Methodenartikel

Escherichia coli-cel-Free eiwitsynthese gebaseerd: protocollen voor een robuuste, flexibele en toegankelijk platformtechnologie

DOI:

10.3791/58882

⸱

25 februari 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, California Polytechnic State University, San Luis Obispo, 2Center for Applications in Biotechnology, California Polytechnic State University, San Luis Obispo, 3Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University, 4Department of Chemical and Biological Engineering, Northwestern University, 5Chemistry of Life Processes Institute, Northwestern University, 6Center for Synthetic Biology, Northwestern University, 7Interdisciplinary Biological Sciences Program, Northwestern University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol detailleert de stappen, kosten, en apparatuur die nodig is voor het genereren van E. coli-op basis van cel extracten en uit te voeren in vitro eiwit synthese reacties binnen 4 dagen of minder. Om de invloed van de flexibele aard van dit platform voor brede toepassingen, bespreken we reactie voorwaarden die kunnen worden aangepast en geoptimaliseerd.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de afgelopen 50 jaar, heeft cel-vrij proteïne synthese (GVB) ontpopt als een krachtige technologie om uit te rusten van de transcriptionele en translationele capaciteit van cellen in een reageerbuis. Door het wegnemen van de noodzaak om de levensvatbaarheid van de cel, en door het wegnemen van de cellulaire barrière, is GVB fundamenteel aan opkomende toepassingen in de biomanufacturing van oudsher uitdagende eiwitten, evenals toepassingen, in snelle prototyping voor Metabole engineering en functionele genomica. Onze methoden voor de uitvoering van een e-coli-gebaseerde GVB platform dat nieuwe gebruikers toegang tot veel van deze toepassingen. We beschrijven hier, methoden om te bereiden extract door middel van verrijkte media, verbijsterd kolven en een reproduceerbare methode van afstembare ultrasoonapparaat gebaseerde cellysis. Dit extract kan vervolgens worden gebruikt voor eiwit expressie geschikt voor het produceren van 900 µg/mL of meer van de super map groen fluorescent proteïne (sfGFP) in enkel 5 h van experimentele opstelling van data-analyse, gezien het feit dat geschikt reagens voorraden zijn vooraf opgesteld. De kosten van de geschatte opstarten voor het verkrijgen van reagentia is $4,500 die duizenden reacties op een geraamde kostprijs van $0.021 per µg eiwit geproduceerd of $0.019 per µL van reactie zal ondersteunen. De eiwit expressie methoden spiegel daarnaast het gemak van de setup van de reactie in de verkrijgbare systemen als gevolg van optimalisatie van reagens voormengsels, tegen een fractie van de kosten gezien. Zodat de gebruiker om de invloed van de flexibele aard van het GVB platform voor brede toepassingen, hebben we geconstateerd dat een aantal aspecten van het platform dat kan worden afgestemd en geoptimaliseerd afhankelijk van de beschikbare middelen en de eiwit expressie resultaten gewenste.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cel-vrij proteïne synthese (GVB) heeft ontpopt als een technologie die heeft een aantal nieuwe mogelijkheden voor de productie van eiwitten, functionele genomica, Metabole engineering en meer in de laatste 50 jaar1,2ontgrendeld. In vergelijking met standaard in vivo eiwit expressie platformen, GVB biedt drie belangrijke voordelen: 1) de cel-vrije aard van het platform mogelijk maakt de productie van eiwitten dat zou potentieel giftige of vreemd aan de cel3,4 ,5,6; 2) inactivatie van genomic DNA en de invoering van een sjabloon DNA codering van de gene(s) van belang kanaal alle systemische energie binnen de reactie op de productie van de expressie gebrachte eiwitten van belang; en 3) het open karakter van het platform kan de gebruiker wijzigen en controleren van de omstandigheden en de samenstelling in real-time7,8. Deze directe toegang tot de reactie ondersteunt de vergroting van biologische systemen met uitgebreide oplossingen en redox voorwaarden voor de productie van nieuwe eiwitten en de afstemming van metabole processen2,9, 10. directe toegang maakt het ook mogelijk de gebruiker aan het combineren van de GVB-reactie met activiteit testen in een één-pot-systeem voor een snellere design-build-test cycli11. De capaciteit om te voeren van de GVB-reactie in klein volume druppels of op papier gebaseerde apparaten verder ondersteunt high-throughput ontdekking inspanningen en snelle prototyping12,13,14,15 ,16. Als gevolg van deze voordelen en de plug en play-aard van het systeem, GVB uniek heeft een scala aan biotechnologische toepassingen zoals de productie van eiwitten die moeilijk te solubly snel in vivo17, 18,19,20, opsporing van ziekte21,22,23, op vraag biomanufacturing18,24 ,25,26,27, en onderwijs28,29, die allemaal Toon de flexibiliteit en bruikbaarheid van de cel-vrije platform.

GVB systemen kunnen worden gegenereerd uit een verscheidenheid van ruwe lysates van beide cellijnen prokaryote en eukaryote. Dit zorgt voor diverse opties in het systeem van keuze, die elk voor- en nadelen, afhankelijk van de toepassing van belang zijn. GVB systemen ook variëren sterk in voorbereidingstijd, kosten en productiviteit. De meeste vaak gebruikt cel extracten worden geproduceerd van tarwekiemen, konijn Retikulocyt, insect cellen en Escherichia coli cellen, met de laatste is de meest kosteneffectieve tot nu toe terwijl de productie van de hoogste volumetrische opbrengst van eiwit30 . Terwijl andere systemen GVB kunnen nuttig zijn voor hun aangeboren posttranslationele wijziging-machinery, opkomende toepassingen met behulp van de E. coli-gebaseerde machines zijn in staat de kloof te overbruggen door het genereren van site-specifically gefosforyleerd en geglycosyleerde eiwitten op vraag31,32,33,34,35.

