Method Article

Morfologische en functionele evaluatie van het lint synapsen op specifieke frequentiegebieden van de muis cochlea

DOI:

10.3791/59189

⸱

May 10th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, 2Department of Otology, Shengjing Hospital of China Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit manuscript beschrijft een experimenteel protocol voor het evalueren van de morfologische kenmerken en functionele status van het lint synapsen in normale muizen. Het huidige model is ook geschikt voor door lawaai geïnduceerde en leeftijdsgebonden cochlear synaptopathy-beperkte modellen. De correlatieve resultaten van eerdere muizen studies worden ook besproken.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cochleaire binnenste haarcellen (Ihc's) zenden akoestische signalen naar spiraalvormige ganglion neuronen (SGNs) door middel van lint synapsen. Verschillende experimentele studies hebben aangegeven dat haarcellen synapsen de initiële doelen in perceptief gehoorverlies (SNHL) kunnen zijn. Dergelijke studies hebben voorgesteld het concept van cochleaire "synaptopathie", die verwijst naar wijzigingen in lint Synapse nummer, structuur, of functie die resulteren in abnormale synaptische transmissie tussen IHCs en SGNs. Hoewel cochlear immuunziekte onomkeerbaar is, heeft dit geen invloed op de gehoor drempel. In door lawaai geïnduceerde experimentele modellen wordt beperkte schade aan IHC synapsen in bepaalde frequentiegebieden gebruikt om de omgevingsfactoren te identificeren die specifiek synaptopathie veroorzaken, evenals de fysiologische gevolgen van het verstoren van dit binnenoor Circuit. Hier presenteren we een protocol voor het analyseren van cochlear synaptische morfologie en functie in een specifiek frequentiegebied bij volwassen muizen. In dit protocol wordt cochleaire lokalisatie van specifieke frequentie regio's uitgevoerd met behulp van plaatfrequentiekaarten in combinatie met cochleogramgegevens, waarna de morfologische kenmerken van lint synapsen worden geëvalueerd via synaptische immunokleuring. De functionele status van het lint synapsen wordt vervolgens bepaald op basis van de amplitudes van auditieve hersenstam Response (ABR) Wave I. Het voorliggende verslag toont aan dat deze aanpak kan worden gebruikt om ons begrip van de pathogenese en mechanismen van synaptische disfunctie in het cochlea te verdiepen, wat kan helpen bij de ontwikkeling van nieuwe therapeutische interventies.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Frequenties in het bereik van ongeveer 20 \ u201220, 000 Hz kunnen worden waargenomen als auditieve stimuli door de mens. Het menselijk gehoor is normaalgesproken het meest gevoelig bij 1.000 Hz, waarbij het gemiddelde geluidsdrukniveau 20 μPa is bij jonge volwassenen (d.w.z. 0 decibel van het geluidsdrukniveau [dB SPL]). In sommige pathologische omstandigheden is gehoorverlies beperkt tot specifieke frequenties. Bijvoorbeeld, in de vroege stadia van lawaai-geïnduceerde gehoorverlies (NIHL), een "Inkeping" (dat wil zeggen, gehoor drempel hoogte) kan worden waargenomen in het audiogram op 4 kHz1. Langs de cochleaire partitie van zoogdieren produceren de gradaties van stijfheid en massa een exponentiële frequentie kaart, met hoogfrequente geluidsdetectie aan de basis van de slakkenhuis en lage frequentie detectie op de Apex2. Inderdaad, er is een cochleaire plaats-frequentie kaart langs het basilaire membraan, wat leidt tot wat bekend staat als tonotopische organisatie2,3. Elke gegeven plaats op het basilaire membraan heeft de hoogste gevoeligheid voor slechts één bepaalde geluidsfrequentie, die gewoonlijk de karakteristieke frequentie3,4wordt genoemd, hoewel ook reacties op andere frequenties kunnen worden waargenomen.

