Methodenartikel

Stabiele DNA motieven, 1D en 2D nanostructuren opgebouwd uit kleine cirkelvormige DNA-moleculen

DOI:

10.3791/58744

⸱

12 april 2019

 ,  , 
1State Key Laboratory of Coordination Chemistry, School of Chemistry and Chemical Engineering, Nanjing University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor T4 afbinding en denatureren pagina zuivering van kleine cirkelvormige DNA moleculen, gloeien en inheemse pagina analyse van circulaire tegels-, montage- en AFM beeldvorming van 1D en 2D DNA nanostructuren, evenals agarose gel elektroforese en centrifugeren zuivering van eindige DNA nanostructuren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor synthese van kleine cirkelvormige DNA moleculen, gloeien van circulaire DNA motieven, en de bouw van 1D en 2D DNA nanostructuren. Decennia, wordt de snelle ontwikkeling van DNA nanotechnologie toegeschreven aan het gebruik van de ANI van de lineaire als het uitgangsmateriaal. Bijvoorbeeld, staat de tegel DAO (dubbel crossover, antiparallel, vreemd half-draais) bekend als een bouwsteen voor bouw van 2D DNA roosters; de structuur van de kern van DAO bestaat uit twee lineaire single-stranded (ss) oligonucleotides, zoals twee touwen maken een rechterhand granny knoop. Hierin, een nieuw soort DNA tegels genaamd cDAO (gekoppelde DAO) zijn gebouwd met behulp van een kleine cirkelvormige ss-DNA van c64nt of c84nt (circulaire 64 of 84 nucleotiden) als onderdeel van de steiger en verschillende lineaire ss-Ani als het nietje strengen. Perfecte 1D en 2D nanostructuren zijn samengesteld uit cDAO tegels: oneindige nanowires, nanobuisjes, nanospirals en nanoribbons; en eindige nano-rechthoeken. Gedetailleerde protocollen worden beschreven: 1) voorbereiding door T4 ligase en zuivering door denaturering van de pagina (polyacrylamide gelelektroforese) van kleine cirkelvormige oligonucleotides, 2) gloeien van stabiele cirkelvormige tegels, gevolgd door inheemse pagina-analyse, 3) monteren van oneindige 1D nanowires, nanorings, nanospirals, oneindige 2D roosters van nanotubes en nanoribbons en eindige 2D nano-rechthoeken, gevolgd door de AFM (Atomic Force microscopie) imaging. De methode is eenvoudig, robuust en betaalbaar voor de meeste labs.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA-moleculen zijn gebruikt om te bouwen van allerlei nanostructuren decennia. Typische motieven omvatten DAE (dubbele crossover, antiparallel, zelfs half-draais) en DAO tegels1,2,3, star tegels4,5,6,7, single gestrand (ss) tegels8,9,10, en DNA origami11,12,13. Deze DNA motieven en roosters zijn samengesteld uit lineaire ss-Ani. Onlangs, anderen en we hebben het gebruik van circulaire ss-oligonucleotides gemeld als steigers bouwen motieven, nanotubes 1D en 2D roosters14,15,16,17. Door het invoegen van een Holliday junction (HJ)18,19,20,21 in het midden van c64nt, kunnen een paar van twee gekoppelde DAO tegels gevormde17. Dit nieuwe cDAO motief en derivaten daarvan zijn stabiel en stijf genoeg te monteren 2D DNA roosters maximaal 3 × 5 µm2. In deze paper gebruiken we een term voor "circulaire tile", die is gedefinieerd als een stabiele complexe DNA-molecule met de geconstrueerd met een cirkelvormige steiger en andere lineaire nietjes van ss-oligonucleotides, en een andere term voor "lineaire tile", die is opgebouwd uit een volledige reeks van lineaire SS-oligonucleotides.

