Bloedplaatjes gebaseerde detectie van stikstofmonoxide in bloed door het meten van VASP fosforylatie

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om het potentiële gebruik van bloedplaatjes als een hooggevoelige stikstofmonoxide sensor in bloed. Het beschrijft eerste bloedplaatjes voorbereiding en het gebruik van nitriet en gedeoxygeneerd rode bloedcellen als stikstofmonoxide generatoren.

Samenvatting

Bloedplaatjes zijn de bloedbestanddelen die verantwoordelijk zijn voor een goede bloedstolling. Hun functie is sterk gereguleerd door verschillende trajecten. Een van de meest potente vasoactieve agenten, stikstofmonoxide (NO), kan ook fungeren als een krachtige remmer van aggregatie van de bloedplaatjes. Direct is geen detectie in bloed zeer uitdagend vanwege haar hoge reactiviteit met cel-vrij hemoglobine geen half-life naar de milliseconde bereik te beperken. Op dit moment geen wijzigingen na interventies zijn slechts geraamd op basis van gemeten wijzigingen nitriet en nitraat (leden van de nitraat-nitriet-NO metabolische weg). Echter precieze, deze metingen zijn lastig te interpreteren vis een vis werkelijke geen veranderingen, als gevolg van de natuurlijk hoge basislijn nitriet en nitraat niveaus die verschillende ordes van grootte hoger dan verwachte wijzigingen van geen zelf. Daarom is de ontwikkeling van directe en eenvoudige methoden die het mogelijk een maken te detecteren NO direct allang. Dit protocol adressen een potentiële gebruik van bloedplaatjes als een hooggevoelige geen sensor in bloed. Het beschrijft eerste platelet rich plasma (PRP) en gewassen bloedplaatjes preparaten en het gebruik van nitriet en gedeoxygeneerd rode bloedcellen als geen generatoren. Fosforylering van VASP op serine 239 (P-VASP^Ser239) wordt gebruikt voor het detecteren van de aanwezigheid van nr. Het feit dat VASP eiwit sterk in bloedplaatjes uitgedrukt wordt en dat het snel is phosphorylated als er geen aanwezig leidt tot een unieke kans om dit traject kunt direct geen aanwezigheid in het bloed.

Inleiding

Bloedplaatjes zijn kleine schijf-vormige cel fragmenten afgeleid van megakaryocytes, die cruciaal zijn voor de bloedstolling. De bloedstolling cascade wordt geïnitieerd door verschillende biologische actieve moleculen (zoals collageen of ADP), vrijgegeven na de verwonding van vasculaire muur. Het bloed bloedstolling proces kan worden gewijzigd, onder verschillende effectoren door stikstofmonoxide (NO). Nee, natuurlijk geproduceerd door cellen van zoogdieren, is een van de meest veelzijdige fysiologische signalen. Het fungeert als een krachtige vaatverwijdende, neurotransmitter en immune modulator, een paar van de vele functies te noemen. In de bloedbaan, helpt niet ook om het reguleren van de omvang van de bloedstolling door remming van de aggregatie van de bloedplaatjes. Een van de meest waarschijnlijke bronnen voor NO in de bloedbaan is nitriet, een anorganische ion dat is getoond om te dienen als een voorloper van nr. Reactie met rode bloedcellen (RBC), nitriet wordt verminderd op Nee en deoxyHb is geoxideerd tot methemoglobine (metHb)¹. NO verlost van RBC is vasoactieve en veroorzaakt vasorelaxation². Dit nitriet vermindering traject is een alternatief geen generatie traject, optreden samen met en als aanvulling op de klassieke geen generatie pad door endothelial stikstofoxide synthase bij hypoxische voorwaarden.

