Methodenartikel

Snelle evaluatie van de toxiciteit van chemische verbindingen met behulp van zebravis embryo's

DOI:

10.3791/59315

⸱

25 augustus 2019

 ,  ,  , 
1Faculty of Medicine and Health Technology, Tampere University, 2Oral and Maxillofacial Unit, Tampere University Hospital, 3Fimlab Ltd, Tampere University Hospital

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebravis embryo's worden gebruikt voor het evalueren van de toxiciteit van chemische verbindingen. Ze ontwikkelen zich extern en zijn gevoelig voor chemicaliën, waardoor subtiele fenotypische veranderingen kunnen worden opgespoord. Het experiment vereist slechts een kleine hoeveelheid stof, die direct wordt toegevoegd aan de plaat die embryo's bevat, waardoor het testsysteem efficiënt en kosteneffectief is.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De zebravis is een algemeen gebruikte modelorganisme voor de ziekte en fenotype-based drug Discovery. De zebravis genereert veel nakomelingen, heeft transparante embryo's en een snelle externe ontwikkeling. Zebravis embryo's kunnen daarom ook worden gebruikt voor de snelle evaluatie van de toxiciteit van de geneesmiddelen die kostbaar zijn en in kleine hoeveelheden beschikbaar zijn. In dit artikel wordt een methode beschreven voor het efficiënt screenen van de toxiciteit van chemische verbindingen met 1-5-Day Post fertilisatie embryo's. De embryo's worden gecontroleerd door stereomicroscoop om de fenotypische defecten te onderzoeken die worden veroorzaakt door de blootstelling aan verschillende concentraties van verbindingen. Half-maximale dodelijke concentraties (LC50) van de verbindingen worden ook bepaald. De huidige studie vereiste 3-6 mg van een verbinding van de remmer, en het hele experiment duurt ongeveer 8-10 h worden voltooid door een individu in een laboratorium met basisvoorzieningen. Het huidige protocol is geschikt voor het testen van een verbinding om onverdraaglijke toxische of off-target effecten van de compound in de vroege fase van de opsporing van geneesmiddelen te identificeren en om subtiele toxische effecten te detecteren die kunnen worden gemist in de celkweek of andere diermodellen. De methode vermindert de procedurele vertragingen en de kosten van de ontwikkeling van geneesmiddelen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ontwikkeling van geneesmiddelen is een kostbaar proces. Voordat een enkele chemische verbinding wordt goedgekeurd door de Food and Drug Administration (FDA) en Europees Geneesmiddelenbureau (EMA) enkele duizend verbindingen worden gescreend tegen een kostprijs van meer dan 1.000.000.000 dollar1. Tijdens de preklinische ontwikkeling is het grootste deel van deze kosten vereist voor de dierproeven2. Om de kosten te beperken, hebben onderzoekers op het gebied van Geneesmiddelenontwikkeling alternatieve modellen nodig voor de veiligheids screening van chemische verbindingen3. Daarom, in de vroege fase van de ontwikkeling van het geneesmiddel, het zou zeer gunstig zijn voor het gebruik van een methode die snel de veiligheid en de toxiciteit van de verbindingen in een geschikt model kan evalueren. Er zijn verschillende protocollen die zijn gebruikt voor de toxiciteits screening van chemische verbindingen waarbij dier-en celkweek modellen zijn betrokken, maar er is geen enkel protocol dat wordt gevalideerd en dat gemeenschappelijk wordt gebruikt4,5. Bestaande protocollen die zebravis gebruiken, variëren in lengte en zijn gebruikt door individuele onderzoekers die de toxiciteit hebben geëvalueerd aan de hand van hun gemak vereiste6,7,8,9, 10 , 11 , 12.

