Methodenartikel

In vivo toepassing van het systeem van de afstandsbediening voor de manipulatie van de endogene genexpressie

DOI:

10.3791/59235

⸱

29 maart 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Epigenetics, Van Andel Research Institute, 2Amgen

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn voor het genereren van een modelsysteem waarin de transcriptie van een endogene gen van belang voorwaardelijk kan worden gecontroleerd in de levende dieren of cellen met behulp van verbeterde lac -onderdrukker en/of tet activator systemen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een protocol voor de uitvoering van het systeem met afstandsbediening (Reversible Manipulation of TTranscription op Endogenous loci), dat voor controle van de omkeerbare en afstembare expressie van zorgt een endogene gen van belang in het leven model systemen. De afstandsbediening systeem maakt gebruik van verbeterde lac repressie en tet activeringssysteem down- of opregulatie van een target-gen binnen een enkele biologisch systeem te bereiken. Strakke repressie kan worden bereikt van onderdrukker bindend sites flexibel gelegen ver stroomafwaarts van een site start transcriptie door remming van de transcriptie rek. Robuuste opregulatie kan worden bereikt door verbetering van de transcriptie van een endogene gen door zich te richten tet transcriptionele activators aan de promotor cognaat. Dit besturingselement omkeerbaar en afstembare expressie kan worden toegepast en ingetrokken herhaaldelijk in organismen. De potentie en de veelzijdigheid van het systeem, zoals aangetoond voor de endogene Dnmt1 hier, zal toestaan nauwkeuriger in vivo functionele analyses door onderzoek van de genfunctie op verschillende niveaus van de expressie in te schakelen en door het testen van de omkeerbaarheid van een fenotype.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genetische knock-out of transgene benaderingen zijn effectieve middelen voor het bestuderen van de genfunctie in diermodellen. Expressie verordening door deze benaderingen is echter dichotome (aan/uit), niet-stoffelijke, en dus niet in staat is van het openbaren van het volledige functionele spectrum van een gen. Voorwaardelijke Cre/LoxP technologieën hebben toegestaan spatio-temporele inactiverings- of activering van de genfunctie, maar hun dichotome natuur blijft vormen van beperkingen, zoals de cel letaliteit en onomkeerbaarheid1,2 , 3. om deze leemte opvullen, voorwaardelijke vechtpartij benaderingen zijn ontwikkeld met behulp van tet-shRNA of miRNA4geregeld. Echter, af-target effecten blijven een zorg voor RNAi5 en hebben zijn uitdagend om te bepalen van in vivo. Meer recent, CRISPR/Cas-gemedieerde transcriptionele-besturingstechnologieën hebben ingevoerd een meer veelzijdige aanpak tot zowel up- en Downregulatie van endogene genexpressie en blijk gegeven van hun hulpprogramma's6,7 . De doeltreffendheid van de CRISPR/Cas-gemedieerde Transcriptionele controle is nog onduidelijk in vivo, en de omkeerbaarheid van KRAB gebaseerde onderdrukking blijft echter om gezien, zo sterk repressie door KRAB en haar interactie eiwit KAP1 gebleken voor het opwekken van permanente gene zwijgen8,9.

Om deze beperkingen, hebben we een nieuwe transcriptionele regelgevingssysteem kunnen voorwaardelijk regelen endogene genexpressie in een reversibele en afstembare wijze in muizen met behulp van gemanipuleerde prokaryote binaire transcriptionele toezicht-en regelgevingsstelsels10. Prokaryote binaire transcriptionele toezicht-en regelgevingsstelsels met regelgevende liganden, zoals lac en tet, dergelijke omkeerbare hebt ingeschakeld en afstembare expressie controle11,12,13, 14. echter de ontoereikende repressie potentie van de huidige binaire systemen hun brede goedkeuring voor het beheersen van de expressie van endogene genen in zoogdieren heeft belemmerd. We een verbeterde lac onderdrukking systeem voldoende krachtig voor de onderdrukking van endogene genen ontwikkeld en een nieuwe strategie van gerichte tet transcriptionele activators rechtstreeks naar de cognaat promotor van een endogene gen te bereiken in dienst robuuste opregulatie (Figuur 1)10. Met deze technologie, hebben wij bijna twee ordes van grootte expressie controle van het endogene Dnmt1 gen in een afstembare, afleidbare en omkeerbare wijze10bereikt. Hier bieden wij de stapsgewijze instructies voor de in vivo toepassing ervan op andere genen en organismen met behulp van muizen als een soort model.

figure-introduction-1
Figuur 1 : Overzicht van de afstandsbediening systeem. De transcriptie van een endogene target-gen kan worden geregeld met behulp van gemanipuleerde lac -onderdrukker en tet activator systemen. De doelgroep gene promotor of intron is ontworpen om de exploitanten voor de strakke-bindende LacIGY onderdrukker en/of de rtbevatten TA-M2 activator. R geeft aan Repron (Repression introp), die 12 symmetrische lac operators (S) plus een gedeeltelijke konijn bèta-globin intron bevat. T geeft aan tet exploitant. De onderdrukker en/of activator is/van de promotor van een weefsel-specifieke worden uitgedrukt. De expressie van het target-gen kan vervolgens omkeerbaar afgestemd op het niveau van de gewenste expressie door toediening van IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, een antagonist van de onderdrukker LacIGY) of Doxycycline (Dox). Dit cijfer is gewijzigd van Lee et al.10Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Controleer voordat u begint met dit protocol, tabel 1 ter identificatie van de relevante stappen voor het gewenste besturingselement van genexpressie. Bijvoorbeeld, als u wilt een muis waarmee omkeerbare Downregulatie van "Gene X" ingenieur, voltooien secties 1, 3 en 4 van de onderstaande protocol. Tabel 1 bevat ook een overzicht van de benodigde componenten van het systeem van de afstandsbediening.

Gewenste expressie wijzigenRepressie alleenActivering alleenZowel de repressie en de activering
Relevante onderdelen van het Protocol1, 3-42-41-4
Afstandsbediening volgorde nodig in Target-genRepron ("Repressie intron"; 12 symmetrische lac operatoren plus een gedeeltelijke konijn bèta-globin intron)Tet exploitant(en)Repron en Tet exploitant(en)
Afstandsbediening reeks locatieIntronPromotorIntron & promotor
Activator/onderdrukker die nodig zijn voor het gewenste besturingselementLacIGY onderdrukkerrtTA-M2 ActivatorLacIGY onderdrukker en rtTA-M2 Activator
Regelgevende ligandenIPTGDoxycyclineIPTG en/of Doxycycline

Tabel 1: Overzicht van REMOTE-control componenten.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd met de goedkeuring van de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de University of Southern California en de Van Andel Research Institute en met inachtneming van de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren van de nationale instituten van gezondheid15.