GVB reacties kunnen worden uitgevoerd in een batch, continu-uitwisseling cel-vrij (CECF) of continue-stroom cel-vrij (CFCF) formaten. De batch-indeling is een gesloten systeem waarvan reactie levensduur beperkt als gevolg van de afnemende hoeveelheid reactanten en de accumulatie van remmende bijproduct van de reactie is. CECF en CFCF methoden verhogen de levensduur van de reactie, en daardoor leiden tot verhoogde volumetrische eiwit rendementen ten opzichte van de batch-reactie. Dit wordt bereikt doordat de bijproducten van de eiwitsynthese te worden verwijderd uit het reactievat, terwijl nieuwe reactanten worden geleverd in de loop van de reactie2. In het geval van CFCF, kan de proteïne van belang ook worden verwijderd uit de zaal reactie, terwijl in de CECF, de proteïne van belang blijft in de zaal van de reactie van een semi-permeabel membraan36,37samengesteld. Deze methoden zijn vooral waardevol zijn bij het overwinnen van arme volumetrische opbrengst van moeilijk-aan-express proteïnen van belang38,39,40,41,42, 43. De uitdagingen bij de uitvoering van de CECF en CFCF benaderingen zijn dat 1) terwijl ze leiden een efficiënter gebruik van de bio-machine verantwoordelijk voor transcriptie en vertaling tot, zij vereisen met name grotere hoeveelheden van reagentia die een toename van de totale kosten en 2) ze vereisen meer complexe reactie opstellingen en gespecialiseerde apparatuur ten opzichte van de batch formaat44. Met het oog op toegankelijkheid voor nieuwe gebruikers, beschreven de protocollen hierin focus op het formaat van de partij bij reactie volumes van 15 µL met specifieke aanbevelingen voor het verhogen van het volume van de reactie op de schaal van de milliliter.

De hier vermelde methoden niet-deskundigen met basic Labor vaardigheden (zoals studenten) inschakelen voor de uitvoering van de celgroei, uitpakken van de voorbereiding en batch formaat reactie setup voor een e-coli-gebaseerde systeem van het GVB. Deze aanpak is rendabel commercieel beschikbare kits t.o.v. zonder in te boeten op het gemak van kit gebaseerde reactie setup. Deze aanpak maakt bovendien toepassingen in het laboratorium en in het veld. Bij de beslissing om de implementatie van GVB, moeten nieuwe gebruikers grondig evalueren de werkzaamheid van conventionele eiwit expressiesystemen voor opstarten investeringen, zoals GVB niet kan superieur in ieder geval. De hier beschreven methoden voor het GVB zodat de gebruiker direct om een verscheidenheid van toepassingen, met inbegrip van functionele genomica, high-throughput testen, de productie van eiwitten die hardnekkige voor in vivo expressie, evenals veld zijn toepassingen met inbegrip van biosensoren en educatieve kits voor synthetische biologie. Extra toepassingen zoals Metabole engineering, afstemming van eiwit expressie voorwaarden, opsporing van de ziekte, en schaal-up met behulp van CECF of CFCF methoden zijn nog steeds mogelijk, maar wellicht ervaring met het GVB-platform voor de verdere wijziging van de reactie voorwaarden. Onze methoden combineren groei in de verrijkte media en verbijsterd kolven, met relatief snelle en reproduceerbare methoden van lysis van de cel via ultrasoonapparaat, gevolgd door een vereenvoudigde GVB reactie setup dat gebruik maakt van geoptimaliseerde premixen45. Terwijl de cellulaire groei methoden hebben enigszins worden gestandaardiseerd op dit gebied, lopen methoden voor lysis van de cel sterk uiteen. Naast ultrasoonapparaat omvatten gemeenschappelijke lysis methodes gebruik van een Franse pers, een homogenizer, kraal drijvers, of lysozym en andere verstoring van de biochemische en fysische methoden46,47,48, 49. met behulp van onze methoden ongeveer 2 mL van ruwe cel extract worden verkregen per 1 liter van cellen. Deze hoeveelheid cel extract kan steunen vier honderd 15 µL GVB reacties, elke producerende ~ 900 µg/mL verslaggever sfGFP eiwit uit de sjabloon plasmide pJL1-sfGFP. Deze methode kost $0.021/µg sfGFP geproduceerd ($.019/µL van reactie), exclusief de kosten van arbeid en uitrusting (aanvullende figuur 1). Vanaf de nul, deze methode toegepast kunnen worden in 4 dagen door een enkele persoon en herhaal GVB reacties kunnen worden voltooid binnen uur (Figuur 1). Bovendien kan het protocol worden opgeschaald in volume voor grotere partijen reagens voorbereiding aan de behoeften van de gebruiker. Nog belangrijker is, kan het protocol gepresenteerd hier toegepast worden door laboratorium opgeleid niet-deskundigen zoals Voorgraadse studente, zoals zij alleen basic Labor vaardigheden vereist. De hieronder beschreven procedures, en de begeleidende video zijn specifiek ontwikkeld ter verbetering van de toegankelijkheid van de E. coli GVB platform voor breed gebruik.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Media voorbereiding en celgroei