Bloedplaatjes zelf zijn niet kundig voor nitriet in NO verminderen maar zijn zeer gevoelig voor haar aanwezigheid. In intact Trombocyten, niet in de nanomolar bereik vergroot cGMP (EG₅₀ = 10 nM) en fosforylering van VASP (EG₅₀ = 0,5 nM)³. Daarom, bloedplaatjes kunnen dienen als een uitstekende sensor van nitriet reductie tegen RBC en geen introductie in bloed. Er zijn verschillende methoden die direct van de omvang van de activatie van de bloedplaatjes - zoals aggregometry en thromboelastography (TEG meten kunnen)^4,5. Echter, deze methoden vereisen dure gespecialiseerde instrumentatie en vrij grote hoeveelheden materiaal. Het is ook mogelijk om gebeurtenissen te controleren downstream, na Nee wordt vrijgelaten uit de RBC, met behulp van de wijzigingen in bloedplaatjes oppervlakte-proteïne expressie – zoals de P-selectine⁶. Nee is ook bekend om de hoeveelheid cGMP in de bloedplaatjes⁷te verhogen. Wij vroeger cGMP geen introductie in bloed te controleren na de nitriet verkleining door gedeoxygeneerd RBC⁸. Dit bleek een zeer gevoelige methode; echter cGMP is een kortstondige molecule en de detectie omvat uitgebreide arbeid. Een andere mogelijkheid, zoals beschreven in het voorgestelde protocol, maakt gebruik van fosforylering van de phospho van vaatverwijdende-gestimuleerd (VASP)-eiwit op de aanwezigheid van NO in het bloed. VASP is een substraat van proteïne kinase G activering, die op de interactie met NO t/m de sGC/cGMP traject⁹is phosphorylated. Detecteerbare VASP fosforylatie treedt op bij zeer lage NO concentraties, ertoe dat bloedplaatjes een zeer gevoelige detector van geen aanwezigheid in het bloed leiden kunnen. VASP is sterk uitgedrukt in bloedplaatjes, maar niet in andere cellen van het bloed, waardoor de gebeurtenissen waarbij bloedplaatjes¹⁰selectief te volgen.

Het hoofddoel van dit protocol is te beschrijven de methode gedetailleerd voor de detectie van geen vrijgave in volbloed zijn interactie met bloedplaatjes via toezicht VASP fosforylatie^11,12. De beschreven methode maakt de vroege ontdekking van lage geen concentraties - theoretisch in het bereik van nanomolar, waardoor dit protocol gevoeliger dan cGMP bepaling, als gevolg van het gebruik van standaard westelijke vlek technieken haalbaar in meeste laboratorium Instellingen.

Protocol

Opmerking: Bloedmonsters werden verkregen NIH bloedbank (IRB protocol goedgekeurd: 99-CC-0168).

1. bloed monster voorbereiding

Opmerking: Om te voorkomen dat bloedplaatjes activering, tekenen bloed langzaam en meng zachtjes met citraat door het omkeren van de buis meerdere malen.

1. Platelet-rich plasma (PRP) voorbereiding
   1. Tekenen van 30-50 mL bloed met behulp van een 20 G of grotere diameter naald en toevoegen in een buis met Natriumcitraat (3,8%) in een 1:9 verhouding of zure citraat dextrose (ACD) (66,6 mM citroenzuur, 85 mM Trinatriumcitraat citraat, 111 mM glucose, pH 4.5) in een verhouding van 1:6.
   2. Aliquot 5 mL vers verzameld volbloed in lege 15 mL conische buizen. Centrifugeer volbloed bij 120 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
   3. Zorgvuldig verzamelen het supernatant met de bloedplaatjes (platelet-rich plasma, PRP) van het bovenste gedeelte door een kunststof overdracht pipet.
      Opmerking: PRP uit stap 1.1.3 is klaar voor gebruik in proeven, of voor verdere verwerking te bereiden gewassen bloedplaatjes. De zachte pellet verkregen na centrifugeren (stap 1.1.2) rode bloedcellen en witte bloedcellen bevat en verder kan worden gezuiverd om gewassen rode bloedcellen (RBC) verkrijgen — zie stap 1.3. Het experiment moet worden afgewerkt binnen 2 uur na het trekken van bloed. Bij het verzamelen van PRP (bezinken), te voorkomen dat de collectie van buffy coat-bevattende leukocyten verzameld op de PRP/RBC-interface.
2. Gewassen bloedplaatjes voorbereiding (optioneel)
   1. Centrifuge verzameld PRP bij 400 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en houden de bloedplaatjes pellets.
   2. Voorzichtig wassen de korrels door toevoeging van 5 mL van CGS buffer (120 mM NaCl, 12.9 mM Trinatriumcitraat citraat en 30 mM glucose, pH 6,5) en centrifuge bij 400 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
   3. Resuspendeer de bloedplaatjes pellets met 3 mL gemodificeerde Tyrode buffer (134 mM NaCl, 0,34 mM NaH₂PO₄, 2.9 mM KCl, 12 mM NaHCO₃, 20 mM HEPES, 1 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂, 10 mM glucose pH 7.4).
   4. Verdun de bloedplaatjes (1:100 — als bijvoorbeeld 10 µL van bloedplaatjes in 990 µL van Rees-Ecker oplossing) met Rees Ecker-oplossing en graaf van hemocytometer.
   5. De dichtheid van bloedplaatjes tot 3 x 10⁸ cellen/mL aanpassen door het toevoegen van Tyrode buffer.
   6. Incubeer de bloedplaatjes schorsing bij 37 ° C gedurende 1 uur voordat het experiment.
      Opmerking: Gewassen bloedplaatjes zijn stabiel gedurende 5-8 uur bij 37 ° C.
3. Voorbereiding van gewassen rode bloedcellen (RBC)
   1. Centrifugeer na de collectie, de zachte pellet verkregen in stap 1.1.3 bij 2.500 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
   2. Verwijder het supernatant en wassen van de RBC pellet met 5 mL PBS door centrifugeren bij 2.500 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal deze stap voor 3 keer.
   3. Negeren van de PBS en gebruik gewassen RBC voor verdere experimenten.