Tot op heden zijn verschillende Muismodellen gebruikt om de normale functie, pathologische processen en therapeutische werkzaamheid in het auditieve systeem te onderzoeken. Precieze kennis van fysiologische parameters in de muis slakkenhuis is een voorwaarde voor dergelijke studies van gehoorverlies. De muis slakkenhuis is anatomisch verdeeld in apicale, middelste en basale bochten, die corresponderen met verschillende frequentiegebieden. Door auditieve zenuw afferents te labelen in de cochlear Nucleus om hun corresponderende perifere innervatie locaties in de cochlea te analyseren, slaagde Müller et al. erin om de cochleaire plaats-frequentie kaart in de normale muis in vivo5te vestigen. In het interval van 7,2 – 61.8 kHz, dat overeenkomt met posities tussen 90% en 10% van de volledige lengte van het basilaire membraan, kan de muis cochleaire plaats-frequentie kaart worden beschreven door een eenvoudige lineaire regressiefunctie, wat duidt op een relatie tussen de genormaliseerde afstand van de cochleaire basis en de logaritme van de karakteristieke frequentie5. In laboratorium muizen kan de plaats-frequentie kaart worden gebruikt om de relatie tussen gehoor drempels binnen specifieke frequentiebereiken en cochleogrammen te onderzoeken die het aantal ontbrekende haarcellen in relatieve gebieden langs het basilaire-membraan6tonen. Belangrijk is dat de plaats-frequentie kaart een positioneringssysteem biedt voor het onderzoeken van minimale structurele schade, zoals schade aan het lint synapsen van haarcellen op specifieke cochleaire frequentie locaties in muizen met perifeer gehoor trauma7 ,8.

In de zoogdieren cochlea, lint synapsen bestaan uit een presynaptische lint, een elektron-dichte projectie die een Halo van release-Ready synaptische blaasjes met glutamaat in de IHC, en een postsynaptisch dichtheid op de zenuw terminal van de SGN met glutamaat receptoren9. Tijdens cochlear Sound transduction resulteert de afbuiging van de haarcelbundel in IHC depolarisatie, wat leidt tot het vrijgeven van glutamaat van Ihc's op de postsynaptische afferente terminals, waardoor de auditieve route wordt geactiveerd. Activering van dit traject leidt tot de transformatie van geluidsgeïnduceerde mechanische signalen naar een tariefcode in de SGN10. Inderdaad, de IHC lint Synapse is zeer gespecialiseerd voor ondefatigable geluid transmissie bij de tarieven van honderden Hertz met hoge temporele precisie, en is van cruciaal belang voor presynaptische mechanismen van geluid coderen. Eerdere studies hebben uitgewezen dat lint synapsen sterk variëren in grootte en aantal in verschillende frequentiegebieden in de volwassen muis slakkenhuis11,12, waarschijnlijk weerspiegelen structurele aanpassing aan de specifieke geluids codering voor overlevings behoeften. Onlangs hebben experimentele dieronderzoeken aangetoond dat cochleaire synaptopathie bijdraagt aan meerdere vormen van gehoorbeschadiging, waaronder lawaai-geïnduceerde gehoorverlies, leeftijdsgebonden gehoorverlies en erfelijk gehoorverlies13, 14. zo zijn methoden voor het identificeren van gecorreleerde veranderingen in het synaptische getal, de structuur en de functie in specifieke frequentiegebieden in toenemende mate werkzaam in onderzoeken naar auditieve ontwikkeling en binnenoor ziekte, met behulp van modellen die via experimentele manipulatie van genetische of omgevingsvariabelen15,16,17.

In het huidige rapport presenteren we een protocol voor het analyseren van het synaptische getal, de structuur en de functie in een specifieke frequentie regio van het basilaire membraan bij volwassen muizen. De lokalisatie van de cochlear-frequentie wordt uitgevoerd met behulp van een bepaalde plaats-frequentie kaart in combinatie met een cochleogram. De normale morfologische kenmerken van cochleaire lint synapsen worden geëvalueerd via presynaptische en postsynaptische immunokleuring. De functionele status van cochleaire lint synapsen wordt bepaald op basis van de suprathreshold amplitudes van ABR Wave I. Met kleine wijzigingen kan dit protocol worden gebruikt om fysiologische of pathologische omstandigheden in andere diermodellen te onderzoeken, waaronder ratten, cavia's en gerbils.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de NRC/ILAR gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren (8e editie). Het studie protocol werd goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité van de Capital Medical University, Peking, China.

