Een High-throughput Assay voor de voorspelling van de chemische toxiciteit door geautomatiseerde fenotypische profilering van Caenorhabditis elegans

Samenvatting

Een kwantitatieve methode is ontwikkeld om te identificeren en te voorspellen van de acute toxiciteit van chemische stoffen door het automatisch analyseren de fenotypische profilering van Caenorhabditis elegans. Dit protocol wordt beschreven hoe behandelen van wormen met chemicaliën in een 384-well-plate, vastleggen van video's en kwantificeren van toxicologische verwante fenotypen.

Samenvatting

Het toepassen van toxiciteit van chemische stoffen in hogere orde organismen, zoals muizen of ratten, is tijdrovend en duur, als gevolg van hun lange levensduur en onderhoud kwesties. Integendeel, de nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) heeft voordelen zodat het een ideale keuze voor toxiciteitstests: een korte levensduur, gemakkelijke teelt en efficiënte reproductie. Hier beschrijven we een protocol voor de automatische fenotypische profilering van C. elegans in een 384-well-plate. De nematode wormen zijn gekweekt in een 384-well plaat met vloeibare middellange en chemische behandeling en video's zijn genomen van elk putje te kwantificeren van de chemische invloed op 33 worm functies. Experimentele resultaten aantonen dat de gekwantificeerde fenotype functies kunnen classificeren en voorspellen van de acute toxiciteit voor verschillende chemische verbindingen en een prioriteitenlijst op met voor meer traditionele chemische toxiciteit assessment tests in een knaagdier model stelt.

Inleiding

Samen met de snelle ontwikkeling van chemische verbindingen die zijn toegepast op de industriële productie en het dagelijks leven van mensen, is het belangrijk om te bestuderen van de toxiciteit van de modellen voor de chemische stoffen. In veel gevallen is het knaagdier diermodel aangewend om te evalueren van de potentiële toxiciteit van verschillende chemische stoffen op de gezondheid. In het algemeen, wordt de bepaling van de letale concentratie (dat wil zeggen, de getest 50% letale dosis [LD50] van verschillende chemische stoffen) gebruikt als de traditionele parameter in een in vivo knaagdier (rat/muis)-model dat is tijdrovend en zeer duur. Bovendien, als gevolg van de verminderen, verfijnen of vervangen (3R)-beginsel dat is essentieel voor het welzijn van dieren en ethiek, nieuwe methoden waarmee voor de vervanging van hogere dieren zijn waardevol voor wetenschappelijk onderzoek^1,2,3 . C. elegans is een free-living nematode die geïsoleerd uit bodem is. Het heeft grote schaal gebruikt als een organisme onderzoek in het laboratorium vanwege zijn gunstige kenmerken, zoals een korte levensduur, gemakkelijke teelt en efficiënte reproductie. Daarnaast worden vele fundamentele biologische paden, met inbegrip van fundamentele fysiologische processen en stress reacties in C. elegans, bewaard in hogere zoogdieren^{4,5,6,7 , 8}. in een aantal vergelijkingen die wij en anderen hebben gedaan, er is een goede overeenstemming tussen C. elegans toxiciteit en toxiciteit bij knaagdieren⁹waargenomen. Dit alles maakt C. elegans een goed model voor het testen van de effecten van chemische toxicities in vivo.