2. deoxygenering

1. Voeg vervolgens 1 mL van het mengsel van PRP (bereid in stap 1.1.4. of 1.2.4.) en RBC (bereid in stap 1.3.) op de gewenste hematocriet in een polypropyleen fles met een rubberstop gesloten. Bijvoorbeeld 20% hematocriet, voeg toe 200 µL van RBC tot 800 µL van PRP.
   Opmerking: Voorgesteld hematocrits zijn van 0% tot 40%. Gebruik geen een glazen fles of kolf zoals bloedplaatjes aan glazen oppervlak houden.
2. Plaats de naald verbonden met helium gastank in de gesloten fles en controleer de gas uitlaat door het invoegen van een naald 26 G (Figuur 1).
3. Langzaam krul de fles bij kamertemperatuur.
   Opmerking: Hij gas naar bubble via bloedpreparaten niet toegestaan. Langzame gasstroom beter voor deze procedure is, en buitensporig snelle hij gasstroom leidt tot verhoogde hemolyse. De meest efficiënte gasstroom moet worden bepaald door het proces, zoals het is sterk afhankelijk van de geometrie van de experimentele opstelling.
4. Periodiek de deoxygenering proces te volgen door het meten van de druk met gedeeltelijke zuurstof (pO₂) met behulp van een co oximeter.
   Opmerking: In onze handen, 10 min van deoxygenering dalingen pO₂ tot 25 mmHg die vereist is voor de vermindering van de nitriet door RBC. voortzetting van de deoxygenering verder verminderen pO₂ tot 10 mmHg; het leidde echter tot verhoogde hemolyse en stijgingen van de cel-vrije hemoglobine (Figuur 2).

3. rode bloedcellen nitriet vermindering

1. Voeg 1 mL PBS (pH 7.4) in 0.0345 g NaNO₂ om 500 mM stockoplossing van nitriet. Verdun 500 mM NaNO₂ tot 250 µM NaNO₂ (25 x) door seriële verdunning in PBS (pH 7.4).
2. Met behulp van een microsyringe, injecteren nitriet (40 µL) door middel van het septum in het gedeoxygeneerd monster van PRP en RBC om de eindconcentraties van 10 µM in totaal 1 mL van het monster.
   Opmerking: In dit experiment is de eindconcentraties van nitriet gebruikt 10 µM.
3. Incubeer het monster bij 37 ° C gedurende 10 minuten of langer.
   Opmerking: De precieze duur van incubatie van de RBC aanpassen met nitriet die nodig zijn voor de vermindering van de maximale nitriet voor verschillende aard van de dierproeven.
4. Verwijder de stop en de pipet 1 mL van het monster in de buis van een microcentrifuge.
5. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
6. Pipetteer 300 µL van de bloedplaatjes schorsing van het bovenste gedeelte van het supernatant en meng met ACD (pH 6,5) in een verhouding van 1:9. Gooi de RBC-pellet.
7. Centrifugeer de bloedplaatjes schorsing bij 500 x g gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur.
8. Voeg 80 µL van ijskoude lysis buffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris, 0,5% NP-40, pH 7.4) met proteaseinhibitor cocktail III (1:500) aan de bloedplaatjes pellets.