1. selectie van dieren

  1. Gebruik voor alle experimenten volwassen C57BL/6J mannelijke muizen (8 weken oud) als het diermodel.
    Opmerking: C57BL/6j muizen die een splice variant van de Cdh23 vertonen versnelde senescentie in het auditieve systeem, weerspiegeld als een 40% verlies van lint synapsen bij de basale bocht van de slakkenhuis en een 10% verlies in de middelste bocht met 6 maanden oud, gevolgd door een snelle toename van dit verlies in de hele slakkenhuis met de leeftijd van18,19. Dus, we adviseren voorzichtigheid bij het gebruik van C57BL/6J muizen ouder dan 6 maanden voor auditief onderzoek. Andere stammen van muizen kunnen worden gebruikt, afhankelijk van specifieke experimentele doeleinden.
  2. Inspecteer de muizen met behulp van een professionele diagnostische Pocket Otoscoop om buiten-of middenoor pathologieën te voorkomen voordat gehoor beoordelingen worden uitgevoerd. Mogelijke verschijnselen zijn onder andere vloeistof of pus in de uitwendige gehoorgang, roodheid en zwelling in lokaal weefsel en tympanische membraan perforatie.
    Opmerking: Hoewel dit zelden wordt aangetroffen, moeten muizen met aandoeningen aan het buiten-of middenoor worden uitgesloten.

2. beoordeling van het gehoor

  1. Anesthetize muizen met behulp van een intraperitoneale injectie van een mengsel van ketamine hydrochloride (100 mg/kg) en xylazine hydrochloride (10 mg/kg). Beoordeel de diepte van anesthesie via pijnlijke stimuli (bijv. teen-pinch reflex).
    Opmerking: Wanneer de teen-pinch reflex volledig afwezig is, heeft het dier een adequate diepte van anesthesie bereikt voor auditieve testen. Als er meer tijd nodig is voor bilaterale ABR-opnames, dien een lagere dosering toe (een vijfde van de oorspronkelijke dosering) van anesthetica om het oorspronkelijke verdovings vlak te herstellen. Wees voorzichtig om verdoving overdosis te voorkomen, omdat dit kan leiden tot de dood bij muizen.
  2. Houd de lichaamstemperatuur van het verdoofd dier bij 37,5 °c met behulp van een thermoregulerend verwarmingskussen. Plaats het verdoofd dier in een elektrisch en akoestisch afgeschermde ruimte om interferentie gedurende de gehoortest te voorkomen.
    Opmerking: Behoud de fysiologische temperatuur gedurende de hele procedure totdat het dier volledig wakker is, om de dood veroorzaakt door hypothermie na anesthesie te voorkomen.
  3. Plaats subdermale naald elektroden (20 mm, 28 G) op het hoekpunt van de schedel (opname-elektrode), in de ipsilaterale holte-regio onder de Pinna van het gemeten oor (referentie-elektrode), en in de contralaterale holte-regio (aardelektrode), met een diepte van 3 mm onder de huid van de muis hoofd, respectievelijk20.
  4. Gebruik een gesloten luidspreker om akoestische stimulatie uit te voeren via een plastic buis van 2 cm met een kegelvormig uiteinde. Monteer de punt in de uitwendige gehoorgang21.
    Opmerking: Zorg ervoor dat de elektrische impedantie in de opname-en referentie-elektroden minder dan 3 kOhm (meestal 1 kOhm) is. Als de impedantie hoog is, verander de insertie plaats van de elektrode, reinig de elektrode met alcohol of vervang de elektrode om veranderingen in ABR Golf amplitude te voorkomen.
  5. Genereer voor de ABR-opname Toon pitten (3 MS duur, 1 MS opkomst/valtijden, met een snelheid van 21.1/s, frequentie: 4 – 48 kHz) en presenteer ze aan afnemende Spl's van 90 tot 10 dB in 5 \ u201210 dB SPL stappen20. Tijdens deze stap worden de responsen versterkt (10.000 keer), gefilterd (0,1 – 3 kHz) en gemiddeld (1.024 samples/stimulus level).
    Opmerking: Abr's worden verzameld voor elk stimulus niveau in stappen van 10 dB, met extra 5 dB stappen in de buurt van de drempel.
  6. Bepaal bij elke frequentie de ABR-drempel, die verwijst naar de minimale SPL die resulteert in een betrouwbare ABR-opname met één of meer onderscheidbaar golven die duidelijk kunnen worden geïdentificeerd door visuele inspectie (Figuur 1).
    Opmerking: Het is meestal nodig om het proces voor lage Spl's rond de drempel te herhalen om de consistentie van de golfvormen te garanderen. De respons drempel is het laagste stimulans niveau waarop de golfvorm kan worden waargenomen, wanneer een afname van 5 dB zou leiden tot het verdwijnen van de golfvorm.