Dit protocol laat zien hoe de bouw van vijf soorten DNA nanostructuren met kleine cirkelvormige DNA moleculen als steigers: 1) oneindige nanowires van 1 D c64nt en c84nt, 2) een oneindige 2D cDAO-c64nt-O en cDAO-c64nt-E (-O vertegenwoordigt een oneven aantal 5 half-draais en -E vertegenwoordigt een even getal van 4 half-draais) roosters, 3) oneindige 2D cDAO-c84nt-O en cDAO-c84nt-E roosters, 4) eindig 2D 5 × 6 cDAO-c64nt-O en 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O rechthoeken, 5) oneindige 1 D acDAO-c64nt-E nanorings en nanospirals (Zie Figuur 3-5 voor de schematische tekeningen en beelden van de bovenstaande vijf soorten DNA nanostructuren). De 1D-c64nt en c84nt-nanowires zijn samengesteld uit elke steiger van het c64nt en c84nt respectievelijk twee lineaire nietjes is gekoppeld. Elke ronde tegel van de cDAO-c64nt, acDAO-c64nt, cDAO-c74nt of cDAO-c84nt is respectievelijk van de overeenkomstige steiger of c64nt, c74nt, c84nt met vier lineaire nietjes gegloeid. De oneindige 2D roosters zijn samengesteld uit hetzelfde soort twee cirkelvormige tegels met verschillende reeksen. De twee eindige 2D rechthoek roosters zijn samengesteld uit twee sets van 32 circulaire sub stenen respectievelijk. Om geld te besparen, wordt slechts één-sequenced c64nt, c74nt en c84nt gebruikt als de respectieve steiger terwijl verschillende overhangen worden gebruikt om te ontharden de 32 cDAO-c64nt, 12 cDAO-c74nt en 20 cDAO-c84nt circulaire sub tegels respectievelijk in sub tegel onthardende eerst, vervolgens Meng de overeenkomstige 32 circulaire sub tegels en toepassing van het tweede lattice gloeien stap om te assembleren de eindige 5 × 6 cDAO-c64nt-O en 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O roosters, respectievelijk. Zeker, anders sequenced circulaire steigers worden aangenomen om te verzamelen van een verscheidenheid van eindige grootte nanostructuren, maar het kost meer geld en arbeid. De oneindige 1D acDAO-c64nt-E nanorings en nanospirals zijn uit één-sequenced asymmetrische acDAO-c64nt-tegels met lineaire Connecties van een even aantal 4 half-draais gegloeid. Er zijn twee benaderingen te monteren van oneindige 2D roosters van circulaire tegels van cDAO-c64nt en cDAO-c84nt, die respectievelijk door de intertile afstanden uit een even aantal 4 en een oneven aantal 5 half-beurten worden onderscheiden. De voormalige vereist alle tegels worden uitgelijnd identiek; de laatste vereist afwisseling van de gezichten van twee naburige tegels langs de spiraalvormige assen. Als de tegel rigide en vlakke, zoals cDAO-c64nt is, beide benaderingen zal het genereren van vlakke nanoribbons; Als de tegel is gebogen naar één richting, zoals cDAO-c84nt, de intertile aansluiting van een even aantal 4 halve bochten genereert nanobuisjes, overwegende dat de intertile aansluiting van een oneven aantal 5 halve bochten zal produceren vlakke nanoribbons als gevolg van de afschaffing van kromming-vooringenomen groei door alternatieve uitlijning van gebogen tegels. De succesvolle vergadering van 1D en 2D DNA nanostructuren van circulaire tegels geeft verschillende voordelen van deze nieuwe aanpak: stabiliteit en stevigheid van circulaire tegels over lineaire tegels, chirale tegels voor montage van asymmetrische nanostructuren zoals afgedwongen nanorings en nanoribbons, nieuwe visies op het begrip van de mechanica van het DNA en moleculaire structuren, enz.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. bereiding van de ANI van de circulaire

