Methodenartikel

qKAT: kwantitatieve Semi-automated te typen van Killer-cel immunoglobuline-achtig Receptor genen

10.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58646

⸱

6 maart 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of Cambridge, 2Department of Physiology, Development and Neuroscience, University of Cambridge, 3Department of Obstetrics and Gynaecology, University of Cambridge School of Medicine, NIHR Cambridge Biomedical Research Centre, 4Centre for Trophoblast Research, University of Cambridge, 5Department of Genetics & Evolution, University of Geneva, 6Royal Papworth Hospital, 7Department of Plant Sciences, University of Cambridge

In dit artikel

Samenvatting

Kwantitatieve killer cel immunoglobuline-achtig receptor (KIR) semi-automatische te typen (qKAT) is een eenvoudige high-throughput en kosteneffectieve methode kopiëren nummer type KIR genen voor hun toepassing in de bevolking en ziekte vereniging studies.

Samenvatting

Killer cel immunoglobuline-achtige receptoren (KIRs) zijn een reeks van remmende en activerend immuun receptoren, natural killer (NK) en T-cellen, gecodeerd door een polymorfe cluster van genen op het chromosoom 19. Hun best gekarakteriseerd liganden zijn de menselijke leukocyten antigeen (HLA) moleculen die zijn gecodeerd in de grote histocompatibility complex (MHC) locus op chromosoom 6. Er is aanzienlijk bewijs dat ze een belangrijke rol in de immuniteit, de voortplanting, en de transplantatie spelen, waardoor het cruciale technieken die nauwkeurig genotype kunnen hebben hen. Echter hoge-sequence homologie, zo goed als allèlique en kopie nummer variatie, maken het moeilijk tot ontwerpmethoden die nauwkeurig kunnen en efficiënt genotype alle KIR genen. Traditionele methoden zijn meestal beperkt in de resolutie van gegevens die zijn verkregen, doorvoer, kosteneffectiviteit en de termijnen voor het instellen en uitvoeren van de experimenten. Beschrijven we een methode genaamd kwantitatieve KIR semi-geautomatiseerde te typen (qKAT), die is een high-throughput multiplex real-time polymerase kettingreactie methode die de gene kopie nummers van alle genen in de KIR locus kunt bepalen. qKAT is een eenvoudige high-throughput methode die hoge resolutie KIR nummer gegevens kopiëren, die verder kan worden gebruikt voor het afleiden van de variaties in het structureel polymorfe haplotypes die omvatten van hen kan bieden. Deze kopie nummer en haplotype gegevens kan goed zijn voor studies over grootschalige ziekte verenigingen, populatie genetica, evenals onderzoek naar expressie en functionele interacties tussen KIR en HLA.

Inleiding

Bij de mens, de moordenaar immunoglobuline-achtig receptor(KIR) locus is toegewezen op de lange arm van chromosoom 19 binnen de leukocyten receptor complex (LRC). Deze locus is ongeveer 150 kb in lengte en omvat 15 KIR genen gerangschikt hoofd-tot-staart. De KIR loci die momenteel bekend zijn zijn KIR2DL1, KIR2DL2/KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1-5, KIR3DL1/KIR3DS1, KIR3DL2-3, en twee pseudogenes, KIR2DP1 en KIR3DP1. De KIR genen coderen voor tweedimensionale (2D) en driedimensionale (3D) domein van de immunoglobuline-achtige receptoren met korte (S; activeren) of lange (L; remmende) cytoplasmatische staarten, die zijn uitgedrukt door natural killer (NK) cellen en deelverzamelingen van T cellen. Kopie nummer variatie tentoongesteld in de KIR locus vormen diverse haplotypes met de inhoud van de variabele gen1. Non-allèlique homologe recombinatie (NAHR), vergemakkelijkt door een nauwe hoofd-tot-staart gene regeling en hoge-sequence homologie, is het mechanisme voorgesteld dat de variabiliteit van de haplotypic wordt belast. Meer dan 100 verschillende haplotypes zijn gemeld in populaties wereldwijd1,,2,,3,4. Alle deze haplotypes kunnen worden onderverdeeld in twee grote groepen: A en B haplotypes. De A-haplotype bevat 7 KIR genen: KIR3DL3, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1en KIR3DL2, die remmende KIR genen en de activerende KIR zijn gen KIR2DS4. Echter tot 70% van Europese oorsprong personen die homozygoot voor KIR haplotype A uitsluitend voeren een vorm van niet-functionele "verwijdering" van KIR2DS45,6. Alle andere KIR gene combinaties vormen groep B haplotypes, met inbegrip van ten minste één van de specifieke genen van KIR KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DL2, en KIR2DL5, en bevatten meestal twee of meer activerende KIR -genen.

HLA klasse I moleculen zijn geïdentificeerd als de liganden voor bepaalde receptoren van inhiberende (KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3en KIR3DL1), activerende receptoren (KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR2DS5, en KIR3DS1), en voor KIR2DL4, die een unieke KIR die bevat een lange cytoplasmatische staarten als andere remmende KIR-receptoren maar heeft ook een positief geladen residu in de buurt van de extracellulaire domein, dat een gemeenschappelijk is functie van andere activerend KIR -receptoren. De combinatie van varianten binnen de KIR genen en de HLA-genen invloeden receptor-ligand interactie die vormen potentiële NK cel reactievermogen in het individuele niveau7,-8. Bewijs van genetische vereniging studies heeft aangegeven dat KIR speelt een rol in virale weerstand (bijvoorbeeld., humaan immunodeficiëntie virus [HIV]9 en hepatitis C virus [HCV]10), het succes van transplantatie 11, het risico op zwangerschap stoornissen en reproductieve succes12,13, de bescherming tegen terugval na Allogene hematopoietische stamcel transplantatie (HSCT)14,15, 16, en het risico van kanker17.