4. westelijke bevlekken van VASP

1. Het laden van 15 µg van het eiwit van elk monster naar 2 aparte 10% SDS-pagina gelen.
   Opmerking: Harde strippen buffer, waarin b-mercaptoethanol, verwijderen P-VASP^Ser239 en VASP antilichamen niet uit het membraan; Daarom moet P-VASP ^Ser239 en VASP worden uitgevoerd afzonderlijk.
2. De gels op 120 V voor 1,30 h en overdracht aan het membraan van het nitrocellulose uitvoeren.
3. Blok niet-specifieke binding met 5% non-fat droge melk.
4. Incubeer het membraan met P-VASP^Ser239 (1:500), VASP (1:1, 000) en GAPDH (1:1, 000) voor overnachting bij 4 ° C.
5. Incubeer horseradish peroxidase (HRP) secundair antilichaam met het membraan gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur.
6. Het membraan met een machine imager bloot en kwantificeren van de dichtheid van de band met behulp van ImageJ.

Resultaten

Veneuze bloedmonsters hebben pO₂ waarden tussen 50-80 mmHg. Deoxygenering van helium vermindert snel pO₂ tot 25 mmHg binnen 10 min. verhoogde deoxygenering tijd iets verder daalt pO₂. Meer tijd voor deoxygenering leidt echter ook tot aanzienlijk hogere niveaus van cel-vrije hemoglobine (bepaald door co Oximeter, visueel gezien op Figuur 2 als steeds meer rode verkleuring van plasma) (Figuur 2A

Discussie

Aangezien de bloedplaatjes zijn gemakkelijk geactiveerd, zachte behandeling van bloedplaatjes-bevattende monsters is vereist. Snelle pipetteren en krachtig schudden moet worden vermeden. Bloedplaatjes remmers zoals prostacyclin ("BGA"₂) kunnen worden gebruikt om te voorkomen dat bloedplaatjes activering; Nochtans, kan dit sommige signaalroutes binnen de bloedplaatjes beïnvloeden. Voor de bereiding van bloedplaatjes pellets, we ACD toevoegen aan de bloedplaatjes schorsingen en gebruiken van lage snelheid centri...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Tri-natriumcitraat	Voorraad door NIH bloedbank
Citroenzuur	Voorraad door NIH bloedbank
Glucose	Sigma	G7528-250G
NaCl; natriumchloride	Sigma	S-7653 1kg
NaH2PO4; natriumfosfaat monobasisch, monohydraat	Mallinckrodt Chemical	7892-04
KCl; kaliumchloride	Mallinckrodt Chemical	6858
NaHCO3; natriumbicarbonaat	Mallinckrodt Chemical	7412-12
HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[-ethaansulfonzuur]	Sigma	H3375-500g
MgCl2 (1 M); magnesiumchloride	Quality Biology	351-033-721
CaCl2; calciumchloride	Sigma	C5080-500G
Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy flessen	Nalgene	2089-0001
Rode septumstopper NO.29	Fisherbrand	FB57877
NaNO2-; natriumnitriet	Sigma	S2252-500G
TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethaan	Sigma	T8524-250G
NP-40; 4-Nonylfenyl-polyethyleenglycol	Sigma	74385-1L
Protease inhibitor cocktail set III	Calbiochem	539134
Phosfo-VASP (Ser239) antilichaam	Cell signaling technology	3114
VASP antilichaam	Cell signaling technology	3112
GAPDH (14C10) Konijn mAb	Cell signaling technology	2118
2-mercaptoethanol	Sigma	M-6250-10ml
Peroxidase AffiniPure Geit Anti-Konijn IgG (H+L)	Jackson Immuno Research Laboratories	111-035-003
Clarity Western ECL Substraat	BIO-RAD	1705060-200ml
CO-oximeter (ABL 90 flex)	Radiometer