  1. Dag 1
    1. Streak E. coli BL21*(DE3) cellen uit een glycerol voorraad op een bord van de agar LB en incubeer gedurende ten minste 18 uur bij 37 ° C.
    2. 50 mL van LB-media en autoclaaf de oplossing voor te bereiden op een vloeibare cyclus gedurende 30 minuten bij 121 ° C. Bewaren bij kamertemperatuur.
  2. Dag 2
    1. 750 mL 2 x YTP media en 250 mL 0,4 M D-Glucose-oplossing te bereiden zoals beschreven in de aanvullende informatie.
    2. Giet de 2 x YTP media in een gesteriliseerde met autoclaaf 2.5 L verbijsterd kolf en de D-Glucose-oplossing in een gesteriliseerde met autoclaaf 500 mL glazen fles. Autoclaaf beide oplossingen op een vloeibare cyclus gedurende 30 minuten bij 121 ° C.
    3. Zorg ervoor dat beide steriele oplossingen bij 37 ° C worden opgeslagen als celgroei wordt uitgevoerd op de volgende dag, naar groeicijfers na inoculatie maximaliseren. Combineer oplossingen niet tot inenting.
      Opmerking: Oplossingen kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende 1-2 d indien nodig, hoewel de 2 x YTP media is zeer gevoelig voor besmetting.
    4. Start een overnachting cultuur van BL21(DE3) door het enten van 50 mL van LB-media met een één kolonie van BL21(DE3) met behulp van een gesteriliseerde lus en steriele techniek om verontreiniging te voorkomen.
    5. Plaats van de 50 mL BL21*(DE3) LB cultuur in een 37 ° C 250 rpm schudden incubator en groeien 's nachts voor 15-18 h.
    6. Bereiden en steriliseren van alle materialen die nodig zijn voor dagen 3 en 4, met inbegrip van: twee flessen van 1 L centrifuge, 4 x koud 50 mL conische buizen (wegen en record massa's van drie), en vele 1,5 mL microfuge buizen.
  3. Dag 3
    1. Verwijder de 50 mL overnachting cultuur van BL21*(DE3) in LB uit de schudden incubator en meten van de OD600 op een spectrofotometer met behulp van een 1:10 verdunning met LB-media. Berekenen van het volume van overnachting cultuur aan 1 L van media voor een startende OD600 0.1 moet worden toegevoegd (bijvoorbeeld, als een OD600 van een 1:10 verdunning wordt gelezen als 0.4, Beënt 25 mL van de onverdunde OD600 = 4.0 overnachting cultuur in 1 L van 2 x YTP G).
    2. Verwijder de verwarmde 2 x YTP media en D-Glucose oplossingen van de 37 ° C incubator, samen met de 50 mL LB cultuur. Met behulp van steriele techniek, giet zorgvuldig de D-Glucose-oplossing in de 2 x YTP media (het vermijden van de zijkanten van de verbijsterd kolf).
      Opmerking: Toevoeging van D-Glucose voltooit het recept voor 1 liter 2 x YTPG.
    3. Behoud van steriele techniek, Beënt de 1 L van 2 x YTPG oplossing met het juiste bedrag van de 50 mL cultuur om te beginnen met de cultuur van de 1 L op een 0.1 OD600. Onmiddellijk plaats de geënte 1 L-cultuur in een 37 ° C incubator schudden bij 200 omwentelingen per minuut.
    4. Neem de eerste OD600 lezen na het eerste uur van groei (lag fase typische duurt 1U). De cultuur niet worden verdund. Blijven metingen OD600 ongeveer elke 20-30 min tot OD600 0.6 bereikt.
    5. Bij het bereiken van de OD600 = 0,6, voeg 1 mL 1 M IPTG (eindconcentratie in 1 L cultuur = 1 mM) aan de 2 x YTPG cultuur.
      Opmerking: Ideale inductie OD600 is 0,6; een aantal 0.6-0.8 is echter aanvaardbaar. Inductie door IPTG is voor de endogene productie van T7 RNA Polymerase (T7RNAP).
    6. Na inductie, meten de OD600 ongeveer elke 20-30 min tot het 3.0 bereikt.
      Opmerking: Afkoelen in de centrifuge tot 4 ° C gedurende deze tijd. Bereiden van koude S30 buffer zoals beschreven in de aanvullendeinformatie. Als de buffer S30 is voorbereid, ervoor zorgen dat DTT niet tot de dag van gebruik wordt toegevoegd.
    7. Zodra de OD600 bereikt 3.0 (figuur 2A), giet de cultuur in een koude 1 L centrifuge fles in een bad met ijs-water. Bereiden een water gevulde 1 L centrifuge fles gelijk gewicht moet worden gebruikt als een evenwicht in de centrifuge.
      Opmerking: Extinctie waarden verschillen van instrument tot instrument. Terwijl de OD600 van oogst van BL21(DE3) niet een gevoelige variabele is, is het aanbevolen dat de gebruiker evalueren en optimaliseren van deze variabele als een probleemoplossing maatregel. Grotere spectrofotometers kunnen leiden tot relatief lagere OD600 lezingen in vergelijking met kleinere cuvette gebaseerde spectrofotometers.
    8. Centrifugeer het 1 L flessen voor 10 min op 5.000 x g en 10 ° C tot pellet cellen.
    9. Langzaam giet af de bovendrijvende substantie en de afzet van het volgens de instelling van biologisch afval procedures. Plaats de pellet op ijs.
    10. Met behulp van een steriele spatel, schraap de cel pellet uit de fles centrifuge en overbrengen naar een conische buis van koude 50 mL.
    11. Voeg 30 mL koud S30 buffer aan de conische buis en resuspendeer de pellet cel door vortexing met korte uitbarstingen (20-30 s)- en rusttijden (1 min) op ijs totdat volledig geresuspendeerde met geen brokken.
    12. Zodra de pellet is volledig geresuspendeerde, gebruikt u een ander conische tube van 50 mL met water als een evenwicht en Centrifugeer gedurende 10 min op 5000 x g en 10 ° C (vooraf gekoeld tot 4 ° C).
      Opmerking: Dit voltooit de 1st 3 wasbeurten vereist tijdens het oogsten van de cellen.
    13. Giet het supernatant en de afzet van het volgens de instelling van biologisch afval procedures. Resuspendeer de pellet met 20-25 mL koud S30 buffer en Centrifugeer gedurende 10 min bij 5000 x g en 10 ° C (vooraf gekoeld tot 4 ° C).
      Opmerking: Dit voltooit de 2nd van 3 wasbeurten.
    14. Nogmaals, uitstorten de bovendrijvende substantie en de afzet van het volgens de instelling van biologisch afval procedures. Voeg precies 30 mL S30 buffer en vortex opnieuw naar resuspendeer de pellet.
    15. Met behulp van de 3 conische buisjes in de vooraf gewogen, koude 50 mL en een serologische pipet-vuller met een steriele Pipet, aliquoot 10 mL geresuspendeerde pellet/S30 buffer mengsel in elk van de 3 conische buisjes.
      Opmerking: De cellen te splitsen in 3 buizen is niet vereist, maar deze stap leidt tot kleinere cel pellets (~ 1 g) voor meer gemak op latere stappen.
    16. Centrifugeer alle buizen, met behulp van passende saldi, zo nodig, voor 10 min op 5000 x g en 10 ° C (vooraf gekoeld tot 4 ° C).
      Opmerking: Dit is de laatste wassen stap voltooid.
    17. Giet het supernatant en de afzet van het volgens de instelling van biologisch afval procedures. Verwijderen van de overtollige S30 buffer door zorgvuldig het afvegen van de binnenkant van de conische buis en cap met een schone tissue; Raak de pellet.
    18. Weeg de buizen op een analytische balans en het gewicht van de laatste pellet op elke buis.
      Opmerking: Het protocol kan worden onderbroken op dit punt. De pellets kunnen flash in vloeibare stikstof bevroren en opgeslagen bij-80 ° C gedurende maximaal een jaar totdat het nodig is voor de bereiding van het extract.