  1. Gebruik alle lineaire Ani geboden door commerciële bedrijven direct zonder verdere zuivering.
  2. Centrifugeer de DNA-monsters bij 5.000 × g gedurende 5 min voor het verzamelen van alle DNA-pellets op de bodem van de buizen. Het toevoegen van een passende hoeveelheid TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) te ontbinden van het DNA.
  3. Meten van de concentratie van "a" ng/µL voor elke oplossing van de ss-DNA met behulp van een micro UV-spectrometer op 260 nm. "A" ng/µL converteren naar "b" µM na b = een × 10-3 / (molecuulgewicht van het DNA onderdeel). De hoeveelheid TE oplossing voor het maken van een 10 µM DNA stamoplossing aanpassen.
  4. T4 DNA ligase gebruiken om verbinding te maken met de uiteinden van het 3' en 5' 5'-phosphorylated lineaire DNA sjablonen ( Figuur 1) van c64nt, c74nt en c84nt voorzien van commerciële bedrijven rechtstreeks.
  5. Meng de 5'-phosphorylated lineaire bundel van DNA (3,5 µM) en de bijbehorende splint bundel van DNA (4.5 µM) in 80 µL TE buffer in een 200 µL PCR reageerbuis15. Incubeer de buis in een open thermo fles gevuld met 95 ° C water. Het warme water tot kamertemperatuur (25 ° C) afkoelen voor ongeveer 2-3 uur onder de lab-sfeer.
  6. Voeg 10 µL van 10 x T4 buffer (660 mM Tris-HCl, 66 mM MgCl2, 100 mM DTT, 1 mM ATP) en 10 µL van T4 ligase (300 U/µL) aan het mengsel tot een eindvolume van 100 µL. het mengsel in een thermocycler Incubeer gedurende 16 uur bij 16 ° C.
    Opmerking: De bovenstaande DNA concentraties en het volume van de reactie van ~ 100 µL zijn geoptimaliseerd voor de hoge afbinding efficiëntie en het hoge rendement van juiste oligo-monomeer cyclisatie. Twee of meer buizen van afbinding reacties in de zelfde tijd volgens de proefopzet worden uitgevoerd. Een alternatieve incubatie procedure voor afbinding vervangt stap 1.6 is 4 uur bij 25 ° C.
  7. Na de incubatie, inactivering van de T4 ligase in 95 ° C water voor 5 minminutes. Vervolgens de buis overbrengen in een waterbad van ijs en incubeer gedurende 5 minuten afkoelen.
  8. Voeg 10 µL van 10 x Exonuclease ik buffer en 10 µL van Exonuclease ik (5 U/µL) aan het mengsel gehard en Incubeer de buis bij 37 ° C in een waterbad voor 30 min te selectief verteren de resterende lineaire ANI's en de circularized Ani intact laten.
  9. Een 10% denaturering pagina gel voor te bereiden.
    1. Draag rubberen handschoenen en bril bij de voorbereiding van het gel van de pagina in de zuurkast. Voeg 6.67 mL van 30% (g/v) oplossing van acrylamide/bisacrylamide (19:1), 2 mL 10 x TAE· Mg buffer (40 mM Tris, 40 mM HAc, 1 mM EDTA, pH 8.0, 12.5 mM Mg(Ac)2), 8,4 g ureum (7 M) en gedeïoniseerd water tot een eindvolume van 20 mL in een centrifugebuis 40 mL.
      Let op: De oplossing van de acrylamide/bisacrylamide oplossing (19:1) 30% (g/v) is giftig.
    2. Voeg 20 µL van tetramethylethylenediamine (TEMED) en 100 µL van ammoniumnitraat persulfate (APS, 10% w/v) tot de 40 mL tube voor overdracht de gel-oplossing voor de Elektroforese van het systeem onmiddellijk. Een 1.5 mm dik en 10-well kam invoegen. Minstens 20 min wachten voor de oplossing van de gel is gestold.
    3. Instellen van een constante spanning van 80 V voor een gel van 85 × 80 × 1.5 mm3 (breedte × hoogte × dikte). 1 x TAE· toevoegen De buffer van de mg aan de Elektroforese van het systeem en prerun de gel voor 20 min 10 V/cm.
  10. Zet de PCR-test-buis van stap 1.8 in 95 ° C water gedurende 5 minuten aan de inactivering van Exonuclease ik. Vervolgens de buis overbrengen in een waterbad van ijs en incubeer gedurende een ander 5 min.
