerste nummer van de gRNA en steigers zijn gekozen, dan gRNA orde en promotor en laatste, welk type van vector moet worden gebruikt. Voor elke gRNA, is een specifieke voorwaartse primer met de gRNA dat targeting op volgorde in zin oriëntatie en het gemeenschappelijk gedeelte van "scf-FP" of "sam-FP" ontworpen. Ook voor het genereren van de individuele omgekeerde primer de corresponderende opeenvolging van de promotor is (RP) gefuseerd met het omgekeerde complement van de N20-volgorde van de volgende gRNA. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-2
Figuur 2 : Representatieve resultaten van STAgR benaderingen met behulp van zes verschillende gRNA cassettes. (A) representatief voorbeeld van een PCR van vijf inserts, alsmede de vector STAgR_Tomato. (B) kolonie PCR van een 6 x STAgR reactie met behulp van de initiatiefnemers van hU6 en mU6, evenals canonieke gRNA en SAM steigers. 22 bacteriële kolonies werden geanalyseerd, waarvan 7 toonde de verwachte band die complete samenstelling aangeeft. Ladder: 1 kb plus, getallen in basenparen (bp). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Voorwaartse primer voor tekenreeks en Vector
scaffold_fwdGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT
SAM_fwdGTTTTAGAGCTAGGCCAACATGAGG
Omgekeerde primer voor tekenreeks en Vector
hU6_revCGGTGTTTCGTCCTTT
mU6_revCAAACAAGGCTTTTCTCCAAGG
hH1_revCTGGGAAAGAGTGGTCTCATACAGA
h7SK_revCCGAGGTACCCAAGCGG

Tabel 1: Primer reeksen voor gRNA steigers en initiatiefnemers.

Maten van initiatiefnemers en steigers.
hU6265 bp
hH1225 bp
mU6316 bp
h7SK245 bp
gRNA steiger83 bp
SAMloop + gRNA steigerwerk143 bp

Tabel 2: Theoretische maten van elke cassette van de expressie voor het berekenen van de kolonie PCR uitkomst.

hU6hH1mU6h7SKSTAgR_NeoSTAgR_tdTomato
gRNA Scf400 bp360 bp451 bp380 bp3722 bp4487 bp
SAM460 bp420 bp511 bp440 bp--

Tabel 3: Maten van initiatiefnemers en steigers.

hU6hH1mU6h7SKSTAgR_NeoSTAgR_tdTomato
gRNA Scf368 bp328 bp419 bp348 bp+74 bp+67 bp
SAM428 bp388 bp479 bp408 bp

Tabel 4: Berekende maten van STAgR stukken na PCR.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor STAgR waardoor het snel en eenvoudig genereren van gRNA expressie plasmiden van verschillende grootte. Dit protocol kan worden gebruikt voor one-step generatie van plasmiden met gRNA, met 2-8 gRNA expressie cassettes (met of zonder twee MS2 RNA-aptamers) in de gRNA expressie vector STAgR_Neo, en het gebruik van menselijke U6, muis U6, menselijke 7sK en menselijke H1 initiatiefnemers28 ,32,33. Als meer dan vier cassettes gewenst zijn, is het aanbevolen om ten minste twee verschillende promotor/steiger typen gebruiken om efficiëntie te verbeteren. Andere vectoren, initiatiefnemers en promotor combinaties, alsmede meer dan 8 gRNA cassettes mogelijk haalbaar echter heeft dit niet getest. Hoewel in onze ervaring de methode betrouwbaar en reproducibly werkt, hebben wij vastgesteld kritische stappen en probleemoplossing, strategieën moet het verwachte resultaat niet onmiddellijk worden uitgevoerd. In onze ervaring sommige stappen zijn cruciaal voor het succes van de aanpak: eerst en vooral is het belangrijk het gebruik van de juiste molaire ratio's van inzetstukken met de backbone van de vector op de Gibson vergadering stap (3:1). Echter we gemerkt dat voor sommige verzamelingen gRNA een 1:1 verhouding van inzetstukken op vector gunstig, is zelfs wanneer het nummer van de cassette gRNA twee bedraagt. Ten tweede, de periode van de Gibson vergadering reactie moet lang genoeg (ten minste 45 min. aanbevolen).