2. de ruwe cel Extract voorbereiding - dag 4

  1. Voor de bereiding van het extract, houden cellen koud op ijs tijdens elke stap. Voeg 1 mL koude S30 buffer per 1 g van cel massa van de pellet. Zorg ervoor dat dithiothreitol (DTT) is aangevuld tot de buffer S30 aan een definitieve concentratie van 2 mM.
    Opmerking: Afkoelen in de microcentrifuge tot 4 ° C gedurende deze tijd.
  2. Resuspendeer de pellet cel door vortexing met korte uitbarstingen (20-30 s)- en rusttijden (1 min) op ijs totdat volledig geresuspendeerde. Als resuspensie moeilijk is, laat u de pellets op ijs gedurende 30 minuten om te ontdooien.
  3. Pipetteer 1,4 mL geresuspendeerde cellen in een 1,5 mL microfuge buis.
  4. Plaats een 1,5 mL tube met 1,4 mL geresuspendeerde cellen in een bad met ijs water in een bekerglas. Bewerk ultrasone trillingen ten voor 45 s op gevolgd door 59 s uit voor 3 totale cycli, met amplitude ingesteld op 50%. Sluit en het omkeren van de buizen voorzichtig mengen off perioden. In totaal 800-900 J van energie te leveren aan elke 1,5 mL microfuge buis met 1,4 mL geresuspendeerde cellen (figuur 3A & 3B).
    Opmerking: Deze stap is gevoelig voor het ultrasoonapparaat type en model gebruikt en moet worden geoptimaliseerd als apparatuur anders is dan die voor deze procedure. Twee complementaire benaderingen kunnen worden gebruikt voor schaal-up de hoeveelheid extract bereid tijdens deze stap: 1) meerdere 1,5 mL microfuge buizen parallel kunnen worden sonicated, en/of 2) grotere volumes kunnen worden sonicated in conische buisjes (maximaal 15 mL cel resuspensie per buis) , 29,45schalen van de hoeveelheid energie geleverd zoals hiervoor is beschreven.
  5. Onmiddellijk nadat ultrasoonapparaat voltooid is, 4.5 µL van 1 M DTT (ter aanvulling van een extra 2 mM DTT) toevoegen in de 1,4 mL lysate en omkeren van meerdere keren te mengen. Plaats de buis op ijs. Herhaal stap 2.4 en 2.5 voor elke extra buizen van geresuspendeerde cellen alvorens te centrifugeren.
  6. Microcentrifuge monsters op 18.000 x g- en 4 ° C voor 10 min (Figuur 3 c).
  7. Pipetteer de bovendrijvende substantie in een nieuwe 1,5 mL microfuge buis. Niet storen de pellet; het is beter dan sommige supernatant achterlaten om zuiverheid dan om de pellet te verstoren in inspanningen te maximaliseren van de opbrengst.
  8. Incubeer de bovendrijvende vloeistof uit de vorige stap bij 250 rpm en 37 ° C gedurende 60 minuten door taping van de buizen aan het schudden platform van de incubator (dit is de reactie van de afvoer).
  9. Microcentrifuge monsters op 10.000 x g- en 4 ° C gedurende 10 minuten.
  10. Verwijder de bovendrijvende vloeistof zonder verstoring van de pellet en overbrengen naar een nieuwe buis. Maak veel 100 µL aliquots voor extract voor opslag.
    Opmerking: Het protocol hier kan worden onderbroken kan, en het extract flash in vloeibare stikstof bevroren en opgeslagen bij-80 ° C voor maximaal een jaar totdat het nodig is voor GVB reacties. Ten minste 5 bevriezen-ontdooien cycli kunnen worden ondergaan zonder afbreuk te doen aan het uitpakken van de productiviteit (Figuur 4).