  11. Voeg 20 µL van formamide in de buis tot een eindvolume van 140 µL en meng de oplossing. De oplossing voor 7-9 denatureren pagina gel putjes even met 16-20 µL voor elke gel goed verdelen. Meng 2 µL van het laden van de kleurstof (0.05% bromophenol blauw, 0.05% xyleen cyanol FF, 60% glycerol, 10 mM Tris-HCl, 60 mM EDTA, pH 7,6) met 8 µL van de corresponderende lineaire DNA van de voorloper (10 µM) en spuit het mengsel bij een afzonderlijke bron voor verwijzing.
    Opmerking: De toevoeging van formamide is te verhogen van de dichtheid van het laden oplossing voor het zinken naar de bodem van de pagina gel goed en ook om zich te distantiëren van sommige dubbele strandde DNA residuen.
  12. Voer de gel voor ongeveer 2 h 10 V/cm en stoppen wanneer xyleen cyanol FF op de positie van de 2/3 van de glasplaat met het blote oog is.
  13. Draag rubberen handschoenen en bril om huiden en ogen te beschermen. Neem de gel uit de glasplaat. Plaats de gel op een fluorescerende TLC (dunne laag chromatografie) plaat. De gel doelbandbreedtes afgesneden door een scheermesje zo precies als schaduw door UV-bestraling (Figuur 2).
    Let op: Het UV-licht is schadelijk voor de ogen en huiden.
    Opmerking: Onder UV bestraling bij 254 nm DNA zal absorberen het licht en werpen een schaduw op de TLC-plaat. De circulaire DNA liep iets langzamer dan de overeenkomstige voorloper lineaire DNA. Sommige onverteerd lineaire Ani en ongewenste circulaire ANI in kleine hoeveelheden die de schaduw doel band omringen zal vervuilen de circulaire DNA als ze verzameld worden.
  14. Breng de gel bands in een tube van 2,0 mL microcentrifuge. Droge lucht of klap drogen de gel bands en vervolgens Prak de gels tot een pasta met een spatel of de afgeplatte roerstaaf. Zorg ervoor dat de gel heeft is volledig verpletterd in een pasta, die essentieel zijn voor het hoge rendement van circulaire DNA. Voeg twee keer van de gel volume gedeïoniseerd water in de buis en schud de buis bij kamertemperatuur 's nachts.
  15. Filtreer het mengsel voor het verzamelen van het supernatant in een tube van 2,0 mL microcentrifuge. Eventuele resterende DNA herstellen door spoelen met kleine hoeveelheid gedeïoniseerd water en filter opnieuw te combineren het supernatant.
  16. Pak het eluent met gelijke volume van n-butanol. Herhaal deze procedure totdat het waterige volume is teruggebracht tot ongeveer 200 µL.
  17. Voeg 500 µL van absolute ethanol (−20 ° C) en 20 µL van 3 M NaOAc (pH 5.1) aan het mengsel voor DNA neerslag. Opslaan van de buis op −20 ° C gedurende 30 minuten.
  18. Centrifugeer de buis bij 12.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 ° C, de vloeistof wordt weggeworpen. De resterende DNA neerslag is ongeveer 100 µL in de buis.
  19. Voeg 600 µL van 75% ethanol (−20 ° C) aan de buis en sla het op −20 ° C gedurende 30 minuten. Centrifugeer bij 12.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 ° C, verwijder dan het supernatant. De resterende DNA neerslag is ongeveer 100 µL oplossing in de buis opnieuw. Herhaal de procedure twee keer.
  20. Na de laatste centrifugeren, verwijder het supernatant zoveel mogelijk. Droog de resten met een vacuüm concentrator.
  21. Winkel de gezuiverde circulaire DNA in de buis bij −20 ° C.
  22. Resuspendeer de circulaire DNA in TE buffer te maken van een 10 µM circulaire DNA stamoplossing volgens stap 1.3 wanneer nodig.