De combinatie van hoge-sequence homologie, allèlique en haplotypic verscheidenheid presenteert uitdagingen in de taak van nauwkeurig genotypering KIR genen. Conventionele methoden typt KIR genen omvatten sequentie-specifieke primer (SSP) polymerase kettingreactie (PCR)18,19,20, reeks-specifieke oligonucleotide probe (SSOP) PCR21, en matrix geassisteerde laser desorptie ionisatie-time van de vlucht de Spectrometrie van de massa (MALDI-TOF MS)22. De nadelen van deze technieken zijn dat ze alleen gedeeltelijke inzicht geven in het genotype van een individu terwijl ook moeizaam om uit te voeren. Volgende-generatie sequencing (NGS) is onlangs de KIR locus specifiek typt u toegepast. Terwijl deze methode zeer krachtig is, kan het duur om uit te voeren, en het is tijdrovend diepgaande analyse en data controles te verrichten.

qKAT is een high-throughput kwantitatieve PCR methode. Terwijl conventionele methoden moeizaam en tijdrovend zijn, deze methode maakt het mogelijk in te voeren bijna 1.000 genomic DNA (gDNA)-monsters vijf dagen en geeft het genotype KIR , evenals de gene exemplaaraantal. qKAT bestaat uit tien multiplex reacties, die elk twee KIR loci richt en één gen van de verwijzing van een vaste exemplaaraantal in het genoom (STAT6) gebruikt voor relatieve kwantificering van het gen KIR kopiëren nummer23. Deze bepaling is met succes gebruikt in studies waarbij grote populatie panelen en ziekte cohorten op infectieziekten zoals HCV, auto-immune aandoeningen zoals type 1 diabetes, en zwangerschap aandoeningen zoals pre-eclampsie, evenals het verstrekken van een genetische onderbouwing aan studies gericht op het begrijpen van de NK-cel functie1,4,24,25,26.

Protocol

1. voorbereiding en Plating uit DNA

  1. De concentratie van de gDNA met behulp van een spectrofotometrische of fluorimetrische instrument nauwkeurig te kwantificeren.
  2. Verdun DNA tot 4 ng/µL op een diep-well 96-wells-plaat. Omvatten ten minste één controlemonster gDNA met een bekende exemplaaraantal en één niet-sjabloon controle.
  3. Centrifugeer de 96-wells-platen bij 450 x g gedurende 2 min.
  4. Elk monster in viervoud op 384-well qPCR platen met behulp van een instrument van liquid handling, afzien, zodat elke goed heeft 10 ng van DNA (2,5 µL per putje). Ten minste tien 384-Wells-platen, één voor elke qKAT reactie voor te bereiden.
  5. Als gDNA is wordt afgezien van meer dan één 96-wells-plaat, voert u een volledige volumes wassen met 2% bleekwater en ultrazuiver water te reinigen van de naalden van de vloeistof handling systeem tussen elke 96-wells-plaat van gDNA monsters.
  6. Het DNA door het broeden van de 384-Wells-platen in een schone omgeving bij kamertemperatuur gedurende ten minste 24 uur drogen.

2. voorbereiding van de Primers en sondes

Opmerking: qKAT bestaat uit tien multiplex reacties. Elke reactie omvat drie primerparen en drie fluorescentie-geëtiketteerden sondes die twee KIR genen en één verwijzing gene specifiek te versterken. De sondes die werden gepubliceerd in Jiang et al.27 werden gewijzigd zodat de oligonucleotides worden nu aangeduid met ATTO kleurstoffen aangezien zij verbeterde fotostabiliteit en lange signaal levensduur bieden. Pre-aliquoted primer combinaties zijn commercieel verkrijgbaar (Zie Tabel van materialen).

  1. Bereiden primer combinaties voor elke reactie volgens de verdunningen gegeven in tabel 1.
  2. Bereiden sonde combinaties voor elke reactie volgens tabel 1. Elke afzonderlijke sonde alvorens de combinatie test.

3. voorbereiding van de Master-Mix

Opmerking De volumes die hieronder vermeld zijn voor het uitvoeren van een qKAT reactie op een set van 10 x 384-Wells-platen.

  1. Ervoor zorgen dat de gDNA monsters op de 384-Wells-platen verzinkt volledig droog. Uitvoeren van alle stappen op het ijs en houden de reagentia gedekt door blootstelling aan licht zoveel mogelijk aangezien de fluorescentie-geëtiketteerden sondes en thermo-lichtgevoelig.
  2. Ontdooi de qPCR buffer, primer en sonde aliquots bij 4 ° C.
  3. Op het ijs, voorbereiden op een master mix 10 x 384-Wells-platen door toevoeging van 18.86 mL ultrazuiver water, 20 mL qPCR buffer en 1.000 µL van vraag primer combinatie 180 µL van vraag sonde combinatie (tabel 2).
  4. De master mix gelijkmatig verdelen over een goed 96-diep bord met behulp van een precisiepipet meerkanaals, pipetting 415 µL in elk putje. Houd deze plaat in een koelbox gedekt door licht.
  5. Met behulp van een instrument van liquid handling, afzien 9,5 µL van de master mix in elk putje van de plaat 384-well met gedroogde gDNA. Afdichting van de plaat met een folie en plaatst u deze onmiddellijk bij 4 ° C. Herhaal dit proces voor de resterende platen, ervoor te zorgen dat de naalden van de vloeistof handling systeem worden gewassen met water tussen elke plaat.
  6. Centrifugeer de 384-Wells-platen bij 450 x g gedurende 3 min en incubeer hen bij 4 ° C's nachts of tussen 6-12 h resuspendeer de DNA en eventuele luchtbellen te verdrijven.