1. Wijzig het gen van belang voor repressie door de afstandsbediening

  1. Gebruik de richtlijnen hieronder, een transcriptionally inerte intron tegen het einde 5' van het gen van belang voor het inbrengen van de volgorde van de Repron vast te stellen ("Repression introp"; 12 symmetrische lac operatoren plus een gedeeltelijke konijn bèta-globin intron). Zich bewust zijn van alternatieve initiatiefnemers voor het gen van belang, en kies een intron volgens het transcript(s) worden gecontroleerd (dat wil zeggen een intron gedeeld door alle afschriften of een specifiek voor een gewenste transcript).
    Opmerking: Voor genen zonder een intron of met enen tegen het einde 3', steek de Repron reeks de promotor (Zie Lee, et al.,10 voor een gedetailleerde procedure).
    1. Het verkrijgen van de volgorde van de genomic voor het gen van belang.
      1. Navigeer naar de UCSC Genome Browser16,17, en selecteert u het laatste concept van het genoom van muis (muis GRCm38/mm10 op moment van publicatie), die momenteel onder het tabblad genomen .
      2. Voer de naam of het symbool van het gen van belang in de zoekbalk om te bekijken de transcripten voor het gen. Klik op go.
      3. Selecteer de gewenste transcript variant voor het gen van belang.
      4. Klik op het symbool van de gene naast het transcript variant van belang (het symbool van het eerder geselecteerde afschrift zal worden in een donkere kast).
      5. Onder de vlag van volgorde en Links naar Tools en Databases , klikt u op de koppeling van de Genomic volgorde .
      6. Voor Reeks ophalen regio opties, selecteert u alleen Exons (5' UTR, cd's, en 3' UTR), Introns, en de standaard één FASTA record per gen. Voor Reeks opmaak opties, selecteer Exons in hoofdletters, alles in kleine letters en Masker herhaalt aan N (om te verbergen van repetitieve sequenties). Klik vervolgens op indienen.
      7. Sla deze volgorde, behoud van de Opper - en kleine letters, opmaak in een document of programma dat kan worden geannoteerde.
    2. Vermijd onderbreking van CpG eilanden, die op regio's met gene regulerende functie wijzen kunnen.
      Opmerking: Hoewel een 5'-intron beter voor het inbrengen van de volgorde van de Repron is, de eerste intron kan transcriptionele regelgevende elementen zoals CpG eilanden (onderzocht in deze stap) of versterker elementen bevatten (onderzocht in stap 1.1.4), die dienen te worden vermeden voor Repron inbrengen.
      1. Onder de verordening en de expressie banner van de UCSC Genome Browser, selecteert u weergeven voor de Apr eilanden track en klikt u op vernieuwen.
      2. Inzoomen op de introns 5', klik op elk CpG eiland (in het groen weergegeven op het moment van publicatie indien aanwezig), en selecteer View DNA voor deze functie.
      3. Na het selecteren van masker herhaalt aan N, selecteer krijgen van DNA te verkrijgen van de CpG eiland volgorde.
      4. Overlay van deze sequenties met het originele bestand van de reeks, en deze als intronic regio's te vermijden als gevolg van mogelijke gene regelgevingstaken van aantekeningen voorzien.
    3. Vermijd onderbreking van niet-coderende RNAs, in het geval dat ze hebben een regulerende functie.
      1. Onder de genen en gen voorspellingen banner van de UCSC Genome Browser, selecteert u weergeven voor de track GENCODE (Ensembl) en klikt u op vernieuwen.
      2. Inzoomen op de introns 5', klik op elke niet-coderende RNA (in het groen weergegeven op het moment van publicatie indien aanwezig), en de opeenvolging van DNA voor elk door te klikken op de chromosomale coördinaten te verkrijgen.
      3. In het dropdown menu beeld , selecteer DNAen op masker herhaalt aan N. Vervolgens klikt u op DNA.
      4. Overlay van deze sequenties met het originele bestand van de reeks, en deze als intronic regio's te vermijden als gevolg van mogelijke gene regelgevingstaken van aantekeningen voorzien.
    4. Vermijd intronic regio's met enhancer handtekeningen in de tissue(s) van belang, zoals H3K4me1, H3K27ac en DNase ik overgevoeligheid18,19,20,21, evenals CTCF-bindende sites, die regelen enhancer22,23in een lus.
      1. Navigeer naar de ENCODE database24,25, en selecteer het pictogram van de experimenten .
      2. Voor het type assay, selecteer ChIP-seq of DNase-seqen vullen van de andere categorieën (organisme, Biosample type, etc.) volgens de cellen die moeten worden ontworpen.
      3. Na selectie van de functie, de muisaanwijzer op de pictogrammen in het blauw en selecteer het bestand waarin Resultaten weergeven als lijst voorkomt (meest linkse pictogram op moment van publicatie).
      4. Selecteer de datasets voor de doelstellingen van H3K4me1, H3K27ac, DNase ik, en CTCF die zo nauw mogelijk aansluiten de cellen die moeten worden ontworpen.
      5. Binnen elke relevante dataset, ga naar de sectie Files , Controleer dat mm10 (of de laatste versie van het genoom) en UCSC zijn geselecteerd, en klik op de knop visualiseren .
      6. In de UCSC Genome Browser en inzoomen op de introns 5' voor het gen van belang, klik nu op elke H3K4me1, H3K27ac, DNase ik en CTCF piek in hun respectieve geannoteerde piek sporen.
      7. De opeenvolging van DNA voor elke regio piek verkrijgen door te klikken op de chromosomale coördinaten.
      8. In het dropdown menu beeld , selecteer DNAen op masker herhaalt aan N. Vervolgens klikt u op DNA.
      9. Overlay van deze sequenties met het originele bestand van de reeks, en deze als intronic regio's te vermijden als gevolg van mogelijke gene regelgevingstaken van aantekeningen voorzien.
    5. Verstoring van consensus splicing sequenties, om niet te bemoeien met de juiste splitsen van de exons voorkomen.
      Opmerking: Hoewel sequenties vereist voor splicing zijn grotendeels beperkt tot ongeveer zes honken eind 5' een intron26 en ongeveer 60 bases op de 3' eind27, is het raadzaam om te kiezen van een grote intron, waardoor aanzienlijk bredere marges uit deze consensus regio's om te minimaliseren van de kans op invloed splicing. Gebruik van analysetools intron, zoals SVM-BPfinder28, wordt aanbevolen voor een grondigere analyse van potentiële splice sequenties.
  2. Na het identificeren van een intronic regio dat voldoet aan de bovenstaande criteria (zoals voor Dnmt1 in de aanvullende gegevens), screen de volgorde met behulp van een online sgRNA ontwerp tool voor het identificeren van een sgRNA in de regio met hoge specificiteit en voorspeld efficiëntiescores.
    1. Navigeer naar een programma voor het ontwerpen van online sgRNA van keuze, zoals CRISPOR29.
    2. Geef de volgorde van de intronic regio van belang, het genoom van de relevante verwijzing opgeven en selecteert u de gewenste Protospacer aangrenzende Motif (PAM). Klik op verzenden.
    3. Sorteren van de voorspelde sgRNAs door specificiteit score en selecteer een of meer sgRNAs, die ook een voorspelde hoogrenderende score29.
      1. Optioneel: De om kans te maximaliseren van het gebruik van een doeltreffende sgRNA, eerst testen van de efficiëntie van de splitsing van verschillende top-scoren sgRNAs in een in-vitro-assay30, en doorgaan met de meest efficiënte sgRNA in vivo.
  3. Ontwerpsjabloon een DNA met een PITT (Pronuclear injectie gebaseerde gerichte transgenese) landing pad volgorde, zoals in aanvullende figuur 1A, B, aan beide zijden geflankeerd door 60-base homologie wapens die overeenkomen met het knippen van de site31 sgRNA .
    Opmerking: De landing pad bevat twee heterotypic loxP sites (JT15 en Lox2272) en kan gerichte invoeging van grote sequenties via een aanpak in twee stappen; Zorg dat de kruispunten van deze invoeging Maak geen cryptische splice sites. Anderzijds kan een embryonale stamcellen (ESC) - gebaseerde knock - in de strategie worden gebruikt om de volgorde van de Repron rechtstreeks invoegen.
  4. Voorbereiden van de sgRNA, Cas9 eiwit en het template van de single-stranded DNA (ssDNA) voor het pad van de landing, en microinject in bevruchte eitjes (vanaf B6C3F1/J muizen of andere gewenste stam) volgens vaste protocollen32,33.
  5. Scherm voor muizen met de knock landing-pad.
    1. PCR inleidingen aanvullende ontwerpen aan de genomic locus, maar buiten de regio's gericht door de homologie takken, zoals aangetoond voor Dnmt1 in aanvullende figuur 1 c. Vermijd repetitieve genomic opeenvolgingen bij het ontwerpen van de inleidingen.
    2. Het uittreksel van DNA van staart clips van de muizen volgens vaste protocollen34.
    3. Gebruik van PCR en gel elektroforese ter identificatie van de muizen met een landing pad invoegen.
    4. Bevestigen dat de knock-in geslaagd door de sequencing van het PCR-producten.
      Opmerking: Ongewenste grote deleties en herschikkingen kunnen worden ingevoerd door CRISPR/Cas935, dus voorzichtig screening voor af-doelgroep bewerken voordat u verdergaat35,36,,37wordt geadviseerd.
  6. Met behulp van bevruchte eieren van de landing pad muizen, microinject iCre mRNA38 en een transgene plasmide met de volgorde van de Repron geflankeerd door JTZ17 en Lox2272 recombinatie sites31,39,40, 41 volgens gevestigde methoden38,42,43.
  7. Scherm voor muizen met de invoeging van Repron.
    1. PCR inleidingen complementair aan de genomic locus, buiten de Repron invoegen ontwerpen. Vermijd repetitieve genomic opeenvolgingen bij het ontwerpen van de inleidingen.
    2. Het uittreksel van DNA van staart clips van de muizen volgens vaste protocollen34.
    3. Gebruik van PCR en gel elektroforese ter identificatie van muizen met de invoeging van een Repron.
    4. Bevestig dat de knock-in geslaagd door de sequencing van het PCR-producten.