2. gloeien van montage oplossingen

  1. Voorbereiden op elke tegel of nanostructural vergadering oplossing te zijn voor c64bp, c84bp, HJ-c64nt, aHJ-c64nt, HJ-c84nt, tHJ-c84nt, cDAO-c64nt, acDAO-c64nt, cDAO-c84nt, c64nt, c84nt en acDAO-c64nt-E met een ontworpen set van lineaire en circulaire ANI's één-pot gloeien.
    1. Voor elke vergadering oplossing, Meng 2 µL van 10 x TAE· Mg buffer, 1 µL van elk DNA-stockoplossing van een verzameling van lineaire en circulaire strengen in gelijke molaire ratio's, en extra TE buffer in een reageerbuis van 200 µL PCR tot een uiteindelijke concentratie van elk onderdeel op 0,5 µM en een eindvolume van 20 µL. Anneal de oplossing van de vergadering in een Thermo fles van 95 ° C tot 25 ° C meer dan 48 uur.
  2. Voorbereiden op elke vergadering oplossing van 2D oneindige roosters van cDAO-c64nt-E, cDAO-c64nt-O, cDAO-c84nt-E en cDAO-c84nt-O met een ontworpen set van lineaire en circulaire ANI in twee stappen gloeien.
    1. Bereid elke voorloper sub tegel montage oplossing door het mengen van 2 µL van 10 x TAE· Mg buffer, 1 µL van elk DNA-stockoplossing van een verzameling van lineaire en circulaire strengen in gelijke molaire verhoudingen, en extra TE buffer in een reageerbuis van 200 µL PCR een eindconcentratie van 0,5 µM voor elk onderdeel en een eindvolume van 20 µL. Anneal in de eerste sub tegel onthardende stap, elke voorloper sub tegel oplossing in een PCR thermocycler methode een snelle-lineaire koeling van 95 ° C tot 25 ° C meer dan 2,5 h.
    2. Bereid de oplossing van elke vergadering van de bovenstaande vier oneindige roosters door het mengen van 10 µL van elk van de twee bijbehorende sub tegel oplossingen samen voor een eindconcentratie van 0,25 µM voor elk onderdeel. Anneal in het tweede lattice gloeien stap, het 20 µL mengsel in een PCR thermocycler met een langzame koeling methode van verblijf bij 50 ° C voor 2 h en afkoeling met een snelheid van 0,1 ° C per 5 minuten tot 20 ° C, ongeveer 24 uur in totaal.
      Opmerking: Twee parallelle experimenten kunnen worden uitgevoerd gelijktijdig of later in de tweede onthardende stap voor elk 2D oneindige lattice.
  3. Voorbereiden op montage oplossingen van twee vergaderingen van de eindige rechthoek van 5 × 6 cDAO-c64nt-O en 5 × 6 cDAO-c74 & c84nt-O in twee stappen gloeien.
    1. Bereid elke voorloper sub tegel montage oplossing door het mengen van 1 µL van 10 x TAE· Mg buffer, 0,5 µL van elk DNA-stockoplossing van een verzameling van lineaire en circulaire strengen in gelijke molaire verhoudingen, en extra TE buffer in een reageerbuis van 200 µL PCR een eindconcentratie van 0,5 µM voor elk onderdeel en een eindvolume van 10 µL. Anneal in de eerste onthardende stap, elke voorloper sub tegel oplossing in een PCR thermocycler methode een snelle-lineaire koeling van 95 ° C tot 25 ° C meer dan 2,5 h.
    2. Bereid elke eindige rechthoek rooster montage oplossing door het mengen van 32 x (2 µL van elke oplossing sub tegel) samen in een reageerbuis van 200 µL PCR om een eindconcentratie van ~ 15 nM voor elke sub tegel en een eindvolume van 64 µL. Anneal in de tweede onthardende stap, het 64 µL mengsel in een PCR thermocycler met een langzame koeling methode van verblijf bij 50 ° C voor 2 h en afkoeling tegen een tarief van 0,1 ° C per 5 minuten tot 20 ° C, ongeveer 24 uur in totaal.
      Opmerking: Vijf parallelle experimenten kunnen worden uitgevoerd gelijktijdig of later in de tweede onthardende stap voor elk samenstel van eindige rechthoek.

3. inheemse pagina-analyse

  1. Bereiden van een 10% native pagina volgende stap 1.9 met uitzondering van de ureum-component.
  2. Voor controlemonsters van c64bp en c84bp, voeg 2 µL van elke vergadering oplossing en 1 µL van het laden van de kleurstof aan 3 µL van TE buffer als besturingselementen afzonderlijk. Voor elk van de andere vergaderingen vermeld in Figuur 3, voeg 1 µL van elke vergadering oplossing en 1 µL van het laden van de kleurstof aan 4 µL van TE buffer.
  3. Elk van de bovenstaande oplossingen voor een gel goed te injecteren. Voeg 5 µL van DNA marker (25-500 bp) bij een afzonderlijke bron voor verwijzing.
  4. Stel de gel voor ongeveer 4 uur op 10 V/cm in een waterbad van ijs. De xyleen cyanol FF zal opraken van de glasplaat.
  5. Draag rubberen handschoenen en bril om huiden en ogen te beschermen. Neem de gel uit de glasplaat en het onderdompelen in 100 mL gedeïoniseerd water met 10 µL van een nucleïnezuur gel vlek voor 30 min.
    Let op: De nucleic zuur oplossing voor de vlek van de gel is giftig.
  6. Observeren van de gel onder een UV-imaging systeem en maak een foto van de gekleurde gel (Figuur 3).

