Methodenartikel

Expansie van twee-dimensie Electrospun Nanofiber matten in de steigers van de drie-dimensie

6.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58918

⸱

7 januari 2019

 ,  ,  , 
1Department of Surgery-Transplant and Mary & Dick Holland Regenerative Medicine Program, University of Nebraska Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel demonstreert de techniek van het uitbreiden van een traditionele, twee-dimensie (2D) electrospun nanofiber mat in een drie-dimensie (3D) steiger door de drukverlaging subkritische CO2 vloeistof. Deze augmented steigers zijn 3D, nauw mimic cellulaire nanotopographic signalen, en het behoud van de functies van biologische moleculen ingekapseld binnen de nanofibers.

Samenvatting

Electrospinning is de gewenste technologie in het produceren van een synthetische, functionele Steiger als gevolg van de biomimicry extracellulaire matrix en de bestrijding van het gemak van samenstelling, structuur en diameter van vezels. Echter, ondanks deze voordelen, traditionele electrospun nanofiber steigers komen met beperkingen waaronder ongeorganiseerd nanofiber oriëntatie, lage porositeit, kleine poriegrootte en vooral tweedimensionale matten. Als zodanig, is er een grote behoefte aan de ontwikkeling van een nieuw proces voor het fabriceren van electrospun nanofiber steigers die de bovenstaande beperkingen kunnen overwinnen. Hierin is een nieuwe en eenvoudige methode geschetst. Een traditionele 2D nanofiber mat wordt omgezet in een 3D steiger met gewenste dikte, kloof afstand, porositeit en nanotopographic signalen voor cel zaaien en proliferatie door de drukverlaging subkritische CO2 vloeistof. Naast het bieden van een steiger voor weefselregeneratie optreden, biedt deze methode ook de mogelijkheid om in te kapselen bioactieve moleculen zoals antimicrobiële peptiden voor lokale drug delivery. De CO2 uitgebreid nanofiber steigers houden groot potentieel in weefselregeneratie, wondgenezing, 3D weefsel modellering en actuele drug delivery.

Inleiding

Het concept van de ontwikkeling van een synthetische steiger die kan worden geïmplanteerd in patiënten om hulp bij het weefselherstel en regeneratie is dat het gebied van regeneratieve geneeskunde voor decennia heeft doordrongen. De ideale synthetische steiger serveert voor het opwekken van cel migratie vanuit het omliggende gezonde weefsel, biedt een architectuur voor cel zaaien, hechting, signalering, proliferatie en differentiatie, ondersteunt vascularisatie, voorziet in voldoende oxygenatie en voeding levering, en host immuun activiteit om succes te verzekeren na implantatie1bevordert. Bovendien, kan het worden gebruikt als drager voor het insluiten van antimicrobiële moleculen bij wond genezing van1,3,6,7,8,9. De mogelijkheid om controle van de temporele vrijlating van deze biologische moleculen uit de synthetische steiger is een ander gewenst kenmerk dat wordt beschouwd als wanneer engineering steigers1.

Electrospinning is een goed benutte techniek voor het produceren van nanofiber steigers1,2,3,4,5,6. Eerdere pogingen om te maken van een steiger van de nanofiber zoals de hier besproken zijn gedaan met wisselend succes. Traditionele nanofiber steigers hebben echter slechts beperkt capaciteiten om deze doelen te bereiken. Traditionele nanofiber steigers zijn meestal twee-dimensionale matten1,3. Deze nonexpanded steigers zijn dichtbevolkte vol met kleine porie maten; Dit beperkt cel infiltratie, migratie en differentiatie als het is niet bevorderlijk voor een omgeving die vergelijkbaar genoeg zijn met die gevonden in vivo1,7,8,9. Om deze reden zijn de nieuwere technieken van 3D electrospun nanofiber steiger voorbereiding vastgesteld tot wijziging van de inherente gebreken die met 2D nanofiber matten komen. Deze technieken resulteren in 3D steigers; ze hebben echter slechts beperkt toepasbaarheid te wijten aan de productiemethoden die een waterige oplossing vereisen en trekkers van procedures. Deze verwerking resulteert in de willekeurige verdeling van de nanofibers zonder beperkte organisatie, de juiste dikte, en/of de gewenste porositeit te bieden van de adequate nanotopographic signalen die nodig voor cel migratie en proliferatie zijn. Deze factoren leiden tot de vorige 3D electrospun nanofiber steigers die geen voldoende mimicry van levende weefsels1,,7,,8,9.

