Methodenartikel

Chromatische immunoprecipitatie test met behulp van Micrococcal nucleasen in zoogdiercellen

DOI:

10.3791/59375

⸱

10 mei 2019

 , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, Beckman Research Institute of City of Hope

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chromatin immunoprecipitatie (chip) is een krachtig hulpmiddel voor het begrijpen van de moleculaire mechanismen van genregulatie. De methode omvat echter moeilijkheden bij het verkrijgen van reproduceerbare chromatine fragmentatie door mechanische afschuiving. Hier bieden we een verbeterd protocol voor een ChIP assay met enzymatische spijsvertering.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om cellulaire fenotypes in organismen te uiten, voeren levende cellen de genexpressie dienovereenkomstig uit, en transcriptionele Programma's spelen een centrale rol in genexpressie. De cellulaire transcriptionele machines en de chromatine modificatie eiwitten coördineren om transcriptie te reguleren. Om transcriptionele regulering op moleculair niveau te analyseren, zijn verschillende experimentele methoden beschikbaar, zoals elektroforetisch mobiliteits verschuiving, voorbijgaande reporter en Chromatine-immunoprecipitatie (chip)-assays. In dit artikel beschrijven we een gemodificeerde ChIP assay in detail vanwege de voordelen van het direct tonen van Histon-modificaties en de interacties tussen eiwitten en DNA in cellen. Een van de belangrijkste stappen in een succesvolle ChIP assay is chromatine schuintrekken. Hoewel sonicatie vaak wordt gebruikt voor het scheren van chromatin, is het moeilijk om reproduceerbare omstandigheden te identificeren. In plaats van het scheren van chromatine door sonicatie, gebruikten we enzymatische spijsvertering met micrococcal Nuclease (MNase) om meer reproduceerbare resultaten te verkrijgen. In dit artikel bieden we een eenvoudig ChIP assay protocol met behulp van MNase.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genexpressie in zoogdiercellen is strak en dynamisch gereguleerd, en transcriptie is een van de belangrijkste stappen. Gentranscriptie wordt voornamelijk gereguleerd door transcriptiefactoren en histonen. Een transcriptiefactor is een eiwit dat zich bindt aan specifieke DNA-sequenties en Gene transcriptie regelt. Deze factoren bevorderen of remmen de werving van RNA polymerase II (PolII), waarbij mRNA-synthese van genomisch DNA als sjabloon1initieert. Histon-modificaties zoals acetylering en methylatie van Histon-staart resten positief en negatief beïnvloeden gentranscriptie door het veranderen van de chromatine structuur2. Aangezien veranderingen in genexpressie de cellulaire context beïnvloeden, is het essentieel om de moleculaire mechanismen te onderzoeken waarmee transcriptie wordt gereguleerd.

Tot op heden zijn er verschillende methoden beschikbaar voor het onderzoeken van de regulering van gentranscriptie. Electrophoretic Mobility Shift assay (EMSA), ook wel een gel-Shift-test genoemd, wordt gebruikt voor het analyseren van een eiwit-DNA-interactie3. Een nucleair extract van belang cellen wordt geïnfiltreerd met een radioactieve isotoop (bijvoorbeeld 32P)-GELABELDE DNA-sonde en elektroforesed op een polyacrylamidegel. Het autoradiogram laat zien dat het DNA-eiwit complex langzamer migreert dan de sonde in een gel. In aanwezigheid van een antilichaam tegen het eiwit, migreert het DNA-eiwit-antilichaam complex in een gel langzamer dan het DNA-eiwit complex. Deze oververschoven band onthult een specifieke binding tussen DNA en eiwitten. Echter, EMSA bepaalt alleen een specifieke DNA-eiwit interactie in een cel-vrij systeem, en daarom blijft het onbekend of de interactie besturingselementen transcriptie in levende cellen. De Transient reporter Assay, ook wel bekend als plaats reporter Assay, werd ontwikkeld om genexpressie regulatie in cellen aan te pakken. Typisch, een upstream genomische regio van een gen van belang wordt ingevoegd in een verslaggever plasmide, transitief omgezet in cellen, en de reporter activiteit wordt gemeten. Een verscheidenheid aan deletie mutanten maakt het mogelijk om regio's te identificeren die verantwoordelijk zijn voor genregulatie. Hoewel een reporter assay een nuttig hulpmiddel is voor het identificeren van transcriptiefactoren en bindende DNA-sequenties die transcriptie beheersen, heeft deze methode een groot nadeel doordat een reporter plasmide vrij is van chromatide structuur en niet "echt" weerspiegelt transcriptie machines. Bovendien kunnen wijzigingen in Histon-wijzigingen niet door het systeem worden bepaald.

De ontwikkeling van de Chromatine immunoprecipitatie (chip) methode was gebaseerd op de verslagen van Jackson en chalkley dat "hele cel" fixatie met formaldehyde geconserveerd chromatine structuur4,5. Sindsdien zijn veel verwante technieken ontwikkeld en verbeterd6. In ChIP testen worden cellen vastgezet met formaldehyde om DNA en eiwitten te dwars linken. De chromatine is gefragmenteerd en vervolgens immunoprecipitated met antilichamen van belang. Het Immuuncomplex wordt gewassen en het DNA wordt gezuiverd. PCR-versterking met primers gericht op een bepaalde regio van het genoom onthult de bezetting van eiwitten van belang in het genoom.