3. cel-vrij proteïne synthese Batch formaat reacties

  1. Oplossingen A en B, DNA sjabloon BL21(DE3) extract (als bevroren), T7RNAP en een aliquoot gedeelte van het moleculaire rang water ontdooien.
    Opmerking: GVB reactie sjabloon kan gevonden worden in de Aanvullendeinformatie. Oplossingen A en B recepten vindt u in de Aanvullendeinformatie en corresponderen met bepaalde concentraties voor talrijke reagentia ter ondersteuning van het energiesysteem PANOx-SP gebaseerd voor GVB. De rol van elk reagens en aanvaardbare schommelingen in deze reagens concentraties die GVB ondersteunen kunnen geweest vastberaden50. Een T7RNAP zuivering protocol kan worden gevonden in de aanvullendeinformatie51. Aanvullende T7RNAP volumetrische opbrengst kan verhogen maar is niet nodig als T7RNAP wordt veroorzaakt tijdens de celgroei. Plasmide DNA sjabloon (pJL1-sfGFP) kan bereid worden met behulp van een maxiprep kit met twee wasbeurten met behulp van de was-buffer in de kit, gevolgd door een post-processing DNA-opruiming met behulp van een PCR zuivering kit (figuur 2B). Lineaire DNA-sjablonen kunnen ook worden gebruikt in GVB reacties.
  2. Label de benodigde hoeveelheid microfuge buizen nodig voor GVB reacties.
    Opmerking: Reacties kunnen worden uitgevoerd in verschillende maten van het schip, maar een kleiner vaartuig kunt verminderen volumetrische eiwit opbrengst (figuur 2C). Opschalen van een reactie in het dezelfde grootte vaartuig kan volumetrische opbrengst, als een functie van het verlagen van de uitwisseling van zuurstof, als gevolg van een daling in het oppervlak volumeverhouding ook verminderen. Wanneer het volume van de reactie boven 100 μl verhogen, is het aanbevolen om het gebruik van platte bodem goed platen 31,37,52.
  3. Voeg 2.2 µL van oplossing A, 2.1 µL van oplossing B, 5 µL van BL21*(DE3) extract, 0,24 μg T7RNAP (16 μg/mL-eindconcentratie), 0,24 ng van DNA sjabloon (eindconcentratie is 16 ng/mL) en water toe zodat het eindvolume 15 µL.
    Opmerking: Vortex oplossingen A en B vaak tijdens de installatie van de reactie te voorkomen van sedimentatie van componenten en ervoor zorgen dat elke reactie een homogene aliquot van elke oplossing ontvangt. Vermijd vortexing het extract, in plaats daarvan het omkeren van de buis te mengen.
  4. Nadat alle reagentia zijn toegevoegd aan de reactie, mengen elke buis door pipetteren omhoog en omlaag of zachtjes vortexing en tegelijkertijd te garanderen dat het uiteindelijke reactiemengsel worden gecombineerd tot een enkel 15 µL kraal aan de onderkant van de 1,5 mL microfuge buis.
  5. Plaats elke reactie in de 37 ° C incubator zonder schudden voor 4 uur of 30 ° C's nachts.
    Opmerking: Succesvolle reacties kunnen worden kwalitatief beoordeeld visueel op basis van de groene kleur van het product van de sfGFP binnen het GVB reactiemengsel (figuur 3D). Uitdrukking van de proteïne van belang kan er ook worden bevestigd door SDS-PAGE (aanvullende figuur 2).

4. kwantificering van de verslaggever proteïne, [sfGFP]