Meer recente pogingen tot ontwikkeling van een uitgebreide, 3D steiger met betere biomimicry van extracellulaire matrix (ECM) zijn uitgevoerd met behulp van een waterige natrium natriumboorhydride (NaBH4) oplossing behandeling en vooraf ontworpen mallen om te helpen bij een betere controle van de vorm van de daaruit voortvloeiende steigerwerk7,8. Deze methode is echter niet ideaal aangezien het vereist het gebruik van waterige oplossingen, chemische reacties en trekkers die kan interfereren met polymeren en een ingekapselde biomoleculen die oplosbaar is in water. De gebruikte additieven kunnen ook bijwerkingen veroorzaken tijdens weefsel regeneratie8,9. De CO2 expansie methode in dit artikel beschreven sterk vermindert de verwerkingstijd, elimineert de noodzaak voor waterige oplossingen en behoudt het bedrag en de functionaliteit van biologisch actieve moleculen in grotere mate dan de eerder gevestigde methodes9.

In eerdere studies, antibiotica, zilver, 1α, 25 dihydroxyvitamin D3en antimicrobiële peptide werden LL-37 geladen in de steigers van nanofiber individueel als in combinatie te onderzoeken van het potentieel van deze steigers agenten vrijgeven verdere steun in de wond genezing9,10,12,13. Om aan te tonen deze methode van nanofiber steiger expansie, zal de Coumarine 6, een fluorescente kleurstof, in de steiger om aan te tonen van het potentieel van de steiger te embedding met diverse gewenste verbindingen worden geladen. Deze methode van uitgebreide nanofiber steiger fabricage in combinatie met ingekapselde bioactieve moleculen houdt groot potentieel in weefselregeneratie, wondgenezing, het maken van 3D weefsel modellen en de actuele levering van drugs.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle in vivo procedures zoals hieronder beschreven werden goedgekeurd door het Comité van de IACUC aan de Universiteit van Nebraska Medical Center.

1. Prepareer de oplossingen voor standaard Electrospinning

  1. Los in een glazen buis van 20 mL, 2 g poly(ε-caprolactone) (PCL, Mw = 80 kDa) in een oplosmiddel mengsel van dichloormethaan (DCM) en N, N-dimethylformamide (DMF) met een rantsoen van 4:1 (v/v) met een concentratie van 10% (m/v).
    Let op: Ingang DCM en DMF in een goed geventileerde kap om te voorkomen dat blootstelling aan rook. DCM niet blootstellen aan kunststoffen.
  2. Plaats de glazen buis in een lab rotator totdat de oplossing duidelijk wordt. De oplossing kan 's nachts mengen.
  3. Als plan inbedden van bioactieve materialen zoals peptiden of drugs in de steiger, maak een aparte oplossing en sla bij de 4 ° C tot klaar voor gebruik.
    1. Bereid de oplossing met fluorescente kleurstof (50 mg/mL) met behulp van 20 mL PCL-oplossing.

2. instellen van het Electrospinning apparaat (figuur 1A)

  1. Voeg de PCL-oplossing aan een 20 mL spuit met een 21 meter botte naald verbonden. Zorg ervoor dat er geen lucht in de spuit en de bijbehorende leidingen.
  2. Plaats een roterende trommel staal met de grond collector 12 cm vanaf de punt van de naald.
  3. Alligator clips gebruiken, de voeding van de High Voltage Direct Current (DC) sluit aan op de naald en ervoor zorgen dat de collector is geaard.
    Let op: Zet altijd uit de voeding aan voordat de behandeling verbonden materialen.