2. Wijzig het gen van belang voor opregulatie van afstandsbediening

  1. Gebruik onderstaande richtlijnen om vast te stellen een regio in de promotor van een gen van belang dat waarschijnlijk niet zal erover promotor functie op de invoeging van tet exploitant sequenties. Zich bewust zijn van alternatieve initiatiefnemers voor het gen van belang, en kies een promotor volgens het transcript(s) worden gecontroleerd (dat wil zeggen een promotor gedeeld door alle afschriften of een specifiek voor een gewenste transcript).
    1. Het verkrijgen van de genomic volgorde voor de promotor van belang.
      1. Navigeer naar de UCSC Genome Browser16,17, en selecteert u het laatste concept van het genoom van muis (muis GRCm38/mm10 op moment van publicatie), die momenteel onder het tabblad genomen .
      2. Voer de naam of het symbool van het gen van belang in de zoekbalk om te bekijken de transcripten voor het gen. Klik op go.
      3. Selecteer de gewenste transcript variant voor het gen van belang.
      4. Klik op het symbool van de gene naast het transcript variant van belang (het symbool van de gene van het eerder geselecteerde afschrift zal worden in een donkere kast).
      5. Onder de vlag van volgorde en Links naar Tools en Databases , klikt u op de koppeling van de Genomic volgorde .
      6. Voor Reeks ophalen regio opties, selecteert u alleen promotor/Upstream door 1000 baseert. Selecteer Masker herhaalt aan N (aan het verbergen van repetitieve sequenties) voor Volgorde opmaak opties. Klik vervolgens op indienen.
      7. Deze promotor volgorde opslaan in een document of programma dat kan worden aantekeningen.
    2. Selecteer regio's die vrij van vermeende transcriptie factor bandplaatsen zijn, als onderbreking van deze sequenties kunnen endogene genexpressie wijzigen.
      1. Ga naar de UCSC Genome Browser, en open de nieuwste versie van het genoom van de muis.
      2. Selecteer boven de Mapping en Sequencing banner, bijhouden van hubs.
      3. Klik op mm10 naast de naam van de hub van JASPAR 2018 TFBS (of de laatste JASPAR-versie).
      4. Voer de naam of het symbool van het gen van belang in de zoekbalk om te bekijken de transcripten voor het gen. Klik op go.
      5. Selecteer de gewenste transcript variant voor het gen van belang.
      6. Scroll naar beneden naar de banner JASPAR 2018 TFBS en klik op de pijl van de vervolgkeuzelijst om te selecteren op de gewenste weergaveoptie voor het spoor, zoals squish. Klik op vernieuwen.
      7. Zoom in de regio van de promotor van een gen van belang en de identificatie van de regio's die vrij zijn (of relatief vrije) van transcriptie factor bandplaatsen volgens de JASPAR-track. Het opnemen van de chromosomale coördinaten van deze regio's.
      8. De genomische opeenvolging van deze chromosomale coördinaten verkrijgen door deze te typen in de zoekbalk te klikken gaan. In het dropdown menu beeld , selecteer DNAen op masker herhaalt aan N. Vervolgens klikt u op DNA.
      9. Overlay van deze sequenties met het originele bestand van de reeks, en deze als ideale promotor regio's te richten toe te schrijven aan gebrek aan transcription factor binding van aantekeningen voorzien.
    3. Binnen deze sequenties, een perturbable promotor regio selecteren die is stroomopwaarts, maar in de buurt van de site start transcriptie van het gen van belang.
      Opmerking: Sluissymbool thats te dicht bij dat de transcriptie start site kan verhogen de kans op afbreuk te doen aan promotor activiteit, maar een invoeging die te ver is kan het niveau van opregulatie afnemen. Invoegen van tet exploitant sequenties ongeveer 200 basepairs stroomopwaarts van de transcriptie start site heeft geresulteerd in robuuste opregulatie van de twee initiatiefnemers getest (zie discussie)10.
  2. Het scherm van de geselecteerde promotor regio met behulp van een programma voor het ontwerpen van online sgRNA te identificeren van een sgRNA in de regio met hoge specificiteit en voorspelde efficiëntiescores.
    1. Navigeer naar een programma voor het ontwerpen van online sgRNA van keuze, zoals CRISPOR29.
    2. Geef de volgorde van de regio van belang, het genoom van de relevante verwijzing opgeven en selecteert u de gewenste Protospacer aangrenzende Motif (PAM). Klik op verzenden.
    3. Sorteren van de voorspelde sgRNAs door specificiteit score en selecteer een of meer sgRNAs, die ook een voorspelde hoogrenderende score29.
      1. Optioneel: De om kans te maximaliseren van het gebruik van een doeltreffende sgRNA, eerst testen van de efficiëntie van de splitsing van de verschillende sgRNAs in een in-vitro-assay30, en doorgaan met de meest efficiënte sgRNA in vivo.
  3. Ontwerpsjabloon een DNA met tet exploitanten aan beide zijden geflankeerd door 60-base homologie wapens die overeenkomen met de sgRNA site31,33te knippen.
    Opmerking: Het aantal tet exploitanten is klantgericht; inbrengen van twee tot vier tet exploitant sequenties in tandem is eerder aangetoond effectief te zijn, maar in principe meer exploitanten zijn wenselijk voor het rijden van hogere expressie. Anderzijds kan een ESC gebaseerde knock-in de strategie worden gebruikt om in te voegen de tet -exploitanten.
    1. Optioneel: Voor experimenteel bewijs dat de voorgestelde wijzigingen waarschijnlijk niet de endogene transcriptionele activiteit van het gen van belang zal verstoren, kloon de volgorde van de gemodificeerde promotor in een vector luciferase firefly (zoals pGL3-Basic), en Vergelijk de werkzaamheid naar de oorspronkelijke promotor met behulp van een luciferase assay.
  4. Voorbereiden van de sgRNA, Cas9-eiwitten en de sjabloon van de ssDNA met de tet exploitant sequenties, en microinject in bevruchte eitjes (vanaf B6C3F1/J muizen of andere gewenste stam) volgens vaste protocollen32,33.
    Opmerking: Als gevolg van de complexiteit van de synthese van een terugkerende sequentie, een in vitro transcriptie/omgekeerde transcriptie gebaseerde aanpak wordt aanbevolen voor het synthetiseren van een ssDNA-sjabloon van een double-stranded DNA (dsDNA) plasmide44. U kunt ook een dsDNA sjabloon kan worden gebruikt voor microinjection, maar de efficiëntie knock-in mogelijk verminderde45.
  5. Scherm voor muizen met knock-in van de tet -exploitanten.
    1. PCR inleidingen complementair aan de genomic locus, buiten de regio's gericht door de homologie takken te ontwerpen. Vermijd repetitieve genomic opeenvolgingen bij het ontwerpen van de inleidingen.
    2. Het uittreksel van DNA van staart clips van de muizen volgens vaste protocollen34.
    3. Gebruik van PCR en gel elektroforese ter identificatie van muizen met het inbrengen van de tet -exploitanten.
    4. Bevestigen dat de knock-in geslaagd door de sequencing van het PCR-producten.
      Opmerking: Ongewenste grote deleties en herschikkingen kunnen worden ingevoerd door CRISPR/Cas935, dus voorzichtig screening voor af-doelgroep bewerken voordat u verdergaat35,36,,37wordt geadviseerd.

3. het ontwikkelen van activator - en/of uiten van onderdrukker muizen

  1. Het identificeren van een krachtig waarin promotor voor de tissue(s) of de cel (de) type(n) van belang.
    Opmerking: Een literatuurstudie en het weefsel-specifieke promotor Database46 nuttig kunnen zijn voor het identificeren van dergelijke een promotor.
  2. Plaats de meegeleverde verbeterde lac -onderdrukker of tet activator reeks stroomafwaarts van de gewenste promotor voor het genereren van een transgene constructie.
  3. De transgene muis (s) met behulp van standaardprocedures transgene42,43,47te produceren. Anderzijds kan een sitespecifieke Transgenese aanpak worden gehanteerd positie effecten te vermijden en single-kopie transgenic invoeging31,48.
  4. Uitdragen van de oprichters, en bepalen de expressiepatroon en het niveau van de transgenic in de nakomelingen van elke oprichter. Selecteer lijnen met krachtige expressie in de beoogde weefsel (de) type(n) voor verder fokken.
    1. De oprichters aan wildtype muizen fokken.
    2. PCR inleidingen die de invoeging van de activator en/of van de onderdrukker detecteert ontwerpen.
    3. Het uittreksel van DNA van staart clips van de nakomelingen volgens vaste protocollen34.
    4. Gebruik van PCR en gel elektroforese ter identificatie van muizen met de invoegpositie.
    5. Bevestig de transgenic invoeging door sequentiebepaling van de PCR-producten.
    6. Geef de transgene lijnen.
    7. Offer een paar pups van elke regel, en het verzamelen van de weefsels van belang voor qRT-PCR, immunohistochemistry, en/of westelijke bevlekken voor het analyseren van de uitdrukking van het gen/proteïne van belang in de target weefsel (de) type(n).
    8. Selecteer de regels met de sterkste uitdrukking in de weefsels van belang zijn voor gebruik in sectie 4.