Sommige studies gekwantificeerd onlangs, de fenotypische kenmerken van C. elegans. De functies kunnen worden gebruikt om de toxicities van^3,10 van de^2,van de chemische stoffen en de veroudering van wormen¹¹te analyseren. Ook ontwikkelden we een methode die een vloeibaar worm culturing systeem en een analysesysteem combineert, waarin de wormen gekweekt in een 384-well plaat onder verschillende chemische behandelingen^{12 zijn}. Deze kwantitatieve techniek heeft ontwikkeld om te analyseren automatisch de 33 parameters van C. elegans na 12-24h van chemische behandeling in een 384-well plaat met vloeistof. Een geautomatiseerde Microscoop stadium wordt gebruikt voor experimentele video acquisitie. De video's worden verwerkt door een speciaal ontworpen programma en 33 kenmerken in verband met de wormen bewegende gedrag worden gekwantificeerd. De methode wordt gebruikt om te kwantificeren van de worm fenotypen onder de behandeling van 10 verbindingen. Uit de resultaten blijkt dat verschillende toxicities als de fenotypen van C. elegans veranderen kunnen. Deze gekwantificeerde fenotypen kunnen worden gebruikt voor het identificeren en voorspellen van de acute toxiciteit van verschillende chemische verbindingen. Het algemene doel van deze methode is de observatie en fenotypische kwantificering van experimenten met C. elegans in een vloeibare cultuur te vergemakkelijken. Deze methode is nuttig voor de toepassing van C. elegans in chemische toxiciteit evaluaties en fenotype ondermeer, die helpen bij het voorspellen van de acute toxiciteit van verschillende chemische verbindingen en stelt een prioriteitenlijst op met voor meer traditionele de tests van de beoordeling van het chemische toxiciteit in een knaagdier model. Bovendien, kan deze methode worden toegepast om de toxiciteit screening en het testen van nieuwe chemische producten of de verbinding als het voedsel additieve agent verontreiniging, pharmacautical verbindingen, milieu exogene stof, enzovoort.

Protocol

Het protocol volgt de richtsnoeren van de verzorging van de dieren van de dier-ethische commissie van de Peking-centrum voor ziektepreventie en -bestrijding in China.

1. chemische preparaten

1. Verkrijgen chemicaliën (tabel 1 en Tabel van materialen).
2. Het bepalen van de hoogste en de laagste dosering van de afzonderlijke chemische stoffen voor een minimumconcentratie van 100% letaliteit (LC100, 24 uur per dag) en een maximale concentratie van 100% nonlethality (LC0, 24 h) voor wormen. Het gebruik van ten minste zes verdunningen van de hoogste concentratie (tabel 1).
   Opmerking: Voeren een voorontwerp worm letaliteit test⁹ om te verkennen LC100 en LC0 voor een nieuwe chemische stof, om te bepalen van de dosering.
3. Verdun elke chemische stof met K-medium (Tabel of Materials) tot 2 x de vereiste concentratie. Gebruik K-medium als een besturingselement te vergelijken het fenotype veranderingen veroorzaakt door de chemische stoffen.
   1. Bijvoorbeeld, bereiden 7 kleurovergang concentraties cadmium chloride (CdCl₂) (tabel 1). Te bereiden 2 x de hoogste geconcentreerde waterige oplossing (4.64 mg/mL), los 92.8 mg CdCl₂ stevige poeder in K-medium 8 mL en vul aan tot 10 mL nadat het poeder volledig is opgelost. De andere concentraties bereid door verdunning met K-medium.
4. Acht parallelle wells voorbereiden op elke concentratie in de chemische verloop. Elk bevat goed 50 µL van de 2 x chemische oplossing. Bereiden ten minste drie groepen van acht parallelle putten voor K-medium als besturingselementen (tabel 2).
   Opmerking: In het kort, een volume van 500 µL van 2 x werkoplossing is nodig voor een enkelvoudige dosis van elke chemische stof.