3. Electrospinning

  1. Voor de 20 mL van PCL-oplossing, als volgt de parameters van de spuitpomp instellen: diameter = 20.27 mm, debiet = 0,5 mL/h. Check als de druppels op het puntje van de naald vormen.
  2. Indien de opneming van biologische actieve moleculen is gewenst, ingesteld het apparaat dat voor co-axiale electrospinning (figuur 1B). Maak een aangepaste coaxiale mondstuk met behulp van injectienaalden.
    Opmerking: Dergelijke sproeiers zijn ook beschikbaar commercieel. Merk op dat een oplossing van kleurstof is bereid te simuleren de toevoeging van dergelijke moleculen.
    1. Bereid een 1%-oplossing van de fluorescente kleurstof cumarine 6 in water. Voeg 3 mL van de 1% kleurstof aan een kleine injectiespuit. De spuit verbinden met de verstuiver hetzelfde coaxiale als de PCL-oplossing. Nogmaals, zorg ervoor dat er geen luchtbellen.
    2. Voor deze 3 mL oplossing, stel de parameters van de spuitpomp als volgt: diameter = 9.49 mm, debiet = 0,02 mL/h. Check als de druppels op het puntje van de naald vormen.
  3. Toepassen van een elektrische potentiaal van 20 kV tussen de spinneret (22-gauge naald) en een verzamelaar van grond gelegen 20 cm afstand van de spinneret. Verzamel de uitgelijnde nanofiber matten in een trommel draaien op 2.000 toeren per minuut. Verzamel de PCL-nanofiber matten zodra ze een dikte van ~ 1 mm bereiken.

4. generatie van PCL Nanofiber Mats gekleed rijggat.

  1. Fabriceren PCL nanofiber matten.
    1. Ontbinden PCL kralen in een oplosmiddel mengsel bestaande uit DCM en DMF met een verhouding van 4:1(v/v) bij een concentratie van 10% (PCL) (m/v). Pomp de PCL-oplossing op een debiet van 0,7 mL/h met gebruikmaking van een spuitpomp terwijl een potentieel van 20 kV wordt toegepast tussen de spinneret (een naald van 22-pand) en een geaarde verzamelaar gelegen 12 cm naast de spinneret.
    2. Het verzamelen van het membraan van de nanofiber met behulp van een draaiende trommel met een roterende snelheid groter dan 500 rpm.
  2. De PCL-nanofiber matten in vloeistof N2 gedurende 5 min. onderdompelen (dwz., stijf geworden). Houd de PCL-nanofiber matten in vloeistof N2 en PCL nanofiber matten met een 0.5 mm-diameter punch punch.

5. uitbreiding van 2D Nanofiber matten met/zonder gekleed gaten via subkritische CO2 vloeistof (figuur 2).

  1. Plaats de PCL-nanofiber matten in vloeibare stikstof voor 5 min en snijd in 1 x 1 cm vierkantjes met behulp van scherpe chirurgische schaar terwijl ondergedompeld in vloeibare stikstof te vermijden vervorming van de randen.
  2. Plaats de gesneden mat in een centrifugebuis 30 mL met ~ 1 g droog ijs. Strak cap van het deksel en voorzien van het droogijs in vloeibare CO2te veranderen.
  3. Eenmaal vloeistof heeft gevormd in de buis, vrij snel de druk door het openen van het GLB.
    Let op: Gebruik juiste Thermische beschermende kleding bij werken met vloeibare stikstof en droogijs. De onder druk staande buis richting het gezicht wordt niet geopend. De centrifugebuis mag niet herhaaldelijk worden gebruikt.
  4. Verwijder en observeren de gepofte steiger uit de buis. Plaats de steiger in een nieuwe centrifugebuis met droogijs en herhaal tot de gewenste dikte is bereikt. Het steriliseren van de steigers van de uitgebreide nanofiber in ethyleenoxide vóór incubatie met cellen.