4. zuivering van eindige roosters

  1. Een native 2% agarose gel voorbereiden door elektroforese zuivering van eindige roosters.
    1. Meng 1 g agarose poeder, 5 mL van de 10 x TBE· Mg buffer (89 mM Tris, 89 mM boorzuur, 2 mM EDTA, pH 8.0, 12.5 mM Mg(Ac)2), 2 µL van nucleic zuur gel vlek en 47.5 mL gedeïoniseerd water in een fles van 250 mL driehoek. Kook het mengsel totdat de belletjes worden kleine en dichte. Warm water in de fles aan een totaal volume van 50 mL en een concentratie van 2% agarose toevoegen.
    2. Dikke handschoenen dragen. Giet de gel-oplossing in een kunststof gel doos van 7 x 10 x 1 cm3 (breedte × lengte × dikte). Invoegen van een 1,5 mm dik en 12-well gel kam. Wachten op de gel om af te koelen tot kamertemperatuur. Indien nodig, zet u de gel in een koelkast 4 ° C.
      Let op: Wees bewust van het broeien omdat de oplossing erg warm is.
    3. Voeg toe 0,5 x TBE· Mg buffer in de Elektroforese van het systeem. Prerun de gel 5 V/cm voor 20 min in een bad met ijs water op een constante spanning van 50 V.
    4. Injecteer 20 µL van de oplossing van de eindige lattice in stap 2.3 in elke agarose gel goed voorbereid en 5 µL van een DNA-markering (100-3000 bp) toevoegen aan een afzonderlijke goed. De gel gedurende 2 uur op 5 V/cm in een bad met ijs water uitgevoerd.
    5. Draag rubberen handschoenen en bril om huiden en ogen te beschermen. Knip het doel gel bands met een vergelijkbaar met de 1000 bp markering onder UV-licht en snijd ze in fijne stukjes en plaats de geplette gels in een filter kolom8positie.
    6. Centrifugeer de kolom bij 2.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Pak de oplossing van het monster door de kolom. Het verzamelen van de oplossing voor beeldvorming van de AFM.
  2. Eindige roosters zuiveren door PEG neerslag.
    1. Mix-50 µL van de oplossing van de eindige rooster bereid in stap 2.3 met een gelijk volume van 15% PEG8000 (m/v) buffer (20 mM Mg(Ac)2, 5 mM Tris, 1 mM EDTA en 505 mM NaCl)22. Centrifugeer de oplossing bij 18.000 × g bij 4 ° C gedurende 30 minuten.
    2. Verwijder het supernatant en voeg 100 µL van PEG buffer. Herhaal het centrifugeren.
    3. Na het verwijderen van de bovendrijvende substantie, Los de pellet in 1 x TAE· Mg buffer voor beeldvorming van de AFM.
      Opmerking: Zuivering is nodig voor de eindige roosters van 5 × 6 cDAO-c64nt-O en 5 × 6 cDAO-c74 & c84nt-O voor beeldvorming van de AFM en andere toepassingen. Als de opbrengst te laag is, verhoogt de snelheid van centrifugeren. Als het product niet zuiver genoeg is, herhaalt u stap 4.2.2.