4. qPCR Assay

  1. Na de overnachting incubatie, centrifugeer bij 450 x g gedurende 3 minuten te verdrijven van eventuele resterende luchtbellen.
  2. Voor de toepassing van de automatisering, verbinden de qPCR machine (b.v., LightCycler 480) een microplate-handler (Zie Tabel van materialen). Programma de microplate-handler de platen in de machine van de qPCR van een gekoelde opslag dok dat is beschermd tegen licht plaatsen.
    Opmerking de testen moeten, in theorie, werken op andere qPCR machines met compatibele optische instellingen.
  3. De volgende fietsen gebruiksvoorwaarden: 95 ° C gedurende 5 minuten gevolgd door 40 cycli van 95 ° C voor 15 s en 66 ° C gedurende 50 s, met het verzamelen van de gegevens bij 66 ° C.
  4. Zodra de run voltooid is, hebben de robot verzamelen de plaat van de qPCR machine en plaats deze in het Gooi-dock.

5. na uitvoering analyse

  1. Na versterking, het berekenen van de kwantificering cyclus (Cq) waarden met behulp van de tweede afgeleide maximale methode of de methode van Fit-punten met de software van de qPCR machine (Zie Tabel of Materials), de onderstaande stappen.
  2. Open de software van de qPCR en open het bestand experiment opgeslagen reactie voor één plaat in het tabblad Navigator .
  3. Voor de analyse met behulp van de tweede afgeleide maximale methode, selecteer het tabblad analyse en maken een nieuwe analyse methode Abs Quant/Second derivaat Max.
    1. Selecteer in het venster maken nieuwe analyse analyse type: Abs Quant/Second derivaat Max methode, deelverzameling: alle Samples, programma: amplificatie, naam: Rx-DFO (waarbij x het nummer van de reactie is).
    2. Selecteer Filter kam en kies van VIC/HEX/Yellow555 (533-580). Dit zorgt ervoor dat de verzamelde gegevens voor STAT6 is geselecteerd.
    3. Selecteer kleur compensatie voor VIC/HEX/Yellow555(533-580). Klik op berekenen. Herhaal dit voor Fam (465-510) en Cy5/Cy5.5(618-660). Klik op bestand opslaan.
  4. Voor de analyse met behulp van de methode van Fit-punten, door Abs Quant/Fit punten te selecteren op het tabblad analyse.
    1. Selecteer in het venster maken nieuwe analyse analyse type: Abs Quant/Fit punten methode, deelverzameling: alle Samples, programma: amplificatie, naam: RxF-DFO (waarbij x het nummer van de reactie is).
    2. Selecteer de juiste filters en kleur compensaties voor de STAT6 en elk van de KIR genen (Fam/Cy5). Stel in het tabblad Noiseband de lawaai-band uit te sluiten van de achtergrondgeluiden.
    3. In het tabblad analyse de fit punten ingesteld op 3 en selecteer dat Toon past punten. Klik op berekenen. Klik op bestand opslaan.

6. de uitvoer van de resultaten

  1. In de qPCR-software, open de Navigator tab. Selecteer Resultaten Batch exporteren.
  2. Open de map waarin de bestanden van het experiment worden opgeslagen en de bestanden overbrengen naar de sectie van de rechterkant van het venster. Klik op volgende. Selecteer de naam en de locatie voor het exportbestand.
  3. Selecteer het soort analyse Abs Quant/Second derivaat Max methode of Abs Quant/Fit punten. Klik op volgende. Controleer of de naam van het bestand, de map exporteren en het soort analyse correct zijn en klik op volgende om te beginnen het exportproces.
  4. Wacht totdat het Exporteren Status Ok is. Het scherm gaat automatisch naar de volgende stap. Controleer dat alle geselecteerde bestanden met succes zijn uitgevoerd zodat het aantal bestanden mislukt = 0. Klik op gereed.
  5. Gebruik scripts split_file.pl en roche2sds.pl de geëxporteerde platen gesplitst individuele reacties voor elke plaat.
    Opmerking de scripts worden geleverd op aanvraag/GitHub.

7. Kopieer numerieke berekeningen

  1. Open de kopie nummer analysesoftware (bijvoorbeeld CopyCaller). Selecteer real-time PCR importeren bestand met resultaten en laden van tekstbestanden die zijn gemaakt door roche2sds.pl.
  2. Selecteer analyseren en uitvoeren van de analyse door beide selecteren kalibrator monster met bekende exemplaaraantal of door het selecteren van de meest voorkomende exemplaaraantal. Zie tabel 5 voor de meest voorkomende exemplaaraantal van KIR genen meestal waargenomen in Europese oorsprong populaties.

8.-kwaliteit van de gegevens controleert

  1. R script KIR_CNVdata_analysis_for_Excel_ver020215 gebruiken. R gegevens wilt combineren kopie nummer uit alle platen in een spreadsheet.
    Opmerking de scripts worden geleverd op aanvraag/GitHub.
  2. Controleer opnieuw de onbewerkte gegevens op de kopie nummer-analysesoftware voor monsters die niet aan de bekende koppeling onevenwicht (LD) voor KIR genen (tabel 6 voldoen).