In het recente verleden is de zebravis naar voren gekomen als een handig model voor de evaluatie van de toxiciteit van chemische verbindingen tijdens de embryonale ontwikkeling op6,7. De zebravis heeft veel ingebouwde voordelen voor de evaluatie van chemische verbindingen13. Zelfs grootschalige experimenten zijn vatbaar, omdat een zebravis-vrouw batches van 200-300 eieren kan leggen, die snel ex vivoontwikkelen, geen externe voeding nodig hebben voor maximaal een week en transparant zijn. De verbindingen kunnen direct in het water worden toegevoegd, waar ze kunnen (afhankelijk van de aard van de compound) diffuus door de chorion, en na het uitkomen, door de huid, kieuwen en de mond van larven. De experimenten vereisen geen overvloedige hoeveelheden chemische verbindingen14 vanwege de geringe omvang van het embryo. Het ontwikkelen van zebravis embryo's Express de meeste eiwitten die nodig zijn om het normale ontwikkelings resultaat te bereiken. Daarom is een zebravis embryo een gevoelig model om te beoordelen of een potentieel medicijn de functie van een eiwit of signalerings molecuul dat ontwikkelend significant is, kan verstoren. De organen van de zebravis worden functioneel tussen 2-5 DPF15, en verbindingen die giftig zijn tijdens deze gevoelige periode van embryonale ontwikkeling induceren fenotypische defecten in zebravis larven. Deze fenotypische veranderingen kunnen gemakkelijk worden gedetecteerd met behulp van een eenvoudige Microscoop zonder invasieve technieken11. Zebravis embryo's worden veel gebruikt in toxicologisch onderzoek vanwege hun veel grotere biologische complexiteit in vergelijking met in vitro geneesmiddelen screening met behulp van celkweek modellen16,17.  Als gewervelde is de genetische en fysiologische make-up van zebravis vergelijkbaar met de mens en daarom zijn de toxiciteiten van chemische verbindingen vergelijkbaar tussen zebravis en mensen8,18,19, 20 , 21 , 22. zebravis is dus een waardevol hulpmiddel in de vroege fase van de geneesmiddelen ontdekking voor de beoordeling van de toxiciteit en de veiligheid van de chemische verbindingen.

In dit artikel geven we een gedetailleerde beschrijving van de methode die wordt gebruikt voor het evalueren van de veiligheid en de toxiciteit van koolzuuranhydrase (CA) remmer-verbindingen met behulp van 1-5-Day Post fertilisatie (DPF) zebravis-embryo's door een enkele onderzoeker. Het protocol omvat het blootstellen van zebravis embryo's aan verschillende concentraties van chemische remmer verbindingen en het bestuderen van de sterfte en fenotypische veranderingen tijdens de embryonale ontwikkeling. Aan het einde van de blootstelling aan de chemische verbindingen wordt de LC50 dosis van de chemische stof bepaald. De methode stelt een individu in staat om efficiënte screening van 1-5 test verbindingen uit te voeren en duurt ongeveer 8-10 uur, afhankelijk van de ervaring van de persoon met de methode (Figuur 1). Elk van de stappen die nodig zijn om de toxiciteit van de verbindingen te beoordelen, wordt beschreven in Figuur 2. De beoordeling van de toxiciteit van CA-remmers vereist 8 dagen, en omvat het instellen van parings paren (dag 1); inzameling van embryo's uit kweek tanks, reiniging en overbrenging naar een broedplaats van 28,5 °C (dag 2); verdeling van de embryo's in de putjes van een 24-putplaat en toevoeging van verdunde CA-remmer verbindingen (dag 3); Fenotypische analyse en beeldvorming van larven (dag 4-8), en bepaling van LC50 dosis (day8).  Deze methode is snel en efficiënt, vereist een kleine hoeveelheid van de chemische verbinding en alleen basisvoorzieningen van het laboratorium.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De kern faciliteit van zebravis aan de Universiteit van Tampere heeft een vestigingsvergunning verleend door de National Animal experiment Board (esavi/7975/04.10.05/2016). Alle experimenten met behulp van zebravis embryo's werden uitgevoerd volgens de provinciale overheid van Oost-Finland, sociale en gezondheidsafdeling van Tampere Regional Service Unit protocol # LSLH-2007-7254/YM-23.

1. opzetten van overnight zebravis parings tanks

  1. Plaats 2-5 volwassen mannelijke zebravis en 3-5 volwassen vrouwelijke zebravis in paren tanks 's nachts. (Fokken wordt opgewekt in de ochtend door automatische donkere en lichte cyclus 's nachts).
  2. Stel verschillende kruisen in om voldoende embryo's te verkrijgen voor de beoordeling van de toxiciteit van meer dan twee chemische verbindingen. Voor de beoordeling van de toxiciteit heeft elke concentratie minimaal 20 embryo's23nodig.
  3. Om te voorkomen dat de dieren omgaan met stress, laat u de dieren 2 weken rusten voordat u dezelfde individuen voor de fokkerij gebruikt.