  1. 48 µL van 0,05 M HEPES, pH 8, in elk goed die nodig zijn voor de kwantificering (meestal uitgevoerd in drievoud per reactiebuis) laden.
  2. Verwijder reacties van incubator. Pipetteer omhoog en omlaag als u wilt mengen elke reactie, dan breng 2 µL van de reactie in de 48 µL van 0,05 M HEPES, pH 8. Pipetteer op en neer opnieuw in de put te mengen.
  3. Zodra alle reacties worden geladen en gemengd, plaats de 96 goed plaat in de Fluorimeter en meten van de sfGFP eindpunt fluorescentie.
    Opmerking: Excitatie en emissie golflengten voor sfGFP fluorescentie kwantificering zijn 485 nm en 510 nm, respectievelijk.
  4. Met behulp van een eerder gegenereerde standaard curve, bepalen de [sfGFP] van de verkregen fluorescentie-lezingen.
    Opmerking: Instructies voor het genereren van een standaard curve van sfGFP concentratie ten opzichte van de intensiteit van de fluorescentie vindt in aanvullendeinformatie (aanvullende figuur 3). Gebruikers zullen moeten vaststellen van een standaard curve voor hun instrument omdat instrument gevoeligheid kan variëren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij hebben voorgesteld een ultrasoonapparaat gebaseerde E. coli extract voorbereiding protocol die met cijfer 1 demonstreren de procedurele verdeling over elke dag gedurende een vier-daagse span, kan worden voltooid. Er is buigbaarheid naar de stappen die in elke dag met diverse onderbreken punten kan worden voltooid, maar we hebben gevonden deze werkstroom het meest effectief uit te voeren. Bovendien zijn zowel de cel pellets (stap 1.3.18) en volled...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cel-vrije eiwitsynthese heeft ontpopt als een krachtige en activerende technologie voor een verscheidenheid van toepassingen variërend van biomanufacturing tot rapid prototyping van biochemische systemen. De breedte van de toepassingen wordt ondersteund door de capaciteit te controleren, manipuleren, en vergroten van cellulaire machines in real-time. Ondanks de groeiende impact van deze platformtechnologie, brede aanpassing gebleven traag als gevolg van technische nuances bij de uitvoering van de methoden. Door middel va...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Auteurs wil erkennen van Dr. Jennifer VanderKelen, Andrea Laubscher, en Tony Turretto voor technische ondersteuning, Wesley Kao, Layne Williams en Christopher Hight voor nuttige discussies. Auteurs erkennen ook financiering van de steun van de Bill en Linda Frost Fonds, Center for Applications in biotechnologie van Chevron biotechnologie toegepast onderzoek Endowment Grant, Cal Poly onderzoek Scholarly en creatieve activiteiten Grant programma (RSCA 2017), en de National Science Foundation (NSF-1708919). MZL erkent de California State University Graduate Grant. MCJ erkent het leger onderzoek Office W911NF-16-1-0372, verleent National Science Foundation MCB-1413563 en MCB-1716766, de Air Force Research Laboratorium Center van Excellence Grant FA8650-15-2-5518, de Defense bedreiging vermindering Agentschap subsidie HDTRA1-15-10052/P00001, de David en Lucile Packard Foundation, het programma van de leraar-Scholar Camille Dreyfus, het departement van energie BER Grant DE-SC0018249, de menselijke grenzen Science Program (RGP0015/2017), de DAMHINDE gezamenlijk genoom Instituut ETOP Grant, en het Chicago biomedische Consortium met steun uit de fondsen Searle op de Chicago Gemeenschap Trust voor steun.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Luria BrothThermoFisher12795027
TryptoneFisher Bioreagents73049-73-7
Yeast ExtractFisher Bioreagents1/2/8013
NaClSigma-AldrichS3014-1KG
Potassium Phosphate DibasicSigma-Aldrich60353-250G
Potassium Phosphate MonobasicSigma-AldrichP9791-500G
D-GlucoseSigma-AldrichG8270-1KG
KOHSigma-AldrichP5958-500G
IPTGSigma-AldrichI6758-1G
Mg(OAc)2Sigma-AldrichM5661-250G
K(OAc)Sigma-AldrichP1190-1KG
Tris(OAc)Sigma-AldrichT6066-500G
DTTThermoFisher15508013
tRNASigma-Aldrich10109541001
Folinic AcidSigma-AldrichF7878-100MG
NTPsThermoFisherR0481
Oxalic AcidSigma-AldrichP0963-100G
NADSigma-AldrichN8535-15VL
CoASigma-AldrichC3144-25MG
PEPSigma-Aldrich860077-250MG
K(Glu)Sigma-AldrichG1501-500G
NH4(Glu)MP Biomedicals02180595.1
Mg(Glu)2Sigma-Aldrich49605-250G
SpermidineSigma-AldrichS0266-5G
PutrescineSigma-AldrichD13208-25G
HEPESThermoFisher11344041
Molecular Grade WaterSigma-Aldrich7732-18-5
L-Aspartic AcidSigma-AldrichA7219-100G
L-ValineSigma-AldrichV0500-25G
L-TryptophanSigma-AldrichT0254-25G
L-PhenylalanineSigma-AldrichP2126-100G
L-IsoleucineSigma-AldrichI2752-25G
L-LeucineSigma-AldrichL8000-25G
L-CysteineSigma-AldrichC7352-25G
L-MethionineSigma-AldrichM9625-25G
L-AlanineSigma-AldrichA7627-100G
L-ArginineSigma-AldrichA8094-25G
L-AsparagineSigma-AldrichA0884-25G
GlycineSigma-AldrichG7126-100G
L-GlutamineSigma-AldrichG3126-250G
L-HistadineSigma-AldrichH8000-25G
L-LysineSigma-AldrichL5501-25G
L-ProlineSigma-AldrichP0380-100G
L-SerineSigma-AldrichS4500-100G
L-ThreonineSigma-AldrichT8625-25G
L-TyrosineSigma-AldrichT3754-100G
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0 mLFisher Scientific05-408-138
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mLFisher Scientific05-408-129
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 0.6 mLFisher Scientific05-408-120
PureLink HiPure Plasmid Prep KitThermoFisherK210007
Ultrasonic ProcessorQSonicaQ125-230V/50Hz3.175 mm diameter probe
Avanti J-E CentrifugeBeckman Coulter369001
JLA-8.1000 RotorBeckman Coulter366754
1L Centrifuge TubeBeckman CoulterA99028
Tunair 2.5L Baffeled Shake FlaskSigma-AldrichZ710822
Microfuge 20Beckman CoulterB30134
New Brunswick Innova 42/42R IncubatorEppendorfM1335-0000
Cytation 5BioTek
Strep-Tactin XT Starter KitIBA2-4998-000
pJL1-sfGFPAddgene69496
BL21(DE3)New England BioLabs