Resultaten

Kopie nummer analyse kan worden uitgevoerd door de bestanden te exporteren naar de kopie nummer analysesoftware, waarmee de voorspelde en geschatte exemplaaraantal op basis van de ΔΔCq-methode.

Het exemplaaraantal kan worden voorspeld dat op basis van de bekende exemplaaraantal van controlemonsters DNA op het bord of door het invoeren van de meest voorkomende gene exemplaaraantal (tabel 5). Figuur 1 toont de resultaten van een plaat voor een reactie die zich richt op KIR2DL4 en KIR3DS1, alsmede het referentie-gen STAT6. De meest voorkomende exemplaaraantal voor KIR2DL4, een kader-gen in de KIR locus, is twee exemplaren, terwijl de meest voorkomende exemplaaraantal voor KIR3DS1, een activerende gen, is één exemplaar. De resultaten in de figuur blijkt de PCR versterking percelen waargenomen op de qPCR-software en de kopie numerieke gegevens gegenereerd uit de qPCR-gegevens. Zoals aangetoond, is de bepaling onderscheid kunnen maken tussen 0, 1, 2, 3 en 4 KIR gene moleculen. De kopie nummer analysesoftware maakt ook een bezichtiging van de verdeling van het exemplaaraantal over de plaat als een cirkeldiagram of een staafdiagram. De werkzaamheid van de kopie nummer voorspelling is lager voor monsters met een hoger exemplaaraantal.

De kwaliteit van alle materialen gebruikt in de reacties, gDNA, buffer, inleidingen en sondes, kan invloed hebben op de juistheid van de verkregen resultaten. Verschil in resultaten is echter waarschijnlijk worden veroorzaakt als gevolg van de variatie in de concentratie van DNA in een plaat. De zuiverheid van de geëxtraheerde gDNA, die kan worden gemeten met behulp van de 260/280 en 260/230 ratio's, kunnen ook een effect hebben op de kwaliteit. Een 260/280 ratio van 1,8-2 en een 260/230 verhouding van 2-2.2 zijn wenselijk. De concentraties van een ongelijke bereik van DNA in een plaat kunnen leiden tot een hoge variabiliteit in de drempel-cyclus (Ct) tussen monsters en blijven in het bereik van de geschatte exemplaaraantal. De resultaten in Figuur 2 blijkt het effect dat de verschillen tussen de Ct -waarden over een plaat kan hebben op de nauwkeurigheid in de voorspelling van het exemplaaraantal. De rode lijn geeft het bereik van de geschatte exemplaaraantal voor een monster en, idealiter, moet zo dicht mogelijk bij integer als mogelijk.

Het aantal gegevens kopiëren, eenmaal geanalyseerd, kunnen worden geëxporteerd als een spreadsheet-bestand in een 96-Wells-indeling. Hebben we een R-script (beschikbaar op aanvraag) gebruikt om de kopie nummer gegevens van alle 10 platen die worden uitgevoerd als een set in een spreadsheet te combineren. Gepubliceerde gegevens over KIRs van voornamelijk Europese oorsprong populaties kan de voorspelling van LD-regels die bestaan tussen verschillende genen in de KIR complexe1. Deze voorspellingen worden gebruikt voor downstream controles kunnen verrichten op de kopie nummer resultaten (tabel 6). Monsters die niet aan de voorspelde LD tussen de genen voldoen kunnen ongewone polymorfisme of haplotypic structurele variaties bevatten. Een stroomdiagram met een beschrijving van het protocol is afgebeeld in Figuur 3.

Een tool genaamd KIR Haplotype id (http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/) werd ontwikkeld om de toerekening van de haplotypes van de gegevensset. De beschuldiging werkt op basis van een lijst van referentie haplotypes waargenomen in een bevolking van Europese oorsprong1. Echter voorziet het hulpprogramma ook in een aangepaste set referentie haplotypes moet worden gebruikt. Drie afzonderlijke bestanden worden gegenereerd; het eerste bestand bevat alle haplotype combinaties voor een steekproef, het tweede bestand bevat een bijgesneden lijst van de haplotypes-combinaties die de hoogste gecombineerde frequenties hebben en het derde bestand bevat de monsters die haplotypes kunnen niet worden toegewezen. Niet-toewijzing van haplotypes kan worden gebruikt als een indicator van roman haplotypes.

figure-results-1
Figuur 1: representatieve resultaten van een plaat voor reactie nummer 5. (A) dit paneel toont amplificatie Staanplaatsen. (B) dit paneel toont kopiëren aantal percelen. (C) dit paneel geeft de kopie nummer verdeling. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-2
Figuur 2: representatieve resultaten van een plaat met een variabele DNA-concentratie voor reactie nummer 5. (A) dit paneel toont amplificatie Staanplaatsen. (B) dit paneel toont kopiëren aantal percelen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-3
Figuur 3: stroomdiagram van het protocol qKAT. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

AssayGenenVoorwaartse PrimersConcentratie (nM)Omgekeerde inleidingenConcentratie (nM)SondesConcentratie (nM)
No 13DP1A4F250A5R250P4a150
2DL 22DL2F4400C3R2600P5b150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
Nr 22DS2A4F400A6R400P4a200
2DL 3D1F400D1R400P9150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
No 33DL 3A8F500A8R500P4a150
2DS4Del2DS4Del2502DS4R2250P5b150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
No 43DL1e4B1F250B1R125P4b150
3DL1e9D4F250D4R2500P9150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
Nr 53DS1B2F250B1R250P4b150
2DL 4C1F200C1R200P5b - 2DL 4150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
No 62DL 1B3F500B3R125P4b150
2DP1D3F250D3R500P9150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
Nr 72DS1B4F500B4R250P4b150
2DL 5D2F500D2R500P9150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
No 82DS3B5F250B5R250P4b150
3DL2e9D4F250D5R125P9150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
No 93DL2e4A1F200A1R200P4a150
2DS4FL2DS4FL2502DS4R2500P5b150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
No 102DS5B6F2200B6R3200P4b150
2DS4C5F250C5R250P5b150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150

Tabel 1: combinatie en concentratie van inleidingen en sondes gebruikt in elke qKAT reactie 27 .