2. inzameling van embryo's en bereiding van platen voor blootstelling aan de chemische verbindingen

  1. Verzamel de embryo's, de volgende dag voor de middag, met behulp van een fijnzeef en breng ze over in een Petri schaaltje met E3 embryo medium [5,0 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mm MgSO4en 0,1% w/v methyleenblauw].
  2. Verwijder vuil met een plastic Pasteur-Pipet (bijv. voedsel en vast afval). Onderzoek elke partij embryo's onder de stereomicroscoop om de niet-bevruchte/dode embryo's te verwijderen (geïdentificeerd door hun ondoorzichtige verschijning).
  3. Houd de embryo's bij 28,5 °C in een incubator. Onderzoek de embryo's, de volgende ochtend onder een stereomicroscoop en verwijder ongezonde of dode embryo's. Vervang ook het oude E3 medium met Fresh E3 medium.
    Letop: zebravis embryo's worden altijd op 28,5 °c gehouden onder laboratoriumomstandigheden.
  4. Breng 1 embryo zorgvuldig over in elke put van een 24-put plaat met voldoende E3 medium om de embryo's te bedekken.

3. preparaten van de stamoplossing van chemische verbindingen en verdeling van de verdunde verbinding in de putjes

  1. Neem de injectieflacons met remmer-verbindingen op die bij 4 °C zijn opgeslagen.
    Opmerking: afhankelijk van de eigenschappen van de compound, deze worden opgeslagen bij verschillende temperaturen.
  2. Weeg de compound (s) met behulp van een analytische balans die een paar milligram (mg) van de verbinding nauwkeurig kan wegen.
  3. Bereid ten minste 250 μL (100 mM) van de stamoplossing voor elke verbinding in een geschikt oplosmiddel (bijvoorbeeld E3 water of dimethylsulfoxide (DMSO), op basis van de oplosbaarheids eigenschappen van de verbindingen.
    Opmerking: de bovenstaande stappen kunnen worden gedaan een dag voor het begin van het experiment op een geschikte tijd en opgeslagen bij 4 °c).
  4. Maak seriële verdunningen van de stamoplossingen (bijvoorbeeld 10 μM, 20 μM, 50 μM, 100 μM, 150 μM, 300 μM en 500 μM) met behulp van E3 water in 15 mL centrifugebuizen.
    Opmerking: de concentraties en het aantal seriële verdunningen variëren van de ene verbinding naar een andere verbinding, afhankelijk van hun toxiciteitsniveaus.
  5. Verwijder vanaf de 24 goed plaat die embryo's bevat, E3 water uit de putten met een Pasteur-pipet en een pipet van 1 mL (met 1 DPF-embryo's) één rij per keer.
  6. Verdeel 1 mL van elk verdunningsmiddel in elk putje (beginnend met lager en verplaats naar een hogere concentratie) in de putjes van 24-putplaat.
  7. Stel een controlegroep in van dezelfde partij embryo's en voeg de overeenkomstige hoeveelheid verdunningsmiddel toe.
  8. Etiket 24-put platen met de naam en de concentratie van de verbinding en houd de platen bij 28,5 ° c in een incubator.