3. cochleaire weefsel verwerking

  1. Na de ABR-opname, euthanruseer de verdoende muizen via cervicale dislocatie, onthoode ze, bloot de bulla van de ventrale kant en open met een scherpe schaar om toegang te krijgen tot het cochlea.
  2. Met behulp van een fijne Tang, verwijder de temporale botten, verbreken van de stijgbeugel slagader, verwijder de nieten uit het ovale venster, en ruptuur de ronde venster membraan. Maak een klein gaatje op de top van het slakkenhuis door de punt van een naald zachtjes te roteren (13 mm, 27 G).
  3. Bevestig de geïsoleerde botten met 4% (WT/vol) Paraformaldehyde in 0,1 M fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4), 's nachts bij 4 °C. Gebruik een pipet met fijne tipped en spoel de fixeer vloeistof voorzichtig door de perilymfatische ruimten via de toepassing op de ovale of ronde ramen (als inlaat) en de opening aan de Apex (als uitlaat).
    Opmerking: Sommige eiwitten vereisen een korte duur van fixatie om vernietiging van hun epitopen voor immunolabeling te voorkomen. In dergelijke gevallen, inbroed de botten in 4% Paraformaldehyde bij kamertemperatuur (RT) voor 2 uur, afhankelijk van de instructies van de fabrikant voor immunohistochemie. Fixatie kan ook worden uitgevoerd via cardiale perfusie om het cochleair bloed te verwijderen, waarbij achtergrondruis wordt vermeden als gevolg van niet-specifieke kleuring in latere stadia, met name in muismodellen van cochlear synaptopathie.
  4. Spoel de botten driemaal gedurende 5 min met 0,1 M koude PBS om rest Paraformaldehyde te verwijderen. Onthardt de beenderen met 10% ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) hetzij bij RT gedurende 4 uur of bij 4 °C gedurende 24 uur via zacht schudden in een horizontaal schudapparaat bij 20 rpm. EDTA kan halverwege worden vernieuwd.
    Opmerking: De decalcificatie tijden zijn onderhevig aan de concentratie van EDTA en de voorkeuren van gebruikers. Gedecalcificeerd weefsel moet een zekere mate van taaiheid behouden, wat de manipulatie van het isoleren van cochleaire volhouders in latere stappen vergemakkelijkt. Temporale botten kunnen worden ontkalkt in 10% EDTA met rotatie, waardoor onderzoekers het laboratorium na ABR tests en fixatie experimenten verlaten. De decalcificatie tijd is flexibel binnen het bereik van 20 tot 30 uur bij 4 °C.
  5. Breng een gedecalcificeerde temporale Bone over van EDTA naar 0,1 M PBS. Gebruik #3, #5 Dumont-Tang en de 27 G-naald om de apicale, middelste en basale cochleaire gebieden op hun beurt te ontleden en vervolgens het slakken stuk uit het bot te delen onder een stereo-dissectie Microscoop (zoals eerder beschreven22). Maak een reeks kleine sneden langs het spiraalvormige ligament met behulp van een scheermesje en verwijder het tectoriale membraan en het membraan van Reissner (Figuur 2).
    Opmerking: Zolang de ontleed slakkenhuis intact is, kan dit proces worden aangepast volgens het gebruikelijke Protocol van de operator.
  6. Verder ontleden het overgebleven gehoor epitheel, inclusief de spiraalvormige limbus in individuele cochleaire bochten (Apex, Midden en basis met haak gebied) voor preparaten voor hele montage.
  7. Onder een 40x olie doelstelling van een licht Microscoop, meet de basilaire membraan lengte met een schaal van 250 μm geplaatst in het oculair, die kan worden aangepast langs de stereocilia van de Ihc's.
  8. Bereken de lengte van elke cochleaire bocht door alle segment lengtes (250 μm per segment) toe te voegen en tegelijkertijd de totale lengte van het basilaire membraan te verkrijgen door de lengtes van elke bocht op te vatten.
  9. Zet de totale lengte van het basilaire membraan, inclusief het haak gebied, om in een percentage op basis van de afstand van de cochleaire Apex (0% verwijst naar de cochleaire Apex, 100% naar de cochleaire basis).
  10. Zet deze afstand om in de kenmerkende frequentie van cochlear met behulp van een logaritmische functie (d (%) = 1-156,5 + 82,5 × log (f), met een helling van 1,25 mm/octaaf frequentie, waarbij d de genormaliseerde afstand van de cochleaire Apex in procenten is, f is frequentie in kHz), zoals eerder beschreven op5,6. Zo kan het frequentiebereik in een overeenkomend gebied van het basilaire membraan op elke cochlear turn worden verworven.