Hoewel ChIP een krachtig hulpmiddel is om de interacties van eiwitten zoals transcriptiefactoren en gemodificeerde histonen met DNA te identificeren, omvat de methode enkele moeilijkheden, zoals een chromatine-fragmentatie stap, in de praktijk. Sonicatie is op grote schaal gebruikt voor het schuintrekken van chromatine; het is echter omslachtig om reproduceerbare omstandigheden te identificeren. Micrococcal Nuclease (MNase) behandeling is een alternatieve methode voor chromatine scheren. MNase is een Endo-exonuclease dat dubbel gestrande, enkelvoudig, circulair en lineair DNA en RNA verteerd. Het is relatief eenvoudig om de voorwaarden te bepalen, met inbegrip van de hoeveelheden chromatine en enzym, temperatuur en incubatietijd, voor optimale chromatine fragmentatie. We hebben de bestaande protocollen aangepast en vereenvoudigd, en we hebben een eenvoudige en reproduceerbare methode vastgesteld. Dit artikel verschaft het protocol voor een ChIP assay met MNase in zoogdiercellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. bereiding van de reagentia

  1. Maak 18,5% Paraformaldehyde (PFA) oplossing. Voeg 0,925 g PFA, 4,8 mL water toe (gebruik ultrapurificeerd water in het hele Protocol) en 35 μL van 1 M KOH in een conische plastic buis van 50 mL. Sluit de dop strak en verwarm de buis in een glazen beker van 400-600 mL met ongeveer 200 mL water met behulp van een magnetron. Verwijder de buis voordat het water begint te koken en Vortex de buis om PFA op te lossen. Laat PFA afkoelen tot kamertemperatuur en bewaar op ijs.
    Opmerking: Herhaal verwarmen en mengen tot PFA volledig oplost. Bereid de PFA-oplossing onmiddellijk voor de crosslinking (stap 2.1.3).
  2. Maak 1,25 M glycine oplossing. Los 14,07 g Glycine op in 150 mL water en filtreer door een filter op poriegrootte van 0,22 μm. Bewaren bij 4 °C.
  3. Maak ChIP Cell lysis buffer. Los 378 mg PIJPEN op, 10,6 mL van 2 M KCl en 1,25 g vertakte octylfenoxy poly (ethyleeneoxy) ethanol in water. Breng de pH aan op 8,0 met 1 M KOH bij 4 °C en maak tot 250 mL. Filtreer door een poriegrootte van 0,22 μm en bewaar deze bij 4 °C.
  4. Maak micrococcal Nuclease (MNase) spijsvertering buffer. Meng 1 ml tot 0,1 ml van de 10x mnase digestie buffer, 10 μl 100 x BSA oplossing, 10 μl van 0,1 M dithiotreïtol en 0,88 ml water.
  5. Maak 1 M NaHCO3. Los 4,2 g NaHCO3 op in 50 ml water en filtreer door een filter van 0,22 μm poriegrootte. Bewaren bij kamertemperatuur.
  6. Maak 10% natriumdodecylsulfaat (SDS). Los 5 g SDS op in 50 mL water. Bewaren bij kamertemperatuur.
  7. Maak de elutie buffer. Meng 15 μL van 1 M NaHCO3, 15 μl 10% SDS en 120 μl water om 150 μl elutie buffer voor één monster te verkrijgen.
    Opmerking: Verhoog de volumes proportioneel, afhankelijk van het aantal voorbeelden.
  8. Maak 3 M Natriumacetaat (pH 5,2) oplossing. Los 24,6 g natriumacetaat watervrij op in Breng de pH op 5,2 met azijnzuur en make up 100 mL. Filtreer door een poriegrootte van 0,22 μm en bewaar deze bij kamertemperatuur.

2. bepaling van de MNase digestie condities

Opmerking: In de stap 2 van Protocol, een voorbeeld met behulp van VCaP, menselijke prostaatkanker cellen wordt gepresenteerd. Alle cellijnen van zoogdieren kunnen worden gebruikt; Zie opmerking bij de stappen.