4. fenotypische analyse en beeldvorming van de embryo's met een stereomicroscoop

  1. Onderzoek de embryo's onder een stereomicroscoop voor parameters 24 uur na blootstelling aan de chemische verbindingen.
    1. Noteer de parameters zoals sterfte, broedeieren, hartslag, gebruik van dooier zak, ontwikkeling van de zwemblaas, beweging van de vis, pericardiale oedeem en vorm van het lichaam23.
    2. Neem de larven blootgesteld aan elke concentratie van de verbinding en leg ze opzij in een klein Petri schaaltje met 3% hoog moleculair gewicht methylcellulose met behulp van een metalen sonde.
      Opmerking: de 3% methylcellulose (hoog moleculair met) is een viskeuze vloeistof die nodig is voor het insluiten van de vis met een vereiste oriëntatie voor microscopisch onderzoek. Voor het oriënteren van de vissen in deze vloeistof, is een metalen sonde nodig.
    3. Neem de afbeeldingen met behulp van stereomicroscoop aangesloten op een camera. Sla de afbeeldingen elke dag op in een afzonderlijke map tot het einde van het experiment.
    4. Voer elke dag alle observaties in een tabel in een online tabel of op een afgedrukt blad in.
    5. Als de verbindingen neurotoxisch zijn, kunnen de 4 tot 5 DPF-larven een gewijzigd zwem patroon vertonen, een record van dergelijke veranderingen maken door een korte video (30 s tot 1 min) te vangen van de larven die een afwijkend bewegingspatroon vertonen.
    6. Noteer na 5 dagen blootstelling aan de chemische verbindingen de concentratie waarbij de helft van de embryo's sterft voor de berekening van de helft van de maximale dodelijke concentratie 50 (LC50) van elke chemische stof.
      Nb: de LC50 is de concentratie waarbij 50% van de embryo's sterft aan het einde van 5 dagen blootstelling aan een chemische verbinding. Gebruik minimaal 20 embryo's voor het testen van de toxiciteit van elke concentratie van een samengestelde23.
    7. Construeer een curve voor de sterfte van embryo's voor alle concentraties met behulp van een geschikt programma.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het kritische deel van de evaluatie van toxiciteit is het testen van verschillende concentraties van één of meerdere chemische verbindingen in één experiment. In het begin, selecteer de verbindingen voor de beoordeling van de toxiciteit, het aantal concentraties om te testen voor elke compound, en dienovereenkomstig, maak een grafiek (Figuur 3). We gebruikten een unieke kleur voor elke compound om de monsters te ordenen (Figuur 3...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vitro toxiciteitstest met behulp van gekweekte cellen kan overleven en morfologische studies van de cellen die beperkte informatie over de toxiciteit geïnduceerd door de teststof te detecteren. Het voordeel van toxiciteits screening van chemische verbindingen met behulp van zebravis embryo's is een snelle detectie van chemisch geïnduceerde fenotypische veranderingen in een heel dier tijdens de embryonale ontwikkeling in een relevant modelorganisme. Ongeveer 70% van de eiwit codering menselijke genen hebben or...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er werd geen potentiële belangenverstrengeling gerapporteerd door de auteurs.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het werk werd gesteund door subsidies van Sigrid Juselius Foundation (SP, MP), Fins Cultural Foundation (AA, MH), Academy of Finland (SP, MP), Orion Farmos Foundation (MH), Tampere Tuberculosefonds (SP, MH en MP) en Jane en Aatos Erkko Foundation (SP en MP ). We danken onze Italiaanse en Franse medewerkers, Prof. Supuran, en Prof. Winum, voor het leveren van koolzuuranhydraseremmers voor de veiligheid en toxiciteit bij de evaluatie van anti-TUBERCULOSE en anti-kankergeneesmiddelen ontwikkeling. Wij danken Aulikki Lehmus en Marianne Kuuslahti voor de technische bijstand. We bedanken ook Leena Mäkinen en Hannaleena Piippo voor hun hulp bij het fokken van zebravis en het verzamelen van embryo's. We danken Harlan Barker oprecht voor de kritische evaluatie van het manuscript en inzichtelijke commentaren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
24-well platenNuncThermo Scientific
Weegschaal (Weegschaal)KERNPLJ3000-2CM
Weegschaal (Weegschaal)Mettler ToledoAB104-S/PH
CaCl2JT.BakerRS421910024
DissectiepenThermo Scientific17-467-604 
DMSOSigma Aldrich, DuitslandD4540
Falconbuisjes 15 mLGreiner bio-one188271
Methylcellulose met hoog molecuulgewichtSigma Aldrich, DuitslandM0262 
Incubator voor zebravislarvenTermaksB8000
KCLMerck1.04936.0500
MethylblauwSigma Aldrich, Duitsland28983-56-4
MgSO4Sigma Aldrich, DuitslandM7506
MicrocentrifugebuisjesStarlabS1615-5500
NaClVWR Chemicals27810.295
Paraffine Histoplast IMThermo Scientific8331
Pasteurpipet Sarstedt86.1171
PetrischaalThermo Scientific101R20 
PetrischalenSarstedt82.1473
Pipet (1 mL en 200 μL)Thermo Scientific4641230N, 4641210N  
Platen 24-WellThermo Scientific142485
Steriomicroscoop/CameraZeissStemi 2000-C/Axiocam 105 color
Flesjes (1,5 mL)Fisherbrand11569914
Zebravis AB-stammenZIRC   ZL1 