4. immunofluorescentie kleuring

  1. Plaats elke cochleaire bocht na de sectie in een aparte centrifugebuis van 2,5 mL en incuberen cochleaire bochten in 10% geit serum/PBS/0.1% Triton X-100 voor 1 uur bij RT op een rotator.
  2. Verwijder de bovenstaande blokkerende/permealisatieoplossing uit elke buis met een pipetpunt van 200 μL onder een dissectie Microscoop en inbroed de specimens met primaire antilichamen verdund in 5% geit serum/PBS/0.1% Triton X-100 's nachts bij 4 °C op een rotator.
    Opmerking: Voor immunolabeling van cochlear synaptische linten, gebruik de presynaptische marker Mouse anti-carboxyl-Terminal binding proteïne 2 IgG1 (CtBP2, het labelen van de B-domein van de ribeye steigers eiwit, 1:400) en de postsynaptisch marker muis anti-glutamaat receptor 2 IgG2a (GluR2, labelen van een subeenheid van de AMPA-receptor, 1:200)23.
  3. Spoel driemaal gedurende 5 minuten met 0,1 M koude PBS om resterende primaire antilichamen te verwijderen en de specimens met secundaire antilichamen verdund in 5% geit serum/PBS/0.1% Triton X-100 bij RT voor 2 \ u20123 h in duisternis op een rotator te incuberen.
    Opmerking: bereid geschikte secundaire antilichaam mengsels met geit anti-muis Alexa Fluor 568 (IgG1, 1:500) en geit anti-muis Alexa Fluor 488 (IgG2a, 1:500), die complementair zijn aan de primaire antilichamen gebruikt in stap 4,2. Om de labeling efficiëntie voor synaptische linten te verbeteren, raden wij u aan specifieke secundaire antilichamen te selecteren. Sommige laboratoria verlengen incubatie met secundaire antilichamen om GluR2 immunolabeling24te verhogen.
  4. Spoel driemaal gedurende 5 minuten met 0,1 M PBS om resterende secundaire antilichamen te verwijderen en breng de specimens over van 2,5 mL centrifugebuizen tot 35 mm platen met 0,1 M PBS.
  5. Plaats een druppel afdekmedium met 4 ', 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) op de dia en breng de specimens van PBS over naar het afdekmedium. Plaats een rand van een dekglaasje op de glijbaan en laat de Afdeklijst zachtjes vallen.
    Opmerking: Om ervoor te zorgen dat de haarcellen naar boven staan en dat er tijdens de procedure geen vouwen of draaien van cochleaire specimens optreedt, moet u cochleaire specimens onder een stereo-dissectie Microscoop monteren.
  6. Plaats de dia's in een Slide box bij 4 °C 's nachts om dia's te laten drogen en vervolgens beeld onder een laser confocale Microscoop.