STAgR kan worden gebruikt met een groot aantal wijzigingen. Gericht op sequenties, gRNA kunnen getallen en steigers, initiatiefnemers en vector backbones worden aangepast en vrij gecombineerd. Echter is het zo dat elke combinatie iets andere vereisten kan hebben. In onze ervaring, als gemiddeld of hoog nummers van gRNA cassettes (> 4) zijn gewenst maar niet verkregen onmiddellijk, meestal de snelste manier om dit probleem te wijzigen van de volgorde van de individuele gRNA cassettes in de vector is. Ook het combineren van verschillende gRNA initiatiefnemers en steigers verbetert de efficiency (en dus verlaagt het vereiste aantal kolonie PCRs die moeten worden gescoord) wanneer vele gRNA cassettes zijn gekloond. We vonden dat onjuiste klonen worden gewoonlijk gegenereerd door de spontane conjunctie van herhaalde reeksen tijdens Gibson vergadering. Hoewel dit de doeltreffendheid van de methode aantasten kan, ook hierdoor gelijktijdige opwekking van vectoren met functionele gRNA deelverzamelingen28.

Generatie multiplexing van gRNA vectoren met meer dan één gRNA expressie cassette is gemeld met een aantal verschillende methoden21,22,23,24,25, 26,27. Terwijl sommige in dienst gelijktijdige of opeenvolgende klonen van gRNA paren22,34, afhankelijk anderen van Golden Gate vergadering en verschillende opeenvolgende klonen stappen25,35. Een speciale aanpak is gebruikt door Xie et al., door gebruik te maken van de endogene cellulaire tRNA bewerkingssysteem te snijden van de verschillende gRNAs uit een enkele voorlopercellen transcript36. De advangetage van deze methode is de eis van slechts één promotor; het nadeel is de noodzaak van nieuwe gesynthetiseerd DNA-fragmenten voor elke combinatie van de gRNA. Elke gRNA multiplexing methode heeft voor- en nadelen; STAgR combineert eenvoud met efficiëntie, hoge aantal mogelijke gRNA cassettes met lage kosten.

STAgR (en andere multiplexing systemen) zal wellicht in staat efficiënt (en gelijktijdig) verstoring van meerdere genen in vivo, instrumentale als pionier in zebrafish hersenen28. Een andere toekomstige toepassing van gRNA multiplexing vectoren is de belofte voor het manipuleren van volledige transcriptionele programma's in tegenstelling tot de inductie of onderdrukking van enkele genen. Waarschijnlijk zal deze benaderingen toestaan transformatie cellen en organen op zal een veel hogere mate dan het vandaag mogelijk is.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs zou willen van Prof. Dr. Stephan Beck en Prof. Dr. Jovica Ninkovic bedanken voor hun inbreng, te helpen en te ondersteunen bij de ontwikkeling van de STAgR-methode. Tobias Klötzer, Anna Köferle en Valentin Baumann voor nuttige opmerkingen. Het werk werd ondersteund door DFG (STR 1385/1-1).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Phusion High- Fidelity DNA PolymeraseNEBM0530LPolymerase voor Gibson Master Mix evenals alle PCR's
dNTPsLife TechnologyR0191dNTPs voor alle PCR's
dATPLife TechnologyR0141dNTPs voor Gibson Master Mix
dCTPLife TechnologyR0151dNTPs voor Gibson Master Mix
dGTPLife TechnologyR0161dNTPs voor Gibson Master Mix
dTTPLife TechnologyR0171dNTPs voor Gibson Master Mix
AgaroseVWR443666A
DpnINEBR0176S
AMPure XP BeadsBeckman CoulterA63881voor DNA opruiming
Tris HCLRoth9090.2voor Gibson Master Mix
DTTLife TechnologyR0861voor Gibson Master Mix
PEG 8000VWRRC- 077voor Gibson Master Mix
NADCayman Chemicals Company16077voor Gibson Master Mix
T5 ExonucleaseNEBM0363Svoor Gibson Master Mix
Taq DNA LigaseNEBM0208Svoor Gibson Master Mix
AmpicilineSigmaAldrichPHR1393-1G
DNA Ladder 1 kb PlusThermo ScientificSM0311
Plasmid Mini KitThermo ScientificK0503
Plasmid en Primer SequencesAlle sequences beschikbaar op Figshare (https://goo.gl/UGdc3Q).
EDTAPanReacAppliChem6381-92-6voor TLE Buffer
MgCl2SigmaAldrichM8266voor Gibson Master Mix
Top10 chemisch competente bacteriënThermo ScientificC404003
S.O.C. MediumThermo Scientific15544034
Gist-ExtractSigmaAldrichY1625voor lysogen bouillon (LB Media)
NaClSigmaAldrichS7653voor lysogen bouillon (LB Media)
PeptoneSigmaAldrich91249voor lysogen bouillon (LB Media)
Agar-AgarSigmaAldrich5040voor lysogen bouillon (LB Media)
Taq DNA PolymeraseQuiagen201203

