Een High-throughput Assay voor de voorspelling van de chemische toxiciteit door geautomatiseerde fenotypische profilering van Caenorhabditis elegans

Samenvatting

Een kwantitatieve methode is ontwikkeld om te identificeren en te voorspellen van de acute toxiciteit van chemische stoffen door het automatisch analyseren de fenotypische profilering van Caenorhabditis elegans. Dit protocol wordt beschreven hoe behandelen van wormen met chemicaliën in een 384-well-plate, vastleggen van video's en kwantificeren van toxicologische verwante fenotypen.

Samenvatting

Het toepassen van toxiciteit van chemische stoffen in hogere orde organismen, zoals muizen of ratten, is tijdrovend en duur, als gevolg van hun lange levensduur en onderhoud kwesties. Integendeel, de nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) heeft voordelen zodat het een ideale keuze voor toxiciteitstests: een korte levensduur, gemakkelijke teelt en efficiënte reproductie. Hier beschrijven we een protocol voor de automatische fenotypische profilering van C. elegans in een 384-well-plate. De nematode wormen zijn gekweekt in een 384-well plaat met vloeibare middellange en chemische behandeling en video's zijn genomen van elk putje te kwantificeren van de chemische invloed op 33 worm functies. Experimentele resultaten aantonen dat de gekwantificeerde fenotype functies kunnen classificeren en voorspellen van de acute toxiciteit voor verschillende chemische verbindingen en een prioriteitenlijst op met voor meer traditionele chemische toxiciteit assessment tests in een knaagdier model stelt.

Inleiding

Samen met de snelle ontwikkeling van chemische verbindingen die zijn toegepast op de industriële productie en het dagelijks leven van mensen, is het belangrijk om te bestuderen van de toxiciteit van de modellen voor de chemische stoffen. In veel gevallen is het knaagdier diermodel aangewend om te evalueren van de potentiële toxiciteit van verschillende chemische stoffen op de gezondheid. In het algemeen, wordt de bepaling van de letale concentratie (dat wil zeggen, de getest 50% letale dosis [LD50] van verschillende chemische stoffen) gebruikt als de traditionele parameter in een in vivo knaagdier (rat/muis)-model dat is tijdrovend en zeer duur. Bovendien, als gevolg ....

Protocol

Het protocol volgt de richtsnoeren van de verzorging van de dieren van de dier-ethische commissie van de Peking-centrum voor ziektepreventie en -bestrijding in China.

1. chemische preparaten

1. Verkrijgen chemicaliën (tabel 1 en Tabel van materialen).
2. Het bepalen van de hoogste en de laagste dosering van de afzonderlijke chemische stoffen voor een minimumconcentratie van 100% letaliteit (LC100, 24 uur per dag) en een maximale concentratie van 100% nonlethality (LC0, 24 h) voor wormen. Het gebruik van ten minste zes verdunningen van de hoogste concentratie (tabel 1).
   Opme....

Resultaten

We hebben de fenotypen van wormen blootgesteld aan verschillende concentraties van meer dan 10 chemische stoffen¹²getest. In de test, werden 33 verschillende functies gekwantificeerd voor elke chemische verbinding op drie tijdstippen (0 h, 12 h en 24 h). Eerder, werd een vergelijking tussen een handleiding en een automatische analyse van een levensduur test gedaan^11,12. In deze test vonden we dat chemische .......

Discussie

De voordelen van C. elegans hebben geleid tot het toenemende gebruik ervan in de toxicologie⁹, zowel voor mechanistische studies en high-throughput screening benaderingen. Een grotere rol voor C. elegans in aanvulling op andere modelsystemen in toxicologisch onderzoek is opmerkelijk in de afgelopen jaren, met name voor de beoordeling van de snelle toxiciteit van nieuwe chemicaliën. Dit artikel bevat een nieuwe bepaling van hoge-doorvoer, kwantitatieve screening van worm fenotypen.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2-Propanol	Sigma-Aldrich	59300
384-well plates	Throme	142761
Agar	Bacto	214010
Atropine sulfate	Sigma-Aldrich	PHL80892
Bleach buffer			0.5 mL van 10 M NaOH, 0.5 mL van 5% NaClO, 9 mL ultrapuur water
Cadmium chloride	Sigma-Aldrich	202908
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	21074
CCD camera	Zeiss	AxioCam HRm	Zeiss microscopy GmbH
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667
Copper(II) sulfate	Sigma-Aldrich	451657
Ethanol	Sigma-Aldrich	24105
Ethylene glycol	Sigma-Aldrich	324558
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
K-Medium			3,04 g NaCl en 2,39 g KCl in 1 L ultrapuur water
LB Broth			10 g/L Tryptone, 5 g/L Gistextract, 5 g/L NaCl
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	63140
NGM Plate			3 g NaCl, 17 g agar, 2,5 g peptone in 1 L ultrapuur water, voeg na autoclaveren 1 mL cholesterol toe (5 mg/mL in ethanol), 1 mL MgSO4 (1 M), 1 mL CaCl2 (1 M), 25 mL PPB buffer
Peptone	Bacto	211677
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	60130
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	795496
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	795488
PPB buffer			35,6 g van K2HPO4, 108,3 g van KH2PO4 in 1 L ultrapuur water
shaker	ZHICHENG	ZWY-200D
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	71382
Sodium fluoride	Sigma-Aldrich	s7920
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	71690
Sodium hypochlorite solution	Sigma-Aldrich	239305
The link of program			https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate
Tryptone	Sigma-Aldrich	T7293
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1625
Zeiss automatic microscope	Zeiss	AXIO Observer.Z1	Zeiss automatische microscoop met eigen software Zen2012 en charge-coupled device (CCD) camera