5. morfologische evaluatie van cochleaire lint synapsen

  1. Afbeelding schuift met behulp van een confocale Microscoop met drie lasers — een 405 nm UV diode, een 488 nm argon laser, en een 561 nm diode-gepompt Solid-State (DPSS) laser om DAPI te prikkelen (excitatie spectrum 409 – 464 nm), Alexa Fluor 488 (excitatie spectrum 496 – 549 nm) en Alexa Fluor 568 (Excitatie spectrum 573 – 631 nm), respectievelijk.
  2. Verkrijg confocale z-stacks over een afstand van 8 μm van elke cochleaire bocht met behulp van een 63x hoge-resolutie olie-Dompel lens.
    Opmerking: Eenmaal gedefinieerd moeten alle parameters voor het digitaliseren van photomicrographs worden opgeslagen en gelijkmatig worden toegepast op alle dia's.
  3. Voor synaptische punctum tellingen, stel de z-stapels (0,3 μm stapgrootte) om de gehele lengte van IHCs te overbruggen, waardoor ervoor te zorgen dat alle synaptische puncta kan worden afgebeeld.
  4. Voeg de afbeeldingen met puncta samen in een z-stack om de projectie van de z-as te verkrijgen en importeer deze in de beeldverwerkingssoftware.
  5. Deel synaptische totaal tellingen in elke z-stack in specifieke frequentie regio's door het aantal Ihc's (gelijk aan de DAPI Nuclear handmatige tellingen) om het aantal synaptische puncta voor elke IHC te berekenen. In elke specifieke frequentie regio, gemiddelde alle synaptische puncta in drie afbeeldingen van verschillende microscopische velden met 9 – 11 Ihc's.
    1. Schets de regio van de interesses (ROIs) inclusief de basolaterale regio's van elke IHC met de knop vrije hand selecties. Gebruik de meet functie voor het automatisch kwantificeren van puncta, en de waterloods functie om onderscheid te maken tussen dicht bij elkaar liggende vlekken.
    2. Voer na elk geautomatiseerd tellen visuele inspecties uit met handmatige correcties, zodat puncta-telling betrouwbaar is.
      Opmerking: Experimenteurs moeten blind blijven voor de vraag of de glijbaan afkomstig is van de Apex, het midden of de basale bocht van de cochlea.
  6. Visueel beoordelen synaptische structuur en distributie, handmatig isoleren individuele ihc's van hun buren door de Potlood tool (M) om beter te visualiseren de cytoskelet architectuur en synaptische lokalisatie.
  7. Om de nevenschikking van presynaptische linten (CtBP2) en postsynaptische receptor patches (GluR2) te inspecteren, Extraheer de Voxel-ruimte rond het lint door het rechthoekige selectiekadergereedschap en Isoleer het individuele lint door bijsnijden. Door te klikken op afbeelding ≫ Afbeeldingsgrootte, verkrijgt u een miniatuur array van deze miniatuur projecties, die vervolgens kunnen worden gebruikt om gekoppelde synapsen te identificeren (verscheen als nauw gejuxtaposed paren van CtBP2-positieve en GluR2-positieve puncta) versus wees linten (ontbreekt postsynaptisch glutamaat receptor patches) (Figuur 3).
    Opmerking: Normale cochlear synapsen verschijnen als gecombineerde immunolabeling van het presynaptische lint binnen de Haarcel (anti-CtBP2) en de postsynaptische glutamaatreceptor pleister op de gehoorzenuw Terminal (anti-GluR2)25. Sommige laboratoria gebruiken confocale projecties in combinatie met 3D-modellering te kwantificeren synaptische patch grootte of volume26,27. Voorafgaand aan significant verlies van lint synapsen, linten exposeren veranderingen in grootte of zonder gekoppelde glutamaat-receptor patches zijn waarschijnlijk indicatief voor synaptische dysfunctie27,28.