  1. Bereiding van gecrosslinkt chromatine
    1. Behoud VCaP-cellen in DME-hoge glucose, aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) bij 37 °C in een koolstofdioxide incubator. Zaad VCaP cellen op 4 x 106 cellen in zes 6 cm gerechten in 4 ml cultuur media en cultuur voor 3 dagen.
      Opmerking: Gebruik geschikte kweekmedia voor elke cellijn. Er kunnen maximaal 10 x 106 cellen in een schotel van 6 cm of 10 cm worden geseeldigd. Voor hangende cellen, zaadcellen in de T25-kolven. Het aantal gerechten of kolven hangt af van hoeveel doses er getest worden op MNase spijsvertering. Als 4 doses worden getest, bereidt u 6 gerechten of kolven voor. Zie ook stap 2,2.
    2. Maak VCaP-cellen los van één gerecht met trypsine en Tel de cel. Bereken het celnummer in één gerecht. Voor hangende cellen, verwijder een kleine hoeveelheid celsuspensie uit één kolf en Tel het celnummer.
    3. Voeg 0,229 mL 18,5% PFA toe aan een schaal van 6 cm in 4 mL kweekmedia in een uiteindelijke concentratie van 1%. Voorzichtig, maar grondig te zwenken een gerecht of kolf om PFA gelijkmatig te verdelen. Incuberen op kamertemperatuur voor exact 10 min.
      Opmerking: In deze stap zijn chromatine en eiwitten Kruize. Omdat PFA giftig is, voert u deze stap uit in een chemische rook afzuigkap en gebruikt u de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen.
    4. Voeg na 10 min 0,47 mL 1,25 M glycine oplossing toe bij een eindconcentratie van 125 mM. Incuberen bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
      Opmerking: Glycine neutraliseert overtollige PFA om verdere crosslinking te stoppen.
    5. Van de aspirate formaldehyde/Glycine/cultuur media. Was de cellen door tweemaal 4 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe te voegen. Voor hangende cellen, breng de celsuspensie over in een conische buis van 15 mL en centrifugeer op 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Aspireren van de supernatant en voeg een medium volume van PBS en volledig opschorten. Herhaal deze stap. Gooi vloeibaar afval goed weg, omdat het formaldehyde bevat.
    6. Bereid PBS met een cocktail van protease en fosfatase remmer (PIC) voor door 1/100 volume van 100x PIC toe te voegen aan PBS. Zuig PBS op uit een schaal en voeg 1 mL per schotel van PBS met PIC toe. Schrael de cellen en breng de celsuspensie over naar een micro centrifugebuis van 1,5 mL. Voor hangende cellen, breng de suspensie gewoon over naar een tube van 1,5 mL.
    7. Centrifuge buizen bij 3.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de celpellet te herstellen. Verwijder de PBS volledig met een pipet. Noteer het aantal cellen per buis en bewaar de celpellet bij-80 °C.
  2. Cellyse en MNase spijsvertering
    Opmerking: Het reagensvolume in de volgende stappen is gebaseerd op één buis met 6 x 106 cellen. Pas het reagensvolume proportioneel aan afhankelijk van het celnummer; Wanneer één buisje 2 x 106 cellen bevat, gebruik dan 100 μL chip Cell lysisbuffer (stap 2.2.1), MNase digestief buffer (stap 2.2.3) en chip verdunningsbuffer (stap 2.2.5) en 10 ΜL 0,5 M EDTA (pH 8,0) (stap 2.2.4).
    1. Ontdooit de opgeslagen celpellet (VCaP-cellen, bevattende 6 x 106 cellen per buis) bereid in stap 2.1.7 op ijs. Bereid ChIP Cell lysis buffer aangevuld met PIC door het toevoegen van 1/100 volume van 100x PIC aan de buffer. Voeg 300 μL spaan cellysisbuffer toe aangevuld met PIC en hervat de pellet grondig. Vortex de buis gedurende 15 sec. en incuberen de suspensie op ijs gedurende 10 minuten.
    2. Centrifugeer bij 9.000 x g gedurende 3 minuten bij 4 °c en verwijder het supernatant volledig. Respendeer de pellet in 300 μL MNase digestie buffer.
    3. Verdun MNase (2.000 gel unit/μL) met MNase digestie buffer om 50 geleenheden/μL te geven. Voeg 0, 0,5, 1, 2, 4 μL 50 gel eenheden/μL MNase toe aan de suspensie en inincuberen bij 37 °C gedurende exact 10 min., mengen door omversie elke 2,5 min.
      Opmerking: tabel 1 toont optimale hoeveelheden MNase in verschillende cellijnen.
    4. Voeg 30 μL van 0,5 M EDTA (pH 8,0) toe om de vertering van MNase te beëindigen en een korte Vortex te maken. Inbroed voor 5 min op ijs. Centrifugeer bij 9.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c en verwijder het supernatant volledig.
    5. Bereid ChIP verdunningsbuffer aangevuld met PIC door 1/100 volume van 100x PIC toe te voegen aan de buffer. Respendeer de pellet in 300 μL ChIP verdunningsbuffer aangevuld met PIC.
    6. Sonicate de suspensie op ijs met behulp van een sonicator die is uitgerust met een microtip-sonde. Gebruik de volgende ultrasoonapparaatcondities: amplitude 2, verwerkte tijd 15 s, puls op 5 s, Pulse OFF 30 s. Neem 1 μL van de suspensie en plaats op een glaasje en observeer ze met behulp van een microscoop. Zorg ervoor dat de celstructuur bijna gebroken is.
      Opmerking: Afbeelding 1a toont representatieve micro foto's van de vcap-celsuspensie voor en na sonicatie. Deze stap is voor het vrijgeven van verteerd chromatine in het supernatant door het breken van nucleaire membranen. Een vermogensinstelling moet worden aangepast tot minder dan 5% van het maximale vermogen en probeer sonicatie