6. karakterisering van uitgebreide Nanofiber steigers

  1. Karakteriseren de morfologie en de structuur van de steigers van de uitgebreide nanofiber met behulp van scanning elektronen microscopie (SEM).
    1. Leg de monsters met dubbelzijdige geleidende tape aan de metalen stud en jas met platina voor 40 s met behulp van een sputter coater bij 40 mA.
    2. Onderzoeken van de vezels met behulp van SEM volgens eerdere studies9. Verzamelen van de beelden op een versnellende spanning van 15 kV.
  2. Karakteriseren in vitro release profielen en topicale van vrijgegeven peptiden.
    1. Gewicht 10 mg nanofiber membranen vóór en na de uitbreiding in CO2.
    2. De monsters in PBS buffer onderdompelen en het verzamelen van 10 μL van de bovendrijvende substantie op verschillende tijdstippen (0-28 dagen).
    3. Gebruik Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) kit te kwantificeren van de LL-37 peptide concentratie in het verzamelde supernatant.
  3. Onderzoeken van cellulaire infiltratie in vivo en host reactie.
    1. Zet de 9 - weken oude ratten Sprague-Dawley (SD) in een zaal van de verdoving, verbinden met Isofluraan damp en anesthetize van de ratten. Overbrengen in de rats een operatietafel nadat de ratten volledige verdoving zonder gevoelens geworden. Continu anesthetize de ratten met behulp van een Isofluraan-neus met vaporizer tijdens de operatie. De haren van rat de rug door het dier scheerapparaat te scheren en het steriliseren met jodium en alcohol huid scrub. Subcutane zakken via 1,5 cm incisies maken op supraspinal sites op het dorsum met behulp van een scalpel.
    2. Een uitgebreide nanofiber steiger (1.5 mm dik) in de subcutane zak met pincet voor elke snede invoegen. Sluit de incisie met behulp van een nietmachine.
    3. Op 1 euthanaseren 2 en 4 weken, de ratten met 95% CO2. Zachtjes ontleden de explant en het omringende weefsel met behulp van chirurgische scharen. Het weefsel in formaline onderdompelen gedurende ten minste 3 dagen vóór de histologische analyse, en vervolgens insluiten met parafin. Afdeling van het weefsel met een microtoom, dan voer haematoxyline en eosine (H & E), van Masson trichrome kleuring.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De werkzaamheid van traditionele 2D electrospun nanofiber matten uitbreiden naar 3D steigers via drukverlaging subkritische CO2 vloeistof werd aangetoond in verschillende capaciteiten: de dikte van de steigers verhoogd van 1 mm wanneer onbehandeld tot 2.5 mm en 19,2 mm met één en twee CO2 behandelingen, respectievelijk (figuur 3A-C). Het kenmerk porositeit-a van de architectuur van essentieel belang is voor de cel zaaien...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het omzetten van traditionele 2D electrospun nanofiber matten in uitgebreide 3D steigers via CO2 drukverlaging werd onderzocht. Traditionele 2D nanofiber matten zijn met succes uitgebreide via subkritische CO2 vloeistof. De kritische stappen zijn de matten knippen zonder vervormen de randen te fabriceren 2D nanofiber matten onder een geoptimaliseerde voorwaarde (bv. met behulp scherpe chirurgische schaar). Deze CO2-uitgebreide nanofiber steigers hebben vele voor...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Auteurs verklaren dat er geen conflict van belang is.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door subsidies van het nationale Institute of General Medical Science (NIGMS) op de NIH (2P 20 GM103480-06 en 1R01GM123081 naar J.X.), de Otis Glebe Medical Research Foundation, NE LB606 en opstarten van fondsen van de Universiteit van Nebraska Medical, Inc. Centrum.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
PolycaprolactoneSigma-Aldrich440744
N,N-DimethlyformamideFisher ChemicalD-199-1
DichloromethaneFisher ChemicalAC61093-1000
Coumarin 6Sigma-Aldrich546283
Rotating Steel DrumcustomizedDit dient als verzamelaar tijdens het elektrospinnen.
Syringe PumpFisher Scientific14-831-200Coaxiale spinning vereist twee enkele spuitpompen.
RevolverLab Net InternationalH5600Instelbare labrotator voor het mengen van oplossingen
Hypodermic Needle (27G x 1 1/2")EXCELINT International Co26426Dit is onderdeel van de voorbeeld aangepaste coaxiale nozzel getoond.
Hypodermic Needle (21G x 1 1/2")EXCELINT International Co26416Dit is onderdeel van de voorbeeld aangepaste coaxiale nozzel getoond.
High Voltage DC Power SupplyGamma High Voltage ResearchES30
Scanning Electron MicroscopeFEINova 2300
Fluorescence MicroscopeZeissAxio Imager 2
LL 37 ELISA KitHycult BiotechHK321-02