6. functionele evaluatie van cochleaire lint synapsen

  1. Verzamel alle ABR-golven voor elke frequentie stimulans gepresenteerd op een SPL van 90 dB voor de analyse van suprathreshold ABR Wave I amplitudes.
    Opmerking: Neurofysiologische en morfologische studies hebben aangetoond dat lage spontane-rate, hoogdrempelige vezels bijzonder kwetsbaar zijn voor veroudering en blootstelling aan lawaai29,30. Hoewel het eenvoudige verlies van lint synapsen kan geen invloed hebben op ABR drempels, het leidt vaak tot aanzienlijke verlagingen in ABR Wave I amplituden, omdat deze afferents met inbegrip van lage spontane-rate, hoge drempel vezels en hoge spontane-rate, laagdrempelige vezels dragen sterk bij aan de samengevat-activiteiten van de cochleaire zenuwvezels28,29,31. Hier wordt een suprathreshold-intensiteit van 90 dB SPL geselecteerd.
  2. Bepaal de piek-naar-piek-golf I amplitude met behulp van een offline analyseprogramma (Figuur 4). Elke golf I in de ABR-test bestaat uit een beginnende positieve (p) afbuiging en de daaropvolgende negatieve (n) afbuiging. ABR Wave I amplitude wordt gedefinieerd als het verschil in spanning tussen IP (de positieve piek van Golf I) en in (de negatieve piek van Golf I)29.
    Opmerking: In pathologische omstandigheden kan cochleaire synaptopathie worden bepaald op basis van de suprathreshold amplitudes van ABR Wave I, die de samengevat eerste reacties van sgns weerspiegelen die door geluid worden opgeroepen. Echter, cochleaire gevoeligheid die niet in het gedrang komt als gevolg van OHC dysfunctie is een voorwaarde voor deze methode.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ABR hoortesten werden uitgevoerd voor 10 C57BL/6J muizen (8 weken oud) onder anesthesie. Abr's werden opgewekt met behulp van Tone Burst stimuli op 4, 8, 16, 32 en 48 kHz. De gehoor drempel van elk dier werd visueel ontdekt door ten minste één heldere golfvorm in de ABR te onderscheiden. Alle muizen vertoonden ABR-drempels in reactie op Toon uitbarstingen, variërend tussen 25 en 70 dB SPL, afhankelijk van de frequentie van de stimulus. Onze resultaten gaven aan dat de gehoor drempel het laagst was bij 16 kHz (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sinds cochlear immuunziekte werd voor het eerst gekarakteriseerd in volwassen muizen met een tijdelijke drempel verschuiving (TTS) geïnduceerd door 8 \ u201216 kHz octaafband ruis op 100 dB SPL voor 2 h31, onderzoekers hebben steeds meer onderzocht de effecten van synaptopathie in verschillende zoogdieren, met inbegrip van apen en mensen32,33. Naast de blootstelling aan lawaai, zijn er verschillende andere voorwaarden in verband gebracht m...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (81770997, 81771016, 81830030); het gezamenlijke financieringsproject van de Beijing Natural Science Foundation en de Beijing education Committee (KZ201810025040); de Beijing Natural Science Foundation (7174291); en de China postdoctoral Science Foundation (2016M601067).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ketamine hydrochlorideGutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, ChinaH35020148100 mg/kg
Xylazine hydrochlorideSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAX-125110 mg/kg
TDT physiology apparatusTucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USAAuditory Physiology System III
SigGen/BioSig softwareTucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USAAuditory Physiology System III
Electric PadPet Fun11072931136
Dumont forceps 3#Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada0203-3-PO
Dumont forceps 5#Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada0209-5-PO
Stereo dissection microscopeNikon Corp., Tokyo, JapanSMZ1270
Goat serumZSGB-BIO, Beijing,ChinaZLI-9021
Anti-glutamate receptor 2, extracellular, clone 6C4Millipore Corp., Billerica, MA, USAMAB397muis 
Purified Mouse Anti-CtBP2BD Biosciences, Billerica, MA, USA612044muis 
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG1antibodyThermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USAA21124geit
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a antibodyThermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USAA21131geit
Mounting medium containing DAPIZSGB-BIO, Beijing,ChinaZLI-9557
Confocal fluorescent microscopyLeica Microsystems, Wetzlar, GermanyTCS SP8 II
Image Pro Plus softwareMedia Cybernetics, Bethesda, MD, USAversie 6.0
Professional diagnostic pocket otoscopeLude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai,ChinaHS-OT10
Needle electrodeFriendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi'an,China102920 mm, 28 G
Closed-field speakerTucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USACF1