2. worm voorbereiding

1. Wild-type N2 wormen en Escherichia coli OP50 stammen uit de Caenorhabditis genetica Center (CGC) verkrijgen.
2. Gesynchroniseerde L4 wormen krijgen.
   1. Kies een één kolonie van E. coli OP50 van de streak plaat. Aseptisch enten van de kolonie in 100 mL van de pond-Bouillon en groeien het 's nachts bij 37 ° C.
      Opmerking: De E. coli OP50 oplossing is nu klaar voor het zaaien aan nematode groei medium (NGM, Tabel of Materials) platen.
   2. Giet NGM in een 90 mm plastic Petri plaat. Beënt elke plaat met 300 µL van E. coli OP50 oplossing, de dag na het gieten. Incubeer N2 wormen op de NGM platen met OP50 bij 20 ° C gedurende ongeveer 2-3 dagen totdat allermeest naar de wormen hebben het volwassen stadium bereikt.
   3. Oogst gravid wormen in een 15 mL steriele conische centrifugebuis met steriele H₂O. Laat de wormen settelen gedurende ten minste 2 minuten, gecombineerd de H₂O en voeg 5 mL bleekwater buffer (Tabel van materialen).
   4. Vortex de buis gedurende 5 minuten, draai de buis voor 30 s (bij 1300 x g) pellet van de eieren, en verwijder het supernatant.
   5. Wassen de eieren met 5 mL steriele H₂O en vortex de buis voor 5 s. Centrifugeer de buis gedurende 30 s (bij 1300 x g), verwijder het supernatant en wassen opnieuw.
   6. Pipetteer de eieren op een nieuwe NGM bord met OP50. Incubeer hen bij 20 ° C. Monitor de gearceerde L1 de volgende ochtend wormen; de wormen zullen de L4 stadium in ongeveer 40 h bereiken.
3. Wassen van de L4 wormen uit de 90 mm Petri platen met K-medium in een 50 mL steriele conische buis. Aanpassen van de concentratie van wormen ~ 40 dieren per 100 µL van K-medium onder een stereomicroscoop. Voeg 50 µL (~ 20 worms) in elk putje van de plaat 384-well. Deze gesynchroniseerde wormen (L4 fase) zijn klaar voor de volgende behandeling door chemische stoffen.

3. chemische behandeling en de video vangen

Opmerking: In een 384-well plaat, wormen (50 µL in elk putje) worden getrakteerd op zes tot zeven doseringen van een afzonderlijke chemische stof (tabel 1). Bereiden acht parallelle wells, elk met 50 µL van de 2 x chemische oplossing voor elke dosering (acht putjes zijn gevuld met dezelfde chemische en dezelfde concentratie, tabel 2). Alle video's zijn verzameld met behulp van een digitale camera die is aangesloten op een omgekeerde Microscoop (Tabel van materialen). De chemische behandeling experiment duurt 24 h. Voeg geen bacteriële voedsel aan elk putje tijdens het experiment van de chemische behandeling 24 h.

1. Voordat u de chemicaliën toevoegt, stelt u de 384-well plaat met de gesynchroniseerde wormen het automatische werkgebied en video's van elk putje met de geprogrammeerde overname procedure te nemen (7 frames per seconde voor 2 s; duurt ~ 25 min voor het scannen van elke plaat).
2. Voeg 50 µL van de 2 x chemische voorraad bereid volgens paragraaf 1 voor elk putje (tabel 2). De tijd instellen als het punt 0 h.
3. Incubeer de 384-well plaat bij 20 ° C staan en schud nu het bij 80 omwentelingen per minuut in een incubator shaker.
4. Verwijderen de plaat uit de incubator en overbrengen naar een automatische stadium. Video's van elk putje van de hele plaat, 12 uur en op 24 h, nemen om te controleren de fenotypen van de wormen voor elke specifieke chemische behandeling in K-medium. Ongeveer 25 min zijn nodig voor ene plaat scherm.

4. experiment video-verwerking

Opmerking: Een programma voor experimentele video en afbeeldingen verwerken was geschreven en verpakt. Het kan vrij worden gedownload (Zie Tabel van materialen). De experimentele video wordt opgeslagen in de vorm van een afbeelding framereeks en de framereeks van elke video wordt opgeslagen in een bepaalde map. Het programma kan worden herkend wormen en kwantificeren fenotypen automatisch.