4. het manipuleren van genexpressie in vivo

  1. Het fokken van de muizen met de gewijzigde gen van belang (sectie 1 en/of 2) met de transgene muizen van sectie 3 volgens gevestigde fokken praktijken49. Fokken voor maximale expressie controle, de muizen aan homozygosity voor het gemodificeerde allel.
  2. Beheren voor terugkeer of aanpassing van de onderdrukking van het target-gen, IPTG in het drinkwater.
    1. Experimenteel bepalen de dosis van IPTG te gebruiken, het behandelen van muizen van de passende genotype en besturingselementen met een van een aantal doses (aanbevolen vanaf bereik: 0-400 mM IPTG) voor ten minste één week50,51. Opnemen van ten minste drie muizen per behandelde groep en de leeftijd en het geslacht van muizen die meest relevant voor de geplande toekomstige experimenten zijn. Opmerking: Fok paren van muizen kunnen worden behandeld met IPTG water om developmental blootstelling van IPTG aan de nakomelingen desgewenst13, of muizen kunnen elk gewenst moment na de geboorte behandeling beginnen.
      1. Los van de gewenste hoeveelheid IPTG in steriel gedistilleerd water op de dag van de administratie, en roer met een roer-bar gedurende 5 minuten of totdat volledig is opgelost.
      2. Wikkel de fles met folie, en beheren van het IPTG water in een fles van licht-beschermd. Twee keer per week vervangen. Dezelfde bron van water geven muizen 0 mM IPTG ontvangen.
      3. Na ten minste één week, offeren de muizen en analyseren van de uitdrukking van het gen van belang in het doel tissue(s) qRT-PCR, immunohistochemistry, en/of westelijke bevlekken.
      4. De dosis die de uitdrukking van het gen van belang aan die van wildtype besturingselementen herstelt en deze dosis te bereiken van normale expressie van het gen in toekomstige experimenten te gebruiken.
  3. Voor de inductie van gene opregulatie, Doxycycline (Dox) te beheren in het dieet.
    1. Experimenteel het bepalen van de concentratie van Dox beheren, behandelen muizen van de passende genotype en controle met één van de concentraties van een bereik van Dox (aanbevolen vanaf bereik: 0-5000 mg/kg Doxycycline Hyclate) voor ten minste één week52 ,53, met inbegrip van ten minste drie muizen per behandelde groep. Koop Dox-bevattende muis voedsel van een commerciële leverancier.
      Opmerking: Paren van muizen fokken kan worden behandeld met Dox voedsel te verstrekken developmental blootstelling van Dox op het nageslacht desgewenst54,55, of muizen kunnen elk gewenst moment na de geboorte behandeling beginnen.
    2. Vervang het dieet eenmaal per week. Hetzelfde base dieet geven muizen Dox-vrij voedsel ontvangen.
    3. Na ten minste één week, offeren de muizen en analyseren van de uitdrukking van het gen van belang in het doel tissue(s) qRT-PCR, immunohistochemistry, en/of westelijke bevlekken.
    4. De dosis die de uitdrukking van het gen van belang naar het gewenste niveau verheft en deze dosis te bereiken overexpressie van het gen in toekomstige experimenten te gebruiken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het vermogen van de onderdrukking van de afstandsbediening systeem is aangetoond in twee verschillende benaderingen tot nu toe. In de eerste benadering, werden lac -onderdrukker bandplaatsen ingevoegd op de endogene promotor van het Dnmt1 -gen. In de tweede benadering, die wordt aanbevolen door dit protocol, werden de onderdrukker bandplaatsen ingevoegd in een stroomafwaartse intron om te voorkomen dat het potentiële risico van invloed op promotor functie door de invoegpositie en daarmee ter vereenvoudiging van de toepassing van de afstandsbediening systeem. Beide benaderingen resulteerde in de succesvolle onderdrukking (Figuur 2A, B en figuur 3A-C)10. Dnmt1 expressie werd onderdrukt tot 15% van de niet-gereglementeerde niveaus met behulp van de promotor gebaseerde benadering(Figuur 2). Deze strakke repressie ongedaan werd gemaakt op een dosis-afhankelijke manier door de behandeling van muizen met wisselende hoeveelheden van IPTG(Figuur 2). De waargenomen Dnmt1 repressie werd gevalideerd op het niveau van de eiwitten door immunokleuring (Figuur 2B). Wij deden niet waarnemen merkbaar verschil in Dnmt1 expressie tussen Dnmt1+/ + en Dnmt1LO/LO muizen, bevestigen dat onze lac exploitant invoeging normale promotor had niet worden verstoord functie10. De intron gebaseerde benadering bereikt meer dan 90% repressie van exploitanten gelegen verscheidene kilobases stroomafwaarts van de transcriptie start site door verzachtende transcriptie rek (Figuur 3A, B)10. Deze intron gebaseerde benadering was verder gevalideerd op zeven extra robuuste initiatiefnemers (Figuur 3C). Steevast strakke onderdrukking werd uit alle van de initiatiefnemers getest bereikt. Geen correlatie tussen de ontwikkelingsniveaus van de resterende expressie en de sterke punten van de initiatiefnemers werd waargenomen, wat suggereert dat de capaciteit van de repressie van onze intron gebaseerde onderdrukking systeem groter is dan de transcriptionele potentie van alle van de robuuste initiatiefnemers we getest () Figuur 3 C).

Het vermogen van de in vivo opregulatie van de afstandsbediening systeem werd ook aangetoond op het Dnmt1 -gen. Wij binnengebracht twee exemplaren van de tet exploitant in de Dnmt1 -promotor, samen met lac exploitant sequenties, te voorzien in opregulatie of Downregulatie afhankelijk van welke effector eiwit aanwezig is. Robuuste opregulatie en Downregulatie van Dnmt1 expressie, dicht bij twee ordes van grootte (10% tot 650%), werden bereikt in SER's met het gemodificeerde endogene Dnmt1 allel (Dnmt1LGT) (Figuur 4A)10 . Beide verordeningen werden volledig omkeerbaar en afleidbare door IPTG en Dox behandelingen, respectievelijk (Figuur 4A). Volgende introduceerden we de wijziging van de Dnmt1LGT in de kiemcellen van de muis voor het testen van het vermogen van de in vivo opregulatie van het systeem van de afstandsbediening. Sterke opregulatie van Dnmt1 werd waargenomen van de lever, milt en nieren, overwegende dat geen detecteerbare opregulatie in het hart werd waargenomen (Figuur 4B)7. Het patroon van de celcyclus-afhankelijke uitdrukking van Dnmt1 en de schaarste van proliferatieve cellen in het hart kunnen ten grondslag liggen aan deze observatie10,-56. Het valt nog te bezien of deze beperking kan worden overwonnen door het verhogen van het niveau van de expressie van de activator of het nummer van de bandplaatsen.