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lie, A., Skogstad, M., Johnsen, T. S., Engdahl, B., Tambs, K. The prevalence of notched audiograms in a cross-sectional study of 12,055 railway workers. Ear and Hearing. 36 (3), 86-92 (2015).
  2. Fettiplace, R. Hair cell transduction, tuning, and synaptic transmission in the mammalian cochlea. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).
  3. Liberman, M. C. The cochlear frequency map for the cat: labeling auditory-nerve fibers of known characteristic frequency. Journal of the Acoustical Society of America. 72 (5), 1441-1449 (1982).
  4. Fettiplace, R., Kim, K. X. The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing. Physiological Reviews. 94 (3), 951-986 (2014).
  5. Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse. Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).
  6. Viberg, A., Canlon, B. The guide to plotting a cochleogram. Hearing Research. 197 (1-2), 1-10 (2004).
  7. Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse. Scientific Reports. 6, 25056(2016).
  8. Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in "recovered" ears. Journal of Neuroscience. 35 (19), 7509-7520 (2015).
  9. Wichmann, C., Moser, T. Relating structure and function of inner hair cell ribbon synapses. Cell and Tissue Research. 361 (1), 95-114 (2015).
  10. Matthews, G., Fuchs, P. The diverse roles of ribbon synapses in sensory neurotransmission. Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 812-822 (2010).
  11. Liberman, L. D., Liberman, M. C. Postnatal maturation of auditory-nerve heterogeneity, as seen in spatial gradients of synapse morphology in the inner hair cell area. Hearing Research. 339, 12-22 (2016).
  12. Yang, L., et al. Maximal number of pre-synaptic ribbons are formed in cochlear region corresponding to middle frequency in mice. Acta Oto-Laryngologica. 138 (1), 25-30 (2018).
  13. Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Cochlear synaptopathy in acquired sensorineural hearing loss: Manifestations and mechanisms. Hearing Research. 349, 138-147 (2017).
  14. Moser, T., Starr, A. Auditory neuropathy--neural and synaptic mechanisms. Nature Reviews Neurology. 12 (3), 135-149 (2016).
  15. Yu, W. M., et al. A Gata3-Mafb transcriptional network directs post-synaptic differentiation in synapses specialized for hearing. Elife. 2, 01341(2013).
  16. Buniello, A., et al. Wbp2 is required for normal glutamatergic synapses in the cochlea and is crucial for hearing. EMBO Molecular Medicine. 8 (3), 191-207 (2016).
  17. Gilels, F., Paquette, S. T., Beaulac, H. J., Bullen, A., White, P. M. Severe hearing loss and outer hair cell death in homozygous Foxo3 knockout mice after moderate noise exposure. Scientific Reports. 7 (1), 1054(2017).
  18. Kane, K. L., et al. Genetic background effects on age-related hearing loss associated with Cdh23 variants in mice. Hearing Research. 283 (1-2), 80-88 (2012).
  19. Jiang, X. W., Li, X. R., Zhang, Y. P. Changes of ribbon synapses number of cochlear hair cells in C57BL/6J mice with age (Delta). International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (10), 19058-19064 (2015).
  20. Akil, O., Oursler, A., Fan, K., Lustig, L. Mouse auditory brainstem response testing. BIO-Protocol. 6 (6), (2016).
  21. Zhou, X., Jen, P. H. -S., Seburn, K. L., Frankel, W. N., Zheng, Q. Y. Auditory brainstem responses in 10 inbred strains of mice. Brain Research. 1091 (1), 16-26 (2006).
  22. Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).
  23. Schmitz, F., Konigstorfer, A., Sudhof, T. C. RIBEYE, a component of synaptic ribbons: a protein's journey through evolution provides insight into synaptic ribbon function. Neuron. 28 (3), 857-872 (2000).
  24. Suzuki, J., Corfas, G., Liberman, M. C. Round-window delivery of neurotrophin 3 regenerates cochlear synapses after acoustic overexposure. Scientific Reports. 6, 24907(2016).
  25. Rutherford, M. A. Resolving the structure of inner ear ribbon synapses with STED microscopy. Synapse. 69 (5), 242-255 (2015).
  26. Liberman, L. D., Liberman, M. C. Dynamics of cochlear synaptopathy after acoustic overexposure. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 16 (2), 205-219 (2015).
  27. Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice. Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).
  28. Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma. Elife. 3, (2014).
  29. Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Age-related cochlear synaptopathy: an early-onset contributor to auditory functional decline. Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).
  30. Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates. Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).
  31. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).
  32. Valero, M. D., et al. Noise-induced cochlear synaptopathy in rhesus monkeys (Macaca mulatta). Hearing Research. 353, 213-223 (2017).
  33. Viana, L. M., et al. Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue. Hearing Research. 327, 78-88 (2015).
  34. Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 14 (3), 321-329 (2013).
  35. Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research. Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).
  36. Takeda, S., Mannström, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. Effects of Aging and Noise Exposure on Auditory Brainstem Responses and Number of Presynaptic Ribbons in Inner Hair Cells of C57BL/6J Mice. Neurophysiology. 49 (5), 316-326 (2017).
  37. Mehraei, G., et al. Auditory brainstem response latency in noise as a marker of cochlear synaptopathy. Journal of Neuroscience. 36 (13), 3755-3764 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Ribbon SynapsesCochlear LocalizationAuditory Brainstem ResponseSynaptic ImmunostainingConfocal MicroscopyBasilar MembraneInner Hair CellsSpiral Ganglion NeuronsPlace Frequency MapsCochleogram Data

Related Articles