1. Voeg in de grafische gebruikersinterface (GUI, Figuur 1), de parameters, zoals de frame reeks directory, de folder van de output, de worm grootte parameter en de parameter van de drempel van de beweging. Klik op de Analyseer knop om te verwerken van de experimentele beelden.
   1. Klik op de Select knop om te kiezen van de bronmap van de beelden.
   2. De middelste resultaat map toevoegen in de interface.
      Opmerking: De middelste resultaten omvatten de gesegmenteerde afbeeldingen. Deze middelste resultaten zijn nuttig voor de visuele waarneming van de verwerkte afbeeldingen.
   3. De uiteindelijke resultaat map toevoegen in de interface.
   4. Voeg de gemiddelde worm grootte parameter in het tekstvak van de Grootte van de Worm in de interface.
      Opmerking: De grootte-parameter die wordt gebruikt in de experimenten is 2.000.
   5. De drempel van verplaatste verhouding in de interface toevoegen.
      Opmerking: De verhouding gebruikt in de experimenten is 0.93.
   6. Klik op de Analyseer knop om te beginnen de beeldverwerking. Klik op de knop Beginwaarden om de toegevoegde parameters.
      Opmerking: Er zijn 33 functies gedefinieerd en gekwantificeerd voor wormen. Alle gedefinieerde fenotypen zijn gesorteerd op categorie (vermeld in tabel 3). Deze functies kunnen worden gekwantificeerd van experimentele beelden. Een kwantitatieve vergelijking tussen verschillende chemische stoffen, die verschillende toxicities hebben, kan worden gedaan door het vergelijken van deze functies.

Resultaten

We hebben de fenotypen van wormen blootgesteld aan verschillende concentraties van meer dan 10 chemische stoffen¹²getest. In de test, werden 33 verschillende functies gekwantificeerd voor elke chemische verbinding op drie tijdstippen (0 h, 12 h en 24 h). Eerder, werd een vergelijking tussen een handleiding en een automatische analyse van een levensduur test gedaan^11,12. In deze test vonden we dat chemische ...

Discussie

De voordelen van C. elegans hebben geleid tot het toenemende gebruik ervan in de toxicologie⁹, zowel voor mechanistische studies en high-throughput screening benaderingen. Een grotere rol voor C. elegans in aanvulling op andere modelsystemen in toxicologisch onderzoek is opmerkelijk in de afgelopen jaren, met name voor de beoordeling van de snelle toxiciteit van nieuwe chemicaliën. Dit artikel bevat een nieuwe bepaling van hoge-doorvoer, kwantitatieve screening van worm fenotypen...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2-Propanol	Sigma-Aldrich	59300
384-well plates	Throme	142761
Agar	Bacto	214010
Atropine sulfate	Sigma-Aldrich	PHL80892
Bleach buffer			0.5 mL van 10 M NaOH, 0.5 mL van 5% NaClO, 9 mL ultrapuur water
Cadmium chloride	Sigma-Aldrich	202908
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	21074
CCD camera	Zeiss	AxioCam HRm	Zeiss microscopy GmbH
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667
Copper(II) sulfate	Sigma-Aldrich	451657
Ethanol	Sigma-Aldrich	24105
Ethylene glycol	Sigma-Aldrich	324558
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
K-Medium			3,04 g NaCl en 2,39 g KCl in 1 L ultrapuur water
LB Broth			10 g/L Tryptone, 5 g/L Gistextract, 5 g/L NaCl
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	63140
NGM Plate			3 g NaCl, 17 g agar, 2,5 g peptone in 1 L ultrapuur water, voeg na autoclaveren 1 mL cholesterol toe (5 mg/mL in ethanol), 1 mL MgSO4 (1 M), 1 mL CaCl2 (1 M), 25 mL PPB buffer
Peptone	Bacto	211677
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	60130
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	795496
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	795488
PPB buffer			35,6 g van K2HPO4, 108,3 g van KH2PO4 in 1 L ultrapuur water
shaker	ZHICHENG	ZWY-200D
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	71382
Sodium fluoride	Sigma-Aldrich	s7920
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	71690
Sodium hypochlorite solution	Sigma-Aldrich	239305
The link of program			https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate
Tryptone	Sigma-Aldrich	T7293
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1625
Zeiss automatic microscope	Zeiss	AXIO Observer.Z1	Zeiss automatische microscoop met eigen software Zen2012 en charge-coupled device (CCD) camera