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jiang, L., Zhao, J., Lian, J., Xu, Z. Cell-free protein synthesis enabled rapid prototyping for metabolic engineering and synthetic biology. Synthetic and Systems Biotechnology. 3 (2), 90-96 (2018).
  2. Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).
  3. Watanabe, M. Cell-Free Protein Synthesis for Structure Determination by X-ray Crystallography. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 607, 149-160 (2010).
  4. Martemyanov, K. A., Shirokov, V. A., Kurnasov, O. V., Gudkov, A. T., Spirin, A. S. Cell-Free Production of Biologically Active Polypeptides: Application to the Synthesis of Antibacterial Peptide Cecropin. Protein Expression and Purification. 21 (3), 456-461 (2001).
  5. Renesto, P., Raoult, D. From genes to proteins: in vitro expression of rickettsial proteins. Annals of the New York Academy of Sciences. 990, 642-652 (2003).
  6. Xu, Z., Chen, H., Yin, X., Xu, N., Cen, P. High-Level Expression of Soluble Human b-Defensin-2 Fused With Green Fluorescent Protein in Escherichia coli Cell-Free System. Applied Biochemistry and Biotechnology. 127 (1), 053-062 (2005).
  7. Baumann, A. In-situ observation of membrane protein folding during cell-free expression. PLoS ONE. 11 (3), 1-15 (2016).
  8. Wang, Y., Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. BMC Biotechnology. 9, 1-8 (2009).
  9. Whittaker, J. W. Cell-free protein synthesis: the state of the art. Biotechnology Letters. 35 (2), 143-152 (2013).
  10. Martin, R. W. Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids. Nature Communications. 9 (1), 1203(2018).
  11. Kwon, Y. C., Song, J. K., Kim, D. M. Cloning-Independent Expression and Screening of Enzymes Using Cell-Free Protein Synthesis Systems. Methods in Molecular Biology. 1118, 97-108 (2014).
  12. Chappell, J., Jensen, K., Freemont, P. S. Validation of an entirely in vitro approach for rapid prototyping of DNA regulatory elements for synthetic biology. Nucleic Acids Research. 41 (5), 3471-3481 (2013).
  13. Takahashi, M. K. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. 86, 60-72 (2015).
  14. Karim, A. S., Jewett, M. C. A cell-free framework for rapid biosynthetic pathway prototyping and enzyme discovery. Metabolic Engineering. 36, 116-126 (2016).
  15. Dudley, Q. M., Anderson, K. C., Jewett, M. C. Cell-Free Mixing of Escherichia coli Crude Extracts to Prototype and Rationally Engineer High-Titer Mevalonate Synthesis. ACS Synthetic Biology. 5 (12), 1578-1588 (2016).
  16. Pardee, K. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
  17. Zawada, J. F. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production-a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and Bioengineering. 108 (7), 1570-1578 (2011).
  18. Sullivan, C. J. A cell-free expression and purification process for rapid production of protein biologics. Biotechnology Journal. 11 (2), 238-248 (2016).
  19. Li, J. Cell-free protein synthesis enables high yielding synthesis of an active multicopper oxidase. Biotechnology Journal. 11 (2), 212-218 (2016).
  20. Heinzelman, P., Schoborg, J. A., Jewett, M. C. pH responsive granulocyte colony-stimulating factor variants with implications for treating Alzheimer's disease and other central nervous system disorders. Protein Engineering Design and Selection. 28 (10), 481-489 (2015).
  21. Pardee, K. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
  22. Slomovic, S., Pardee, K., Collins, J. J. Synthetic biology devices for in vitro and in vivo diagnostics. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (47), 14429-14435 (2015).
  23. Gootenberg, J. S. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 356 (6336), 438-442 (2017).
  24. Pardee, K. Portable, On-Demand Biomolecular Manufacturing. Cell. 167 (1), 248-259 (2016).
  25. Karig, D. K., Bessling, S., Thielen, P., Zhang, S., Wolfe, J. Preservation of protein expression systems at elevated temperatures for portable therapeutic production. Journal of the Royal Society, Interface. 14 (129), (2017).
  26. Smith, M. T., Berkheimer, S. D., Werner, C. J., Bundy, B. C. Lyophilized Escherichia coli-based cell-free systems for robust, high-density, long-term storage. BioTechniques. 56 (4), 186-193 (2014).
  27. Hunt, J. P., Yang, S. O., Wilding, K. M., Bundy, B. C. The growing impact of lyophilized cell-free protein expression systems. Bioengineered. 8 (4), 325-330 (2017).
  28. Stark, J. C. BioBitsTM Bright: A fluorescent synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), (2018).
  29. Huang, A. BioBitsTM Explorer: A modular synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), (2018).
  30. Zemella, A., Thoring, L., Hoffmeister, C., Kubick, S. Cell-Free Protein Synthesis: Pros and Cons of Prokaryotic and Eukaryotic Systems. ChemBioChem. 16 (17), 2420-2431 (2015).
  31. Oza, J. P. Robust production of recombinant phosphoproteins using cell-free protein synthesis. Nature Communications. 6 (1), 8168(2015).
  32. Zemella, A. Cell-free protein synthesis as a novel tool for directed glycoengineering of active erythropoietin. Scientific Reports. 8 (1), 8514(2018).
  33. Jaroentomeechai, T. Single-pot glycoprotein biosynthesis using a cell-free transcription-translation system enriched with glycosylation machinery. Nature Communications. 9 (1), 2686(2018).
  34. Kightlinger, W. Design of glycosylation sites by rapid synthesis and analysis of glycosyltransferases. Nature Chemical Biology. 14 (6), 627-635 (2018).
  35. Schoborg, J. A. A cell-free platform for rapid synthesis and testing of active oligosaccharyltransferases. Biotechnology and Bioengineering. 115 (3), 739-750 (2018).