figure-results-1
Figuur 2 : In vivo onderdrukking van Dnmt1 door de onderdrukker LacIGY. (A) muizen met lac exploitanten (LO) ingevoegd van de promotor van de Dnmt1 , met of zonder expressie van LacIGY, werden behandeld met verschillende doses van IPTG. qRT-PCR analyse van Dnmt1 expressie blijkt de dosis-afhankelijke omkering van Dnmt1 repressie in vivo door IPTG behandeling. Elke staaf vertegenwoordigt gegevens uit een andere muis. Gegevens vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM (n = 3). (B) immunokleuring van Dnmt1 eiwitten in Colon crypten van muizen verstrekt drinkwater met of zonder 160 mM IPTG voor 3 weken. Dit cijfer is gewijzigd van Lee et al.10Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-2
Figuur 3 : In vivo en in vitro onderdrukking van verschillende initiatiefnemers door het systeem van de afstandsbediening. (A) een vroege versie van de Repron-reeks (R *) is ingevoegd in een intron stroomafwaarts van de promotor van de Villin in een transgene muis van Villin-mKate2 (VilmKate2). qRT-PCR analyse van mKate2 expressie in de dunne darm van muizen met of zonder de onderdrukker van de LacIGY wordt weergegeven. Elke staaf vertegenwoordigt gegevens uit een andere muis. (B) confocale mKate2 beelden van de dunne darm met en zonder LacIGY expressie. (C) zes symmetrische lac exploitanten (S) zijn ingevoegd tussen diverse initiatiefnemers en een luciferase verslaggever. Verslaggevers (50 ng/putje in 96-wells-plaat) en onderdrukker plasmiden werden Transient binnengebracht met NIH/3T3 cellen in een molaire verhouding van 1:1. Luciferase waarden werden beoordeeld 24u na transfectie. Deze in vitro gegevens vertegenwoordigen het percentage van luciferase meningsuiting in LacIGY-uiting geven aan cellen ten opzichte van die uiting geven aan niet-functionele LacI (NFlacI). T-tests werden gebruikt om te bepalen van de statistische significantie. Gegevens vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM (n = 3). P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01. Dit cijfer is gewijzigd van Lee et al.10Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-3
Figuur 4 : Down - en/of opregulatie van Dnmt1 expressie in vitro en in vivo. (A) het volledige afstandsbediening systeem werd ontworpen in gekweekte SER's door gene targeting en electroporation benaderingen. Maximale onderdrukking van Dnmt1 expressie werd bereikt met geen behandeling, terwijl de maximale activering werd bereikt door zowel de IPTG als de Dox behandeling. Gegevens vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM (n = 3). P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01 (Welch's t-tests). (B) In vivo activering van Dnmt1 door het systeem van de afstandsbediening, zoals blijkt uit immunokleuring van Dnmt1 eiwitten in verschillende weefsels van afstandsbediening muizen. Het allel LGT vertegenwoordigt promotor wijziging van Dnmt1 lac operator en tet activator bandplaatsen bevatten. Muizen werden behandeld met een normale of Dox-bevattende voeding (Doxycycline Hyclate 5000 mg/kg) gedurende één maand. Dit cijfer is gewijzigd van Lee et al.10Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-4
Aanvullende figuur 1 : Voorbeeld van de landing pad invoegen in lymfkliertest Dnmt1 intron 1. (A) schema van DNA sjabloon voor het aanlanden van pad inbrengen, aangepast van Quadros et al. (2015)31. Heterotypic loxP sites, JT15 en Lox2272, worden gescheiden door een opeenvolging van korte spacer (sp) en aan weerskanten geflankeerd door 60-bp van DNA dat homoloog aan de genomic regio van doel. (B) monster DNA sjabloon voor het aanlanden van pad invoegen in de Dnmt1 intron met behulp van de volgende sgRNA: CTAGTACCACTCCTGTACCG (die gericht is op de omgekeerde strand). De geselecteerde intronic regio was bioinformatically door stap 1.1 in kennis gesteld, en de sgRNA werd geïdentificeerd met behulp van CRISPOR29. (C) voorbeeld van PCR primer design voor de beoordeling van de invoeging van het stootkussen van de landing. PCR de inleidingen werden ontworpen buiten de homologie takken van de sjabloon te integreren endogene Dnmt1bevestigen. De amplicon van wildtype PCR is 213 bp; wordt op de invoegpositie, 291 bp. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een kritieke stap en mogelijke beperking van het systeem van de afstandsbediening is de uitdaging die is gekoppeld aan het inbrengen van de onderdrukker en/of activator bandplaatsen zonder doel genexpressie. Onze oorspronkelijke benadering van de repressie, betrokken zoals toegepast op de Dnmt1 -gen, invoeging van lac -onderdrukker bandplaatsen in transcriptionally kritische gebieden van een promotor. Om het risico van invloed zijn op de functie van de promotor, en dus tot verbetering van de algemene toepasbaarheid van het systeem van de afstandsbediening, ontwikkelden we een repressie intron gebaseerde aanpak. De potentie van onze verbeterde lac systeem toegestaan ons te strak onderdrukken de transcriptie van de sterke initiatiefnemers we bij exploitanten gelegen getest honderden tot verscheidene kilobases stroomafwaarts van de transcriptie beginnen sites (Figuur 3A – C) 10. bovenal de niveaus van repressie waren onafhankelijk van de transcriptionele sterke punten van de initiatiefnemers (Figuur 3A – C)10. Dit suggereert dat de capaciteit van de repressie van onze intron gebaseerde onderdrukking systeem groter is dan de transcriptionele sterkte van de geteste initiatiefnemers. In deze intron gebaseerde benadering is het waarschijnlijk dat de repressie is bemiddeld door fysieke interferentie tussen twee componenten, de transcriptie rek machine en het lac repressors57. Dit eenvoudige onderdrukking mechanisme en de aangetoonde robuustheid van de intron gebaseerde methode kunnen betekenen dat deze aanpak in het algemeen regels tot verschillende genen, weefsels, en organismen.

De opregulatie door de afstandsbediening systeem vereist de transactivator bindende sequenties in de nabijheid van de target gene promotor, die dreigen van invloed zijn op de functie van de promotor. Echter vonden we dat betreffendedepositie van bindende sequenties buiten de transcriptionally kritische regio kunnen. Zowel Dnmt1 als EF1α de initiatiefnemers waren krachtig upregulated van tet exploitanten ligt een paar honderd honken stroomopwaarts van de transcriptie start sites10. Deze ontspannen beperking vermindert aanzienlijk de kans van invloed zijn op de functie van de promotor van een gen van de doelgroep in het ontbreken van de transactivator. Verhoging van het aantal bindende sequenties en/of gebruik van sterkere transactivators kon helpen verder het risico doordat opregulatie van sites verder weg van de transcriptie begin site.