ReactiePrimer Aliquots (µL)Sonde Aliquots (µL)
R13DP1A4FA5R2DL2F4C3R2WATERSTAT6FSTAT6RP4AP5BPSTAT6
2DL 21001001602402008080606060
R22DS2A2FA6RD1FD1RWATERSTAT6FSTAT6RP4AP9PSTAT6
2DL 31601601601601608080806060
Opmerking: moet 20 µL minder water in de MasterMix
R33DL 3A8F A8FBA8R2DS4DELF2DS4R2WATERSTAT6FSTAT6RP4AP5BPSTAT6
2DS4DEL100 1002001001002008080606060
R43DL1E4B1FB1RD4FD4R2WATERSTAT6FSTAT6RP4BP9PSTAT6
3DL1E9100501002003508080606060
R53DS1B2FB1RC1FC1RWATERSTAT6FSTAT6RP4BP5B - 2L 4PSTAT6
2DL 410010080804408080606060
R62DL 1B3FB3RD3FD3RWATERSTAT6FSTAT6RP4BP9PSTAT6
2DP1200501002002508080606060
R72DS1B4FB4RD2FD2RWATERSTAT6FSTAT6RP4BP9PSTAT6
2DL 52001002002001008080606060
R82DS3B5FB5RD4FD5RWATERSTAT6FSTAT6RP4BP9PSTAT6
3DL2E9100100100504508080606060
R93DL2E4A1FA1R2DS4WTF2DS4R2WATERSTAT6FSTAT6RP4AP5BPSTAT6
2DS4WT80801002003408080606060
R102DS5B6F2B6R3C5FC5RWATERSTAT6FSTAT6RP4BP5BPSTAT6
2DS4TOTAL80801001004408080606060

Tabel 2: Volumes (µL) van 100 µM stamoplossingen van de primer/sonde aanbrengen van de primer en sonde combinatie aliquots.

NaamRichting5´ wijzigingwijziging van de 3´Volgorde (5' →3')LengteTMGC %ExonPositie
P4aZinFAMBHQ-1TCATCCTGC
AATGTTGGT
CAGATGTCA		276044,44425-451
P4bAntisenseFAMBHQ-1AACAGAACC
GTAGCATCT
GTAGGTCCC
T		2862504576-603
P5bZinATTO647NBHQ-2AACATTCCA
GGCCGACT
TTCCTCTG		2560525828-852
P5b - 2DL 4ZinATTO647NBHQ-2AACATTCCA
GGCCGACT
TCCCTCTG		2561565828-852
P9ZinATTO647NBHQ-2CCCTTCTCA
GAGGCCCA
AGACACC		246062,591246-1269
PSTAT6ATTO550BHQ-2CTGATTCCT
CCATGAGCA
TGCAGCTT		266250

Tabel 3: lijst van sondes gebruikt in qKAT 1, 27. de fluorescente kleurstoffen gebruikt aan het einde 5' van de oligo sondes P5b, P5b - 2 DL 4, P9 en PSTAT6 waren aangepast aan ATTO kleurstoffen.