5. AFM Imaging

  1. Voor c64nt nanowire, c84nt nanowire, acDAO-c64nt-E storten oneindige 2D roosters van cDAO-c64nt-E(O), en cDAO-c84nt-E(O), 2 μL van ontharde monster op een vers gekloofd mica oppervlak. Laat gedurende 2 minuten voor adsorptie van DNA roosters aan het oppervlak mica. Het oppervlak met 100 µL van gedeïoniseerd water twee keer wassen en droog het met perslucht.
  2. Verkrijgen AFM beelden van oneindige DNA roosters in de lucht door het scannen van het oppervlak van mica met driehoekige AFM sondes onder te tikken modus. Stel de volgende parameters voor het scannen: scan grootte van 0,5 ~ 5 µm, scanresolutie van 512 lijnen, en scan rate van 3,5 Hz (Figuur 4).
  3. Voor eindige DNA roosters van 5 × 6 cDAO-c64nt-O en 5 × 6 cDAO-c74 & c84nt-O, storten 80 µL van 1 x TAE· Mg buffer op een vers gekloofd mica oppervlak. Voeg vervolgens 5 µL van eindige monsters in de buffer. Laat gedurende 2 minuten voor adsorptie van DNA roosters aan het oppervlak mica. Voeg een andere 50 µL van 1 x TAE· Mg buffer op de AFM-sonde.
  4. Verkrijgen AFM beelden van eindige DNA roosters in vloeistof door het scannen van het oppervlak van mica met driehoekige AFM sondes onder te tikken modus. Stel de volgende parameters voor het scannen: scan grootte van 0,5-1 µm, scanresolutie van 256 lijnen, en scan snelheid van 1,5 Hz (Figuur 5).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De circulaire DNA beweegt iets langzamer dan zijn voorloper lineaire DNA in denaturering pagina (Figuur 2) omdat de porie binnen de circulaire DNA is doorgedrongen en achterlijk door gel vezels23,24,25. De correcte afbinding reactie efficiëntie van oligo-monomeer cyclisatie hangt af van de volgorde van het substraat en concentratie, reactie temperatuur, tijd, enz...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De protocollen die in dit artikel richten zich op de synthese van kleine cirkelvormige DNA moleculen en de assemblage van DNA nanostructuren gepresenteerd. De meeste van willekeurig sequenced DNA ontwerpen kan worden gebruikt in dit protocol. De zuiverheid van de ANI van de circulaire is essentieel voor het succes van DNA assemblages. De opbrengst van de productie van cyclisatie kan worden verbeterd door een verlaging van de concentratie van 5'-phosphorylated lineaire DNA; echter, dit zal het verhogen van de werklast voo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We zijn dankbaar voor financiële steun uit het NSFC (subsidies nr. 91753134 en 21571100), en de sleutel laboratorium van Bioelectronics van Zuidoost-Staatsuniversiteit.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
T4 ligaseTaKaRa2011A
T4 bufferTaKaRa2011A
TE bufferSangonB548106
Thermo bottleThermosSK-3000
Thermo cyclerBio GenerGE4852T
Exonuclease ITaKaRa2650A
Exonuclease I bufferTaKaRa2650A
30% (w/v) Acryl/Bis solution (19:1)SangonB546016
TAE premix podwerSangonB540023
Mg(Ac)2·4H2ONanjing Chemical ReagentC0190550223
UreaSangonA510907
TEMEDBBIA100761
Ammonium PersulfateNanjing Chemical Reagent13041920295
Power supplyBeijing LiuyiDYY-8C
Water bathSumsungDK-S12
FormamideBBIA100314
DNA Marker (25~500 bp)SangonB600303
DNA Marker (100~3000 bp)SangonB500347
Loading bufferSangonB548313
PAGE electrophoresis systermBeijing Liuyi24DN
FilterASD5010-22250.22 µM
UV imaging SystemTanon2500R
n-butanolSangonA501800
Absolute EthanolSCR10009257
NaOAcNanjing Chemical Reagent12032610459
CentrifugeeppendorfCentrifuge 5424R
Vacuum concentratorCHRISTRVC 2-18
Ultraviolet spectrumAllshengNano-100
nucleic acid stainBiotium16G1010GelRed
AgaroseBiowestG-10
Agarose electrophoresis systermBeijing LiuyiDYCP-31CN
Heating PlateJiangsu JintanDB-1
TBE premix podwer SangonB540024
filter columnBio-Rad7326165Freeze 'N Squeeze column
AFMBrukerDimension FastScan
PEG8000BBIA100159
MicaTed PellaBP50
triangular AFM probe in airBrukerFastScan-C
triangular AFM probe in fulidBrukerScanAsyst-fluid+
DNA strandsSangon