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Amaouche, N., Casaert Salome, H., Collignon, O., Santos, M. R., Ziogas, C. Marketing authorization applications submitted to the European Medicines Agency by small and medium-sized enterprises: an analysis of major objections and their impact on outcomes. Drug Discovery Today. 23 (10), 1801-1805 (2018).
  2. Garg, R. C., Bracken, W. M., Hoberman, A. M. Reproductive and developmental safety evaluation of new pharmaceutical compounds. Reproductive and Developmental Toxicology. Gupta, R. C. , Elsevier. Boston, MA, USA. 89-109 (2011).
  3. Lee, H. Y., Inselman, A. L., Kanungo, J., Hansen, D. K. Alternative models in developmental toxicology. Systems Biology in Reproductive Medicine. 58 (1), 10-22 (2012).
  4. Gao, G., Chen, L., Huang, C. Anti-cancer drug discovery: update and comparisons in yeast, Drosophila, and zebrafish. Current Molecular Pharmacology. 7 (1), 44-51 (2014).
  5. Brown, N. A. Selection of test chemicals for the ECVAM international validation study on in vitro embryotoxicity tests. European Centre for the Validation of Alternative Methods. Alternatives to Laboratory Animals. 30 (2), 177-198 (2002).
  6. Selderslaghs, I. W., Van Rompay, A. R., De Coen, W., Witters, H. E. Development of a screening assay to identify teratogenic and embryotoxic chemicals using the zebrafish embryo. Reproductive Toxicology. 28 (3), Elmsford, N.Y. 308-320 (2009).
  7. Brannen, K. C., Panzica-Kelly, J. M., Danberry, T. L., Augustine-Rauch, K. A. Development of a zebrafish embryo teratogenicity assay and quantitative prediction model. Birth Defects Research Part B Developmental and Reproductive Toxicology. 89 (1), 66-77 (2010).
  8. Hermsen, S. A., van den Brandhof, E. J., van der Ven, L. T., Piersma, A. H. Relative embryotoxicity of two classes of chemicals in a modified zebrafish embryotoxicity test and comparison with their in vivo potencies. Toxicology in Vitro. 25 (3), 745-753 (2011).
  9. Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): a vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (3), 268-280 (2011).
  10. Lantz-McPeak, S., et al. Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos. Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).
  11. Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. Evaluation of embryotoxicity using the zebrafish model. Methods in Molecular Biology. 691, 271-279 (2011).
  12. Rodrigues, G. C., et al. Design, synthesis, and evaluation of hydroxamic acid derivatives as promising agents for the management of Chagas disease. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (2), 298-308 (2014).
  13. Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S. F., Paule, M. G. Zebrafish model in drug safety assessment. Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).
  14. Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 12965-12969 (2000).
  15. Stainier, D. Y., Fishman, M. C. The zebrafish as a model system to study cardiovascular development. Trends in Cardiovascular Medicine. 4 (5), 207-212 (1994).
  16. Aspatwar, A., et al. Nitroimidazole-based inhibitors DTP338 and DTP348 are safe for zebrafish embryos and efficiently inhibit the activity of human CA IX in Xenopus oocytes. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 33 (1), 1064-1073 (2018).
  17. Rami, M., et al. Hypoxia-targeting carbonic anhydrase IX inhibitors by a new series of nitroimidazole-sulfonamides/sulfamides/sulfamates. Journal of Medicinal Chemistry. 56 (21), 8512-8520 (2013).
  18. Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research--advantages and current limitations. Toxicologic Pathology. , Suppl 31. 62-87 (2003).
  19. Teraoka, H., et al. Induction of cytochrome P450 1A is required for circulation failure and edema by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in zebrafish. Biochemical and Biophysical Research Communications. 304 (2), 223-228 (2003).
  20. Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
  21. Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).
  22. Kari, G., Rodeck, U., Dicker, A. P. Zebrafish: an emerging model system for human disease and drug discovery. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 82 (1), 70-80 (2007).
  23. Gourmelon, A., Delrue, N. Validation in Support of Internationally Harmonised OECD Test Guidelines for Assessing the Safety of Chemicals. Advances in Experimental Medicine and Biology. 856, 9-32 (2016).
  24. Aspatwar, A., et al. beta-CA-specific inhibitor dithiocarbamate Fc14-584B: a novel antimycobacterial agent with potential to treat drug-resistant tuberculosis. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 32 (1), 832-840 (2017).
  25. Kazokaite, J., Aspatwar, A., Kairys, V., Parkkila, S., Matulis, D. Fluorinated benzenesulfonamide anticancer inhibitors of carbonic anhydrase IX exhibit lower toxic effects on zebrafish embryonic development than ethoxzolamide. Drug and Chemical Toxicology. 40 (3), 309-319 (2017).
  26. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  27. Granato, M., Nusslein-Volhard, C. Fishing for genes controlling development. Current Opinion in Genetics & Development. 6 (4), 461-468 (1996).
  28. Bambino, K., Chu, J. Zebrafish in Toxicology and Environmental Health. Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).
  29. Goldsmith, P. Zebrafish as a pharmacological tool: the how, why and when. Current Opinion in Pharmacology. 4 (5), 504-512 (2004).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

ToxiciteitsscreeningLC50 bepalingstereomicroscoopanalyseseri le verdunningfenotypische defectenembryo mediumgeneesmiddelenontwikkelingembryonale mortaliteit

Gerelateerde artikelen