  36. Chekulayeva, M. N., Kurnasov, O. V., Shirokov, V. A., Spirin, A. S. Continuous-Exchange Cell-Free Protein-Synthesizing System: Synthesis of HIV-1 Antigen Nef. Biochemical and Biophysical Research Communications. 280 (3), 914-917 (2001).
  37. Hong, S. H. Improving Cell-Free Protein Synthesis through Genome Engineering of Escherichia coli Lacking Release Factor 1. ChemBioChem. 16 (5), 844-853 (2015).
  38. Endo, Y., Otsuzuki, S., Ito, K., Miura, K. Production of an enzymatic active protein using a continuous flow cell-free translation system. Journal of Biotechnology. 25 (3), 221-230 (1992).
  39. Volyanik, E. V., Dalley, A., Mckay, I. A., Leigh, I., Williams, N. S., Bustin, S. A. Synthesis of Preparative Amounts of Biologically Active Interleukin-6 Using a Continuous-Flow Cell-Free Translation System. Analytical Biochemistry. 214 (1), 289-294 (1993).
  40. Martin, G. A., Kawaguchi, R., Lam, Y., DeGiovanni, A., Fukushima, M., Mutter, W. High-yield, in vitro protein expression using a continuous-exchange, coupled transcription/ translation system. BioTechniques. 31 (4), 948-950 (2001).
  41. Stech, M., Quast, R. B., Sachse, R., Schulze, C., Wüstenhagen, D. A., Kubick, S. A Continuous-Exchange Cell-Free Protein Synthesis System Based on Extracts from Cultured Insect Cells. PLoS ONE. 9 (5), e96635(2014).
  42. Quast, R. B., Sonnabend, A., Stech, M., Wüstenhagen, D. A., Kubick, S. High-yield cell-free synthesis of human EGFR by IRES-mediated protein translation in a continuous exchange cell-free reaction format. Scientific Reports. 6 (1), 30399(2016).
  43. Thoring, L., Dondapati, S. K., Stech, M., Wüstenhagen, D. A., Kubick, S. High-yield production of "difficult-to-express" proteins in a continuous exchange cell-free system based on CHO cell lysates. Scientific Reports. 7 (1), 11710(2017).
  44. Hoffmann, M., Nemetz, C., Madin, K., Buchberger, B. Rapid translation system: A novel cell-free way from gene to protein. Biotechnology annual review. 10, 1-30 (2004).
  45. Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5 (1), 8663(2015).
  46. Katsura, K. A reproducible and scalable procedure for preparing bacterial extracts for cell-free protein synthesis. Journal of Biochemistry. 162 (June), 357-369 (2017).
  47. Fujiwara, K., Doi, N. Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption. PLoS ONE. 11 (4), 1-15 (2016).
  48. Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing. BioTechniques. 53 (3), 163-174 (2012).
  49. Krinsky, N. A Simple and Rapid Method for Preparing a Cell-Free Bacterial Lysate for Protein Synthesis. PLoS ONE. 11 (10), (2016).
  50. Jewett, M. C., Swartz, J. R. Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis. Biotechnology and Bioengineering. 86 (1), 19-26 (2004).
  51. Swartz, J. R., Jewett, M. C., Woodrow, K. A. Cell-Free Protein Synthesis With Prokaryotic Combined Transcription-Translation. Recombinant Gene Expression. (267), 169-182 (2004).
  52. Voloshin, A. M., Swartz, J. R. Efficient and scalable method for scaling up cell free protein synthesis in batch mode. Biotechnology and Bioengineering. 91 (4), 516-521 (2005).
  53. Vernon, W. B. The role of magnesium in nucleic-acid and protein metabolism. Magnesium. 7 (5-6), 234-248 (1988).
  54. Pratt, J. M. Transcription and Translation: A Practical Approach. , IRL Press. New York. (1984).
  55. Kim, D. M., Kigawa, T., Choi, C. Y., Yokoyama, S. A Highly Efficient Cell-Free Protein Synthesis System from Escherichia coli. European Journal of Biochemistry. 239 (3), 881-886 (1996).
  56. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4 (1), 8(2010).
  57. Zubay, G. In Vitro Synthesis of Protein in Microbial Systems. Annual Review of Genetics. 7 (1), 267-287 (1973).
  58. Kigawa, T. Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression. Journal of Structural and Functional Genomics. 5 (1/2), 63-68 (2004).
  59. Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia Coli S30 Extract Preparation for Economical Cell-Free Protein Synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2008).
  60. Yang, W. C., Patel, K. G., Wong, H. E., Swartz, J. R. Simplifying and streamlining Escherichia coli-based cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 28 (2), 413-420 (2012).
  61. Foshag, D. The E. coli S30 lysate proteome: A prototype for cell-free protein production. New Biotechnology. 40 (Pt B), 245-260 (2018).
  62. Caschera, F. Bacterial cell-free expression technology to in vitro systems engineering and optimization. Synthetic and Systems Biotechnology. 2 (2), 97-104 (2017).
  63. Chizzolini, F., Forlin, M., Yeh Martín, N., Berloffa, G., Cecchi, D., Mansy, S. S. Cell-Free Translation Is More Variable than Transcription. ACS Synthetic Biology. 6 (4), 638-647 (2017).
  64. Hong, S. H., Kwon, Y. C., Jewett, M. C. Non-standard amino acid incorporation into proteins using Escherichia coli cell-free protein synthesis. Frontiers in Chemistry. 2, 34(2014).
  65. Sawasaki, T., Ogasawara, T., Morishita, R., Endo, Y. A cell-free protein synthesis system for high-throughput proteomics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (23), 14652-14657 (2002).
  66. Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free metabolic engineering: Biomanufacturing beyond the cell. Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).
  67. Garcia, D. C. Elucidating the potential of crude cell extracts for producing pyruvate from glucose. Synthetic Biology. 3 (1), 1-9 (2018).
  68. Hurst, G. B. Proteomics-Based Tools for Evaluation of Cell-Free Protein Synthesis. Analytical Chemistry. 89 (21), 11443-11451 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

E coli extractlysis op basis van sonicatieeiwitexpressiecentrifugeringsprotocolSuperfolder GFPmagnesiumtitratieDNA purificatiereactieopstellingfluorometeranalyse

Gerelateerde artikelen