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tsu-Ju, F., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).
  2. Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).
  3. Liu, F., Sha, R., Seeman, N. C. Modifying the surface features of two-dimensional DNA crystals. Journal of the American Chemical Society. 121 (5), 917-922 (1999).
  4. Yan, H., Park, S. H., Finkelstein, G., Reif, J. H., LaBean, T. H. DNA-templated self-assembly of protein arrays and highly conductive nanowires. Science. 301 (5641), 1882-1884 (2003).
  5. Liu, D., Wang, M., Deng, Z., Walulu, R., Mao, C. Tensegrity: Construction of rigid DNA triangles with flexible four-arm DNA junctions. Journal of the American Chemical Society. 126 (8), 2324-2325 (2004).
  6. Tian, C., Li, X., Liu, Z., Jiang, W., Wang, G., Mao, C. Directed self-assembly of DNA tiles into complex nanocages. Angewandte Chemie: International Edition. 53 (31), 8041-8044 (2014).
  7. Wang, P., et al. Retrosynthetic analysis-guided breaking tile symmetry for the assembly of complex DNA nanostructures. Journal of the American Chemical Society. 138 (41), 13579-13585 (2016).
  8. Ke, Y., Ong, L. L., Shih, W. M., Yin, P. Three-dimensional structures self-assembled from DNA bricks. Science. 338 (6111), 1177-1183 (2012).
  9. Wei, B., Dai, M., Yin, P. Complex shapes self-assembled from single-stranded DNA tiles. Nature. 485 (7400), 623-626 (2012).
  10. Ke, Y., et al. DNA brick crystals with prescribed depths. Nature Chemistry. 6 (11), 994-1002 (2014).
  11. Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
  12. Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., Högberg, B., Graf, F., Shih, W. M. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).
  13. Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325 (5941), 725-730 (2009).
  14. Ackermann, D., Schmidt, T. L., Hannam, J. S., Purohit, C. S., Heckel, A., Famulok, M. A double-stranded DNA rotaxane. Nature Nanotechnology. 5 (6), 436-442 (2010).
  15. Zheng, H., Xiao, M., Yan, Q., Ma, Y., Xiao, S. J. Small circular DNA molecules act as rigid motifs to build DNA nanotubes. Journal of the American Chemical Society. 136 (29), 10194-10197 (2014).
  16. Wang, M., Huang, H., Zhang, Z., Xiao, S. J. 2D DNA lattices constructed from two-tile DAE-O systems possessing circular central strands. Nanoscale. 8 (45), 18870-18875 (2016).
  17. Guo, X., Wang, X. M., Wei, S., Xiao, S. J. Construction of a holliday junction in small circular DNA molecules for stable motifs and two-dimensional lattices. ChemBioChem. 19 (13), 1379-1385 (2018).
  18. Holliday, R. A mechanism for gene conversion in fungi. Genet. Res. 5 (2), 282-304 (1964).
  19. Duckett, D. R., et al. The structure of the Holliday junction. Structure and Methods, Human Genome Initiative and DNA Recombination. 1 (1), 157-181 (1990).
  20. Ariyoshi, M., Vassylyev, D. G., Iwasaki, H., Nakamura, H., Shinagawa, H., Morikawa, K. Atomic structure of the RuvC resolvase: A holliday junction-specific endonuclease from E. coli. Cell. 78 (6), 1063-1072 (1994).
  21. Eichman, B. F., Vargason, J. M., Mooers, B. H., Ho, P. S. The Holliday junction in an inverted repeat DNA sequence: sequence effects on the structure of four-way junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (8), 3971-3976 (2000).
  22. Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions. Angewandte Chemie: International Edition. 53 (47), 12735-12740 (2014).
  23. de Gennes, P. G. Reptation of a polymer chain in the presence of fixed obstacles. The Journal of Chemical Physics. 55 (2), 572-579 (1971).
  24. Slater, G. W., Noolandi, J. New biased reptation model for charged polymers. Physical Review Letters. 55 (15), 1579(1985).
  25. Lilley, D. M. J. Analysis of branched nucleic acid structure using comparative gel electrophoresis. Quarterly Reviews of Biophysics. 41 (1), 1-39 (2008).
  26. Pfreundschuh, M., Martinez-Martin, D., Mulvihill, E., Wegmann, S., Muller, D. J. Multiparametric high-resolution imaging of native proteins by force-distance curve-based AFM. Nature Protocols. 9 (5), 1113-1130 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

DNA nanotechnologiedenaturerende PAGEnative PAGEatoomkrachtmicroscopieDNA tegels1D nanostructuren2D nanostructurenDNA zuiveringDNA annealing

Gerelateerde artikelen