Referenties

  1. Chen, S., et al. Recent advances in electrospun nanofibers for wound healing. Nanomedicine. 12 (11), 1335-1352 (2017).
  2. Khandalavala, K., Jiang, J., Shuler, F. D., Xie, J. Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization. Journal of Visualized Experiments. (98), e52626(2015).
  3. Xie, J., Li, X., Xia, Y. Put electrospun nanofibers to work for biomedical research. Macromolecular Rapid Communication. 29 (22), 1775-1792 (2008).
  4. Xie, J., et al. Nanofiber membranes with controllable microwells and structural cues and their use in forming cell microarrays and neuronal networks. Small. 7 (3), 293-297 (2011).
  5. Xie, J., et al. Radially aligned, electrospun nanofibers as dural substitutes for wound closure and tissue regeneration applications. ACS. 4 (9), 5027-5036 (2010).
  6. Xie, J., et al. "Aligned-to-random" nanofiber scaffolds for mimicking the structure of the tendon-to-bone insertion site. Nanoscale. 2 (6), 923-926 (2010).
  7. Jiang, J., et al. Expanded 3D Nanofiber Scaffolds: Cell Penetration. Neovascularization, and Host Response. Advanced Healthcare Materials. 5 (23), 2993-3003 (2016).
  8. Jiang, J., et al. Expanding Two-Dimensional Electrospun Nanofiber Membranes in the Third Dimension by a Modified Gas-Foaming Technique. ACS Biomaterials Science & Engineering. 10 (1), 991-1001 (2015).
  9. Jiang, J., et al. CO2-expanded nanofiber scaffolds maintain activity of encapsulated bioactive materials and promote cellular infiltration and positive host response. Acta Biomaterialia. 68, 237-248 (2018).
  10. Chen, S., et al. Nanofiber-based sutures induce endogenous antimicrobial peptide. Nanomedicine. 12 (10), 2597-2609 (2017).
  11. Dhand, C., et al. Bio-inspired crosslinking and matrix-drug interactions for advanced wound dressings with long-term antimicrobial activity. Biomaterials. 138, 153-168 (2017).
  12. Jiang, J., et al. Local sustained delivery of 25-hydroxyvitamin D3 for production of antimicrobial peptides. Pharmaceutical Research. 32 (9), 2851-2862 (2015).
  13. Jiang, J., et al. 1α, 25-dihydroxyvitamin D3-eluting nanofibrous dressings induce endogenous antimicrobial peptide expression. Nanomedicine (Lond). 13 (12), 1417-1432 (2018).
  14. Ma, B., Xie, J., Jiang, J., Shuler, F. D., Bartlett, D. E. Rational design of nanofiber scaffolds for orthopedic tissue repair and regeneration. Nanomedicine. 8 (9), 1459-1481 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Fabricage van 3D scaffoldssubkritische CO2 expansiebereiding van polymeeroplossinginstallatie van elektrospinning apparaatverwerking met vloeibare stikstofbehandeling met droogijsanalyse van scaffold porositeitcelzaai proliferatieinkapseling van bioactieve moleculen

Gerelateerde artikelen