Ons systeem afstandsbediening biedt elegante controle van het niveau, de timing en de locatie van de endogene genexpressie, waardoor voor het testen van de omkeerbaarheid van een fenotype en de gevolgen van andere expressie niveaus, die niet gemakkelijk haalbaar door huidige in vivo gen expressie-besturingstechnologieën. Het is belangrijk op te merken dat in de meeste gen expressie analyses, met inbegrip van onze, expressie waarden het gemiddelde van een bevolking van cellen vertegenwoordigen, waaronder aanzienlijke variatie kan worden gevonden. Deze heterogeniteit invloed kan hebben op cellulaire besluitvormingsprocessen, zoals differentiatie of apoptosis58. Hoewel de precisie van gen expressie controle kan waarschijnlijk verder worden verbeterd door extra genetische circuit engineering59, zal de waargenomen sterkte van ons huidige systeem nuttig onderzoek van de genfunctie in veel biologische contexten toestaan. Bovendien is een hoge mate van doel specificiteit verwachting vanwege de complexiteit van de sequenties die exploitant, alsmede de grote evolutionaire afstand tussen zoogdieren en de oorspronkelijke soorten de regelgevende onderdelen60. Bovendien kunnen transgene muis lijnen van repressors en activators worden ontwikkeld en werkzaam voor een endogene gen. Bestaande Muismodellen van de tet transactivator kunnen bijvoorbeeld worden aangepast opregulatie van een target-gen in de gewenste muis weefsels bereiken. Wij recent ontwikkelde een transgene lijn die robuust weefsel-specifieke uitdrukking van onze verbeterde lac-onderdrukker in meerdere weefseltypes (HLA rijden kan) in combinatie met bestaande Cre lijnen door de invoering van het lacIGY -gen in de locus Hipp11 48 onder de controle van een element van de Lox-STOP-Lox (niet uitgegeven). Deze regel zou aanzienlijk vergemakkelijken van de weefsel-specifieke toepassing van het systeem van de afstandsbediening.

Gene opregulatie door het afstandsbediening systeem biedt verschillende voordelen in vergelijking met de huidige afleidbare transgene benaderingen. Het vereist geen generatie van meerdere transgene lijnen om te testen voor de effecten van de positie van de invoegpositie, zoals het maakt gebruik van de endogene locus. Bovendien, is deze aanpak geschikt voor opregulatie van genen met sterke basislijn uitdrukking omdat het verbetert de expressie van een reeds robuuste promotor, overwegende dat conventionele transgene modellen op minimale virale initiatiefnemers vertrouwen. Tot slot, het weefsel specificiteit, celcyclus controle, egaliseren en lamineren varianten van een target-gen kunnen worden gehandhaafd op opregulatie door onze aanpak, daar het behoudt onderdelen van natuurlijke verordening zoals aangeboren cis-regelgevende elementen. De komst van CRISPR/Cas-gemedieerde gentargeting technologie zal aanzienlijk vergemakkelijken van de toepassing van deze technologie in verschillende modelsystemen.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PWL serveert op de wetenschappelijke Advisory Boards van AnchorDx en Progenity, Inc

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken de wijlen Dr. Heidi Scrable voor haar gulle gift van de zoogdieren lacI gene construct (Mayo Clinic, Rochester, MN), Dr Daniel Louvard (Institut Curie, Parijs, Frankrijk) voor het verstrekken van de promotor van de Villin, en Dr Laurie Jackson-Grusby (Children's Hospital, Boston, MA) voor haar bijdragen aan de vroege stadia van de technologieontwikkeling van deze. We zijn dankbaar voor Dr Nancy Wu en Dr. Robert Maxson voor hun hulp bij het genereren van de transgene en knockout muizen. Wij danken de leden van de Laird laboratorium voor nuttige discussies en ondersteunen. Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health [R01 CA75090, R01 DA030325 R01 CA157918 en R01 CA212374 te P.W.L. en 1F31CA213897-01A1 naar N.A.V.S].

