Dit protocol beschrijft de analyse van fluorescently gelabelde intracellulaire compartimenten in ontluikende gist met behulp van Multi-Color 4D (time-lapse 3D) confocale microscopie. De beeldvormings parameters worden gekozen om adequate signalen vast te leggen en foto schade te beperken. Met aangepaste ImageJ-plug-ins kunnen gelabelde structuren worden bijgehouden en kwantitatief worden geanalyseerd.
Het doel van dit protocol is om te karakteriseren hoe membraan compartimenten vorm en transformeren in levende cellen van ontluikende gist. Veel intracellulaire compartimenten in gist zijn dynamisch, en een volledig begrip van hun eigenschappen vereist timelapse-beeldvorming. Multi-Color 4D confocale fluorescentiemicroscopie is een krachtige methode voor het bijhouden van het gedrag en de samenstelling van een intracellulaire compartiment op een tijdschaal van 5-15 min. een grondige analyse van het compartiment dynamiek vereist de vangst van duizenden optische Secties. Om dit doel te bereiken, worden fotobleaching en fototoxiciteit geminimaliseerd door snel te scannen bij zeer lage Laser stroom, en de pixelafmetingen en Z-stap intervallen worden ingesteld op de grootste waarden die compatibel zijn met het bemonsteren van de afbeelding met volledige resolutie. De resulterende 4D-datasets zijn luidruchtig, maar kunnen worden gladgestreden door deconvolutie. Zelfs met gegevens van hoge kwaliteit is de analyse fase uitdagend omdat intracellulaire structuren vaak talrijk, heterogeen en mobiel zijn. Om aan deze behoefte te voldoen, zijn aangepaste ImageJ-plug-ins geschreven naar array 4D-gegevens op een computerscherm, identificeren van belangen structuren, bewerken van de gegevens om individuele structuren te isoleren, kwantificeren de fluorescentie tijd cursussen en maken films van de geprojecteerde Z-stacks. 4D-films zijn vooral handig voor het onderscheiden van stabiele compartimenten van tijdelijke compartimenten die omkomen door rijping. Dergelijke films kunnen ook worden gebruikt om gebeurtenissen zoals compartiment fusie te karakteriseren en om de effecten van specifieke mutaties of andere verstoringen te testen.
Compartimenten van het endomembraansysteem-systeem zijn in constante flux en hun volledige karakterisering vereist Live-celbeeldvorming. Hier beschreven is een protocol dat 4D (time-lapse 3D) confocale microscopie gebruikt om fluorescently gelabelde compartimenten te visualiseren in ontluikende gisten. De methode werd ontwikkeld om de dynamiek van secretoire compartimenten in Pichia pastoris en Saccharomyces cerevisiae1,2,3te volgen. Dit protocol richt zich op S. cerevisiae, die een niet-gestapelde Golgi heeft waarin de individuele cisternae optisch....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
1. voorbereiding
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Het voorbeeld hier documenten gegeven en kwantificeert de rijping van twee gist Golgi cisternae als gevisualiseerd door Dual-Color 4D confocale microscopie3. Een gist cel bevat op de orde van 10-15 Golgi cisternae, elk van die rijpt over een tijdsverloop van ongeveer 2-4 min. rijping kan worden gevisualiseerd door het taggen van de vroege Golgi marker Vrg4 met GFP en door het taggen van de late Golgi marker Sec7 met een rode fluorescerende eiwitten zoals mCherry of.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
4D confocale beeldvorming van gist organellen vereist zorgvuldige afstemming van meerdere parameters. De belangrijkste zorg is fotobleaching en fototoxiciteit. Een typische 4D-film omvat het verzamelen van duizenden optische secties, zodat de laser verlichting zo laag mogelijk moet worden gehouden. Tandem fluorescerende eiwit Tags kunnen worden gebruikt om het signaal te stimuleren zonder de expressie van het gelabelde eiwit16,17te verhogen. Het maximaliseren van.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dit werk werd ondersteund door NIH Grant R01 GM104010. Bedankt voor de hulp met fluorescentiemicroscopie aan Vytas Bindokas en Christine labno op de geïntegreerde microscopie kern faciliteit, die wordt ondersteund door de door NIH gefinancierde Cancer Center ondersteuning Grant P30 CA014599.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 35 mm glass bottom dishes No. 1.5 | MatTek | P35G-0.170-14-C | Beeldvormingsschalen |
| Concanavalin A poeder | Sigma-Aldrich | C2010 | |
| Trolox | Vector Laboratories | CB-1000 | |
| Leica SP8 confocale microscoop | Leica Microsystems | ||
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscoopsoftware | |
| Huygens Essential software, versie 17.04 | Scientific Volume Imaging | Deconvolutiesoftware | |
| ImageJ | NIH | Beeldverwerkings- en analysesoftware |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken
Toestemming aanvragen