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barrangou, R. Diversity of CRISPR-Cas immune systems and molecular machines. Genome Biol. 16, 247(2015).
  2. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  3. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  4. Pulecio, J., Verma, N., Mejia-Ramirez, E., Huangfu, D., Raya, A. CRISPR/Cas9-Based Engineering of the Epigenome. Cell Stem Cell. 21 (4), 431-447 (2017).
  5. Köferle, A., Stricker, S. H., Beck, S. Brave new epigenomes: the dawn of epigenetic engineering. Genome Med. 7 (1), 59(2015).
  6. Stricker, S. H., Koferle, A., Beck, S. From profiles to function in epigenomics. Nature Reviews Genetics. 18 (1), 51-66 (2017).
  7. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  8. Maeder, M. L., et al. CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes. Nature Methods. 10 (10), 977-979 (2013).
  9. Lekomtsev, S., Aligianni, S., Lapao, A., Burckstummer, T. Efficient generation and reversion of chromosomal translocations using CRISPR/Cas technology. BMC Genomics. 17 (1), 739(2016).
  10. Jiang, J., et al. Induction of site-specific chromosomal translocations in embryonic stem cells by CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 6, 21918(2016).
  11. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
  12. Wang, L., et al. Large genomic fragment deletion and functional gene cassette knock-in via Cas9 protein mediated genome editing in one-cell rodent embryos. Scientific Reports. 5, 17517(2015).
  13. Zhang, L., et al. Large genomic fragment deletions and insertions in mouse using CRISPR/Cas9. PLoS ONE. 10 (3), 0120396(2015).
  14. Shen, B., et al. Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects. Nature Methods. 11 (4), 399-402 (2014).
  15. Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nature Protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).
  16. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  17. Kalhor, R., Mali, P., Church, G. M. Rapidly evolving homing CRISPR barcodes. Nature Methods. 14 (2), 195-200 (2017).
  18. Chavez, A., et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).
  19. Bultmann, S., Stricker, S. H. Entering the post-epigenomic age: back to epigenetics. Open Biology. 8 (3), (2018).
  20. Vora, S., Tuttle, M., Cheng, J., Church, G. Next stop for the CRISPR revolution: RNA guided epigenetic regulators. FEBS Journal. , (2016).
  21. Maddalo, D., et al. In vivo engineering of oncogenic chromosomal rearrangements with the CRISPR/Cas9 system. Nature. 516 (7531), 423-427 (2014).
  22. Nageshwaran, S., et al. CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
  23. Wrighton, K. H., et al. Synthetic biology: Multiplex genome engineering in eukaryotes. Nature Reviews Genetics. 19 (1), 6-7 (2018).
  24. Yan, Q., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering enhanced by Drosha-mediated sgRNA-shRNA structure. Scientific Reports. 6, 38970(2016).
  25. Kabadi, A. M., Ousterout, D. G., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector. Nucleic Acids Research. 42 (19), 147(2014).
  26. Cress, B. F., et al. CRISPathBrick: Modular Combinatorial Assembly of Type II-A CRISPR Arrays for dCas9-Mediated Multiplex Transcriptional Repression in E. coli. ACS Synthetic Biology. 4 (9), 987-1000 (2015).
  27. Port, F., Bullock, S. L. Augmenting CRISPR applications in Drosophila with tRNA-flanked sgRNAs. Nature Methods. 13 (10), 852-854 (2016).
  28. Breunig, C. T., et al. One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR). PLoS ONE. 13 (4), 0196015(2018).
  29. Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. Quantitation of DNA and RNA. CSH Protoc. 2007, (2007).
  30. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods Enzymology. 498, 349-361 (2011).
  31. Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. Molecular cloning : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1982).
  32. Koferle, A., et al. CORALINA: a universal method for the generation of gRNA libraries for CRISPR-based screening. BMC Genomics. 17 (1), 917(2016).
  33. Koferle, A., Stricker, S. H. A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source. Journal of Visualized Experiments. (130), e56264(2017).
  34. Vidigal, J. A., Ventura, A. Rapid and efficient one-step generation of paired gRNA CRISPR-Cas9 libraries. Nature Communications. 6, 8083(2015).
  35. Sakuma, T., Nishikawa, A., Kume, S., Chayama, K., Yamamoto, T. Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/Cas9 vector system. Scientific Reports. 4, 5400(2014).
  36. Xie, K., Minkenberg, B., Yang, Y. Boosting CRISPR/Cas9 multiplex editing capability with the endogenous tRNA-processing system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (11), 3570-3575 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

String Assembly gRNA CloningMultiplex gRNA ExpressionGibson AssemblyCRISPR Cas9 SystemGuide RNA CloningDNA Template ReuseOverhang PrimersColony PCRPlasmid TransformationAgarose Gel Electrophoresis

Related Articles