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
B6C3F1/JThe Jackson Laboratory100010https://www.jax.org/strain/100010
Cas9 ProteinPNA BioCP04http://www.pnabio.com/products/CRISPR_Cas9.htm?gclid=EAIaIQobChMIsoG8pLL33QIVBr7ACh0naQ4dEAAYAiAAEgKyHvD_BwE
CRISPORHaeussler et al. 2016http://crispor.tefor.net/
Doxycycline-Bevattend MuisdieetEnvigoVaries by concentratiehttps://www.envigo.com/products-services/teklad/laboratory-animal-diets/custom-research/doxycycline-diets/
ENCODE DatabaseStanford Universityhttps://www.encodeproject.org/
iCre mRNA-syntheseplasmide (pBBI)Addgene65795https://www.addgene.org/65795/
IPTGGoldBioI2481Chttps://www.goldbio.com/search?isSearch=Y&q=iptg
pGL3-BasicPromegaE1751https://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/pgl3-luciferase-reporter-vectors/?catNum=E1751
SVM-BPfinderRegulatory Genomics, Pompeu Fabra Universityhttp://regulatorygenomics.upf.edu/Software/SVM_BP/
TiProD: Weefselspecifiek promotordatabaseDepartment of Bioinformatics, UMG, University of Göttingen http://tiprod.bioinf.med.uni-goettingen.de
UCSC Genome BrowserUniversity of California Santa Cruzhttps://genome.ucsc.edu/
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jackson-Grusby, L., et al. Loss of genomic methylation causes p53-dependent apoptosis and epigenetic deregulation. Nature Genetics. 27 (1), 31-39 (2001).
  2. David, G., Turner, G. M., Yao, Y., Protopopov, A., DePinho, R. A. mSin3-associated protein, mSds3, is essential for pericentric heterochromatin formation and chromosome segregation in mammalian cells. Genes & Development. 17 (19), 2396-2405 (2003).
  3. Sumi-Ichinose, C., Ichinose, H., Metzger, D., Chambon, P. SNF2beta-BRG1 is essential for the viability of F9 murine embryonal carcinoma cells. Molecular and Cellular Biology. 17 (10), 5976-5986 (1997).
  4. Premsrirut, P. K., et al. A rapid and scalable system for studying gene function in mice using conditional RNA interference. Cell. 145 (1), 145-158 (2011).
  5. Qiu, S., Adema, C. M., Lane, T. A computational study of off-target effects of RNA interference. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1834-1847 (2005).
  6. Gilbert, L. A., et al. Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
  7. Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
  8. Peng, H., Ivanov, A. V., Oh, H. J., Lau, Y. F., Rauscher, F. J. Epigenetic gene silencing by the SRY protein is mediated by a KRAB-O protein that recruits the KAP1 co-repressor machinery. The Journal of Biological Chemistry. 284 (51), 35670-35680 (2009).
  9. Groner, A. C., et al. KRAB-zinc finger proteins and KAP1 can mediate long-range transcriptional repression through heterochromatin spreading. PLOS Genetics. 6 (3), 1000869(2010).
  10. Lee, K. H., Oghamian, S., Park, J. A., Kang, L., Laird, P. W. The REMOTE-control system: a system for reversible and tunable control of endogenous gene expression in mice. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12256-12269 (2017).
  11. Gossen, M., Bonin, A. L., Bujard, H. Control of gene activity in higher eukaryotic cells by prokaryotic regulatory elements. Trends in Biochemical Sciences. 18 (12), 471-475 (1993).
  12. Hu, M. C., Davidson, N. The inducible lac operator-repressor system is functional in mammalian cells. Cell. 48 (4), 555-566 (1987).
  13. Cronin, C. A., Gluba, W., Scrable, H. The lac operator-repressor system is functional in the mouse. Genes & Development. 15 (12), 1506-1517 (2001).
  14. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  15. Council, N. R. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals: Eighth Edition. , The National Academies Press. (2011).
  16. Casper, J., et al. The UCSC Genome Browser database: 2018 update. Nucleic Acids Research. 46 (1), 762-769 (2018).
  17. Church, D. M., et al. Lineage-specific biology revealed by a finished genome assembly of the mouse. PLOS Biology. 7 (5), 1000112(2009).
  18. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  19. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
  20. Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nature Genetics. 39 (3), 311-318 (2007).
  21. Rada-Iglesias, A., et al. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).
  22. Handoko, L., et al. CTCF-mediated functional chromatin interactome in pluripotent cells. Nature Genetics. 43 (7), 630-638 (2011).
  23. Splinter, E., et al. CTCF mediates long-range chromatin looping and local histone modification in the beta-globin locus. Genes & Development. 20 (17), 2349-2354 (2006).
  24. The ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  25. Rosenbloom, K. R., et al. ENCODE data in the UCSC Genome Browser: year 5 update. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 56-63 (2013).
  26. Murray, J. I., Voelker, R. B., Henscheid, K. L., Warf, M. B., Berglund, J. A. Identification of motifs that function in the splicing of non-canonical introns. Genome Biology. 9 (6), 97(2008).
  27. Taggart, A. J., et al. Large-scale analysis of branchpoint usage across species and cell lines. Genome Research. 27 (4), 639-649 (2017).