GenInleidingenRichtingVolgorde (5´-3´)LengteTMGC %ExonPositieAmplicon (bp)Allelen kunnen worden gemist
3DL2e4A1FVoorwaartsGCCCCTGCTGAA
ATCAGG		185261,14399-4161793DL 2 * 008, * 021, * 027, * 038.
A1ROmgekeerdeCTGCAAGGACAG
GCATCAA		195352,6559-5773DL 2 * 048
3DP1A4FVoorwaartsGTCCCCTGGTGA
AATCAGA		194952,64398-416112Geen
A5ROmgekeerdeGTGAGGCGCAAA
GTGTCA		185255,6492-509Geen
2DS2A2FVoorwaartsGTCGCCTGGTGA
AATCAGA		194952,64398-416111Geen
A6ROmgekeerdeTGAGGTGCAAAG
TGTCCTTAT		215142,9488-508Geen
3DL 3A8FaVoorwaartsGTGAAATCGGGA
GAGACG		185055,64406-423139Geen
A8FbVoorwaartsGGTGAAATCAGG
AGAGACG		195052,6405-4233DL 3 * 054, 3DL 3 * 00905.
A8ROmgekeerdeAGTTGACCTGGG
AACCCG		185161,1526-543Geen
3DL1e4B1FVoorwaartsCATCGGTCCCAT
GATGCT		185155,64549-566853DL 1 * 00505, 3DL 1 * 006, 3DL 1 * 054, 3DL 1 * 086, 3DL 1 * 089
C1sOmgekeerdeGGGAGCTGACAA
CTGATAGG		205255614-6333DL 1 * 00502
3DS1B2FVoorwaartsCATCGGTTCCAT
GATGCG		185155,64549-566853DS1 * 047; 3DL 1 * 054 kan opnemen.
C1sOmgekeerdeGGGAGCTGACAA
CTGATAGG		205255614-633Geen
2DL 1B3FVoorwaartsTTCTCCATCAGT
CGCATGAC		2052504544-563962DL 1 * 020, 2DL 1 * 028
B3ROmgekeerdeGTCACTGGGAGC
TGACAC		185061,1622-6392DL 1 * 023, 2DL 1 * 029, 2DL 1 * 030
2DS1B4FVoorwaartsTCTCCATCAGTC
GCATGAA		195147.44545-563962DS1 * 001
B4ROmgekeerdeGGTCACTGGGAG
CTGAC		174964,7624-640Geen
2DS3B5FVoorwaartsCTCCATCGGTCG
CATGAG		185361,14546-56396Geen
B5ROmgekeerdeGGGTCACTGGGA
GCTGAA		185161,1624-641Geen
2DS5B6F2VoorwaartsAGAGAGGGGACG
TTTAACC		195052,64475-493173Geen
B6R3OmgekeerdeTCCAGAGGGTCA
CTGGGC		185366,7630-6472DS5 * 003
2DL 4C1FVoorwaartsGCAGTGCCCAGC
ATCAAT		185255,65808-82583Geen
C1ROmgekeerdeCCGAAGCATCTG
TAGGTCT		195252,6872-8902DL 4 * 018, 2DL 4 * 019
2DL 22DL2F4VoorwaartsGAGGTGGAGGCC
CATGAAT		195257,95778-7961512DL 2 * 009; 782G gewijzigd naar A.
C3R2OmgekeerdeTCGAGTTTGACC
ACTCGTAT		205145909-928Geen
2DS4C5FVoorwaartsTCCCTGCAGTGC
GCAGC		175770,65803-819120Geen
C5ROmgekeerdeTTGACCACTCGT
AGGGAGC		195257,9904-9222DS4 * 013
2DS4Del2DS4DelVoorwaartsCCTTGTCCTGCA
GCTCCAT		195457,95750-768203Geen
2DS4R2OmgekeerdeTGACGGAAACAA
GCAGTGGA		205350933-952Geen
2DS4FL2DS4FLVoorwaartsCCGGAGCTCCTA
TGACATG		195357,95744-762209Geen
2DS4R2OmgekeerdeTGACGGAAACAA
GCAGTGGA		205350933-952Geen
2DL 3D1FVoorwaartsAGACCCTCAGGA
GGTGA		174858,891180-1196156Geen
D1ROmgekeerdeCAGGAGACAACT
TTGGATCA		2050451316-13352DL 3 * 010, 2DL 3 * 017, 2DL 3 * 01801 en 2DL 3 * 01802
2DL 5D2FVoorwaartsCACTGCGTTTTC
ACACAGAC		20525091214-12331202DL5B * 011 en 2DL5B * 020
D2ROmgekeerdeGGCAGGAGACAA
TGATCTT		194947.41315-1333Geen
2DP1D3FVoorwaartsCCTCAGGAGGTG
ACATACGT		20535591184-1203121Geen
D3ROmgekeerdeTTGGAAGTTCCG
TGTACACT		2050451285-1304Geen
3DL1e9D4FVoorwaartsCACAGTTGGATC
ACTGCGT		195252,691203-1221933DL 1 * 061, 3DL 1 * 068
D4R2OmgekeerdeCCGTGTACAAGA
TGGTATCTGTA		235343,51273-12953DL 1 * 05901, 3DL 1 * 05902, 3DL 1 * 060, 3DL 1 * 061, 3DL 1 * 064, 3DL 1 * 065, 3DL 1 * 094N, 3DL 1 * 098
3DL2e9D4FVoorwaartsCACAGTTGGATC
ACTGCGT		195252,691203-1221156Geen
D5ROmgekeerdeGACCTGACTGTG
GTGCTCG		195463,21340-1358Geen
STAT6STAT6FVoorwaartsCCAGATGCCTAC
CATGGTGC		205460129
STAT6ROmgekeerdeCCATCTGCACAG
ACCACTCC		205460

Tabel 4: sequenties van de inleidingen gebruikt in qKAT 1, 27.

KIR gen 3DL 32DS22DL 22DL 32DP12DL 13DP12DL 43DL 1
EX9		3DL 1
EX9		3DS12DL 52DS32DS52DS12DS4
Totaal		2DS4
FL		2DS4
DEL		3DL 2
EX4		3DL 2
EX9
Meest voorkomende exemplaaraantal21122222221111121122

Tabel 5: Meest voorkomende exemplaaraantal voor KIR genen vaak waargenomen in Europese oorsprong monsters.

Koppeling onevenwicht regels voor qKAT op basis van de Europese bevolkingKopie nummer check
1 KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 en KIR3DL2 zijn kader genen aanwezig zijn op beide haplotypes. KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 en KIR3DL2 = 2
2 KIR2DS2 en KIR2DL2 zijn in LD met elkaar 2DS2=2 DL 2
3 KIR2DL2 en KIR2DL3 zijn allelen van hetzelfde gen 2 DL 2+2 DL 3= 2
4 KIR2DP1 en KIR2DL1 zijn in LD met elkaar 2DP1=2 DL 1
5Exon 4 van KIR3DL1 en KIR3DL2 is gelijk aan exon 9 van KIR3DL1 en KIR3DL2 respectievelijk. 3DL1ex4=3DL1ex9 en 3DL2ex4=3DL2ex9
6 KIR3DL1 en KIR3DS1 zijn allelen 3 DL 1+3DS1= 2
7 KIR2DS3 en KIR2DS5 zijn in LD met KIR2DL5 2DS3+2DS5=2 DL 5
8 KIR3DS1 en KIR2DS1 zijn in LD 3DS1=2DS1
9Aanwezigheid van KIR2DS1 en KIR2DS4TOsten is uitsluiten op een haplotype 2DS1+2DS4TOTAL= 2
10 KIR2DS4FL en KIR2DS4del zijn varianten van KIR2DS4TOTAL 2DS4FL+2DS4DEL=2DS4TOTAL

Tabel 6: koppeling onevenwicht tussen KIR genen vaak waargenomen in Europese oorsprong populaties kunnen worden gebruikt voor het controleren van het aantal gegevens kopiëren 1,27.

Discussie

We beschreven een nieuwe semi-automatische high-throughput methode, genaamd qKAT, dat vergemakkelijkt het nummer typen van het exemplaar van KIR genen. De methode is een verbetering ten opzichte conventionele methoden zoals SSP-PCR, die laag-doorvoer en kunnen alleen wijzen op de aanwezigheid of afwezigheid van deze zeer polymorfe genen.

De juistheid van de verkregen kopie aantal gegevens is afhankelijk van meerdere factoren, met inbegrip van de kwaliteit en concentratie-uniformiteit van de gDNA monsters en de kwaliteit van de reagentia. De kwaliteit en nauwkeurigheid van de gDNA monsters over een plaat zijn uitermate belangrijk, aangezien verschillen in concentratie over de plaat in fouten in de berekening van het exemplaaraantal resulteren kunnen. Aangezien de testen zijn gevalideerd met behulp van Europese oorsprong sample sets, vereisen gegevens van cohorten uit andere delen van de wereld meer grondige controles. Dit is om ervoor te zorgen dat instanties van allel dropout of aspecifieke primer/sonde bindende kopie nummer variatie niet worden geïnterpreteerd.

Terwijl de tests werden ontworpen en geoptimaliseerd voor het uitvoeren als high-throughput, kunnen ze worden gewijzigd voor het uitvoeren van minder monsters. De metriek van het vertrouwen in de kopie nummer analysesoftware wordt beïnvloed als minder monsters te analyseren, maar dit kan worden verbeterd als besturingselement genomic DNA-monsters met een bekende KIR gene exemplaaraantal zijn opgenomen op de plaat en extra monster wordt gerepliceerd zijn opgenomen.

Voor laboratoria zonder vloeistof/plaat-handling-robots, master mix kan worden afgezien van elke gebruik van meerkanaals pipetten en platen handmatig in het qPCR-instrument kunnen worden geladen.

Het voornaamste doel achter de ontwikkeling van qKAT was om een eenvoudige, hoge-doorvoer, met een hoge resolutie en kosteneffectieve methode om genotype KIRs voor ziekte vereniging studies. Dit werd met succes bereikt aangezien qKAT is werkzaam bij het onderzoeken van de rol van KIR in verschillende grote ziekte vereniging studies, met inbegrip van een aantal infectieziekten, auto-immune voorwaarden en zwangerschap stoornissen4, 24 , 25 , 26.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Het project kreeg financiële steun van de medische Raad voor onderzoek (MRC), de European Research Council (ERC) kader van de Europese Unie Horizon 2020 onderzoek en innovatie programma (grant overeenkomst nr. 695551) en het National Institute of Health (NIH) Cambridge Biomedische Research Centre en NIH onderzoek bloed en transplantatie Research Unit (NIHR BTRU) in het gebied van orgaandonatie en -transplantatie aan de Universiteit van Cambridge en in partnerschap met de NHS bloed en transplantatie (NHSBT). De standpunten zijn die van de auteurs, en niet noodzakelijkerwijs die van de NHS, de NIHR, het ministerie van volksgezondheid of de NHSBT.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
REAGENTS
OligonucleotidesSigmaCustom orderSEQUENCES: Vermeld in Tabel 4
Probes gelabeld met ATTO-kleurstoffenSigmaCustom orderSEQUENCES: Vermeld in Tabel 3
SensiFAST Probe No-ROX KitBiolineBIO-86020−
MilliQ water−−−
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
APPARAtuur
Centrifuge met een draaiende emmer rotorEppendorf (of gelijkwaardig)Eppendorf 5810R of gelijkwaardig systeem
NanoDropThermo ScientificND-2000
OF
QuBit FluorometerLife TechnologiesQ33216
Matrix HydraThermo Scientific109611
LightCycler 480 II Instrument 384-wellRoche05015243001
Twister II Microplate Handler met MéCour Thermal Plate Stacker (MéCour)Caliper Life Sciences204135
Vortex mixerBiosanBS-010201-AAA
Eenkanaals pipetten (volumebereik: 0,5–10 µL, 2–20 µL, 20–200 µL, 200–1.000 µL; 1-10 mL)Gilson (of gelijkwaardig)F144801, F123600, F123615, F123602, F161201
RNase- en DNase-vrije pipettentips gefilterd (10 µL, 20 µL, 200 µL, 1.000 µL, 10 mL)Starlab (of gelijkwaardig)S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001
StarTub PS Reagent Reservoir, 55 mLSTARLABE2310-1010
50 mL Centrifuge TubeSTARLABE1450-0200
96-well deep well plateFisher Scientific12194162
LC480 384 Multi-well platesRoche04729749001
LightCycler 480 Sealing FoilRoche04729757001
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
SOFTWARE
Roche LightCycler 480 Software v1.5
Applied Biosystems CopyCaller Software v2.1https://www.thermofisher.com/nl/nl/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html
KIR haplotype identifierhttp://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/

Referenties

  1. Jiang, W., et al. Copy number variation leads to considerable diversity for B but not A haplotypes of the human KIR genes encoding NK cell receptors. Genome Research. 22, 1845-1854 (2012).
  2. Nemat-Gorgani, N., et al. Different Selected Mechanisms Attenuated the Inhibitory Interaction of KIR2DL1 with C2 + HLA-C in Two Indigenous Human Populations in Southern Africa. The Journal of Immunology. 200, 2640-2655 (2018).
  3. Norman, P. J., et al. Co-evolution of human leukocyte antigen (HLA) class I ligands with killer-cell immunoglobulin-like receptors (KIR) in a genetically diverse population of sub-Saharan Africans. PLoS Genetics. 9, e1003938(2013).
  4. Nakimuli, A., et al. Killer cell immunoglobulin-like receptor (KIR) genes and their HLA-C ligands in a Ugandan population. Immunogenetics. 65, 765-775 (2013).
  5. Bontadini, A., et al. Distribution of killer cell immunoglobin-like receptors genes in the Italian Caucasian population. Journal of Translational Medicine. 4, 1-9 (2006).
  6. Graef, T., et al. KIR2DS4 is a product of gene conversion with KIR3DL2 that introduced specificity for HLA-A*11 while diminishing avidity for HLA-C. The Journal of Experimental Medicine. 206, 2557-2572 (2009).
  7. Béziat, V., Hilton, H. G., Norman, P. J., Traherne, J. A. Deciphering the killer-cell immunoglobulin-like receptor system at super-resolution for natural killer and T-cell biology. Immunology. 150, 248-264 (2017).
  8. Blokhuis, J. H., et al. KIR2DS5 allotypes that recognize the C2 epitope of HLA-C are common among Africans and absent from Europeans. Immunity, Inflammation and Disease. 5, 461-468 (2017).
  9. Martin, M. P., et al. Epistatic interaction between KIR3DS1 and HLA-B delays the progression to AIDS. Nature Genetics. 31, 429-434 (2002).
  10. Khakoo, S. I., et al. HLA and NK cell inhibitory receptor genes in resolving hepatitis C virus infection. Science. 305, 872-874 (2004).
  11. van Bergen, J., et al. KIR-ligand mismatches are associated with reduced long-term graft survival in HLA-compatible kidney transplantation. American Journal of Transplantation. 11, 1959-1964 (2011).
  12. Hiby, S. E., et al. Association of maternal killer - cell immunoglobulin-like receptors and parental HLA - C genotypes with recurrent miscarriage. Human Reproduction. 23, 972-976 (2008).
  13. Nakimuli, A., et al. A KIR B centromeric region present in Africans but not Europeans protects pregnant women from pre-eclampsia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112, 845-850 (2015).
  14. van Bergen, J., et al. HLA reduces killer cell Ig-like receptor expression level and frequency in a humanized mouse model. The Journal of Immunology. 190, 2880-2885 (2013).
  15. Bachanova, V., et al. Donor KIR B Genotype Improves Progression-Free Survival of Non-Hodgkin Lymphoma Patients Receiving Unrelated Donor Transplantation. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22, 1602-1607 (2016).
  16. Cooley, S., et al. Donor selection for natural killer cell receptor genes leads to superior survival after unrelated transplantation for acute myelogenous leukemia. Blood. 116, 2411-2419 (2010).
  17. Barani, S., Khademi, B., Ashouri, E., Ghaderi, A. KIR2DS1, 2DS5, 3DS1 and KIR2DL5 are associated with the risk of head and neck squamous cell carcinoma in Iranians. Human Immunology. 79, 218-223 (2018).
  18. Vilches, C., Castaño, J., Gómez-Lozano, N., Estefanía, E. Facilitation of KIR genotyping by a PCR-SSP method that amplifies short DNA fragments. Tissue Antigens. 70, 415-422 (2007).
  19. Ashouri, E., Ghaderi, A., Reed, E. F., Rajalingam, R. A novel duplex SSP-PCR typing method for KIR gene profiling. Tissue Antigens. 74, 62-67 (2009).
  20. Martin, M. P., Carrington, M. KIR locus polymorphisms: genotyping and disease association analysis. Methods in Molecular Biology. , 49-64 (2008).
  21. Crum, K. A., Logue, S. E., Curran, M. D., Middleton, D. Development of a PCR-SSOP approach capable of defining the natural killer cell inhibitory receptor (KIR) gene sequence repertoires. Tissue Antigens. 56, 313-326 (2000).
  22. Houtchens, K. A., et al. High-throughput killer cell immunoglobulin-like receptor genotyping by MALDI-TOF mass spectrometry with discovery of novel alleles. Immunogenetics. 59, 525-537 (2007).
  23. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25, 402-408 (2001).
  24. Traherne, J. A., et al. KIR haplotypes are associated with late-onset type 1 diabetes in European-American families. Genes and Immunity. 17, 8-12 (2016).
  25. Hydes, T. J., et al. The interaction of genetic determinants in the outcome of HCV infection: Evidence for discrete immunological pathways. Tissue Antigens. 86, 267-275 (2015).
  26. Dunphy, S. E., et al. 2DL1, 2DL2 and 2DL3 all contribute to KIR phenotype variability on human NK cells. Genes and Immunity. 16, 301-310 (2015).
  27. Jiang, W., et al. qKAT: A high-throughput qPCR method for KIR gene copy number and haplotype determination. Genome Medicine. 8, 1-11 (2016).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

KIR genotyperingqKAT methodereal time PCRkopie aantalanalysemultiplexreactiesHLA interactieNK celreceptorenpopulatiegeneticaziekteassociatie

Gerelateerde artikelen