  28. Corvelo, A., Hallegger, M., Smith, C. W., Eyras, E. Genome-wide association between branch point properties and alternative splicing. PLOS Computational Biology. 6 (11), 1001016(2010).
  29. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148(2016).
  30. Grainger, S., et al. CRISPR Guide RNA Validation In Vitro. Zebrafish. 14 (4), 383-386 (2017).
  31. Quadros, R. M., Harms, D. W., Ohtsuka, M., Gurumurthy, C. B. Insertion of sequences at the original provirus integration site of mouse ROSA26 locus using the CRISPR/Cas9 system. FEBS Open Bio. 5, 191-197 (2015).
  32. Harms, D. W., et al. Mouse Genome Editing Using the CRISPR/Cas System. Current Protocols in Human Genetics. 83, (2014).
  33. Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13 (1), 195-215 (2018).
  34. Laird, P. W., et al. Simplified mammalian DNA isolation procedure. Nucleic Acids Research. 19 (15), 4293(1991).
  35. Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nature Biotechnology. 36 (8), 765-771 (2018).
  36. Akcakaya, P., et al. In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations. Nature. 561 (7723), 416-419 (2018).
  37. Lazzarotto, C. R., et al. Defining CRISPR-Cas9 genome-wide nuclease activities with CIRCLE-seq. Nature Protocols. 13 (11), 2615-2642 (2018).
  38. Ohtsuka, M., et al. Improvement of pronuclear injection-based targeted transgenesis (PITT) by iCre mRNA-mediated site-specific recombination. Transgenic Research. 22 (4), 873-875 (2013).
  39. Ohtsuka, M., et al. Pronuclear injection-based mouse targeted transgenesis for reproducible and highly efficient transgene expression. Nucleic Acids Research. 38 (22), 198(2010).
  40. Lee, G., Saito, I. Role of nucleotide sequences of loxP spacer region in Cre-mediated recombination. Gene. 216 (1), 55-65 (1998).
  41. Thomson, J. G., Rucker, E. B., Piedrahita, J. A. Mutational analysis of loxP sites for efficient Cre-mediated insertion into genomic DNA. Genesis. 36 (3), 162-167 (2003).
  42. Cho, A., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. Generation of Transgenic Mice. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter Unit-19.11 (2009).
  43. Pu, X. A., Young, A. P., Kubisch, H. M. Production of Transgenic Mice by Pronuclear Microinjection. Methods in Molecular Biology. 1874, 17-41 (2019).
  44. Murgha, Y., et al. Combined in vitro transcription and reverse transcription to amplify and label complex synthetic oligonucleotide probe libraries. Biotechniques. 58 (6), 301-307 (2015).
  45. Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18 (1), 92(2017).
  46. Chen, X., Wu, J. M., Hornischer, K., Kel, A., Wingender, E. TiProD: the Tissue-specific Promoter Database. Nucleic Acids Research. 34, Database issue 104-107 (2006).
  47. Haruyama, N., Cho, A., Kulkarni, A. B. Overview: Engineering transgenic constructs and mice. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter Unit-19.10 (2009).
  48. Tasic, B., et al. Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7902-7907 (2011).
  49. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
  50. Wyborski, D. L., DuCoeur, L. C., Short, J. M. Parameters affecting the use of the lac repressor system in eukaryotic cells and transgenic animals. Environmental and Molecular Mutagenesis. 28 (4), 447-458 (1996).
  51. Wyborski, D. L., Short, J. M. Analysis of inducers of the E.coli lac repressor system in mammalian cells and whole animals. Nucleic Acids Research. 19 (17), 4647-4653 (1991).
  52. Traykova-Brauch, M., et al. An efficient and versatile system for acute and chronic modulation of renal tubular function in transgenic mice. Nature Medicine. 14 (9), 979-984 (2008).
  53. Michel, G., Mosser, J., Fauran, F. Serum kinetics of doxycycline polyphosphate in dogs. European Journal of Drug Metabolism and Pharmacokinetics. 4 (1), 43-48 (1979).
  54. Bertocchi, I., et al. Regulatory functions of limbic Y1 receptors in body weight and anxiety uncovered by conditional knockout and maternal care. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19395-19400 (2011).
  55. Plageman, T. F., Lang, R. A. Generation of an Rx-tTA: TetOp-Cre knock-in mouse line for doxycycline regulated Cre activity in the Rx expression domain. PLOS One. 7 (11), 50426(2012).
  56. Mollova, M., et al. Cardiomyocyte proliferation contributes to heart growth in young humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1446-1451 (2013).
  57. Ptashne, M. Principles of a switch. Nature Chemical Biology. 7 (8), 484-487 (2011).
  58. Balazsi, G., van Oudenaarden, A., Collins, J. J. Cellular decision making and biological noise: from microbes to mammals. Cell. 144 (6), 910-925 (2011).
  59. Nevozhay, D., Zal, T., Balazsi, G. Transferring a synthetic gene circuit from yeast to mammalian cells. Nature Communications. 4, 1451(2013).
  60. Labow, M. A., Baim, S. B., Shenk, T., Levine, A. J. Conversion of the lac repressor into an allosterically regulated transcriptional activator for mammalian cells. Molecular and Cellular Biology. 10 (7), 3343-3356 (1990).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Omkeerbare gencontrolelac repressieTet activatieIPTG inductiedoxycyclinebehandelinggenexpressieanalyseintron engineeringtranscriptionele regulatie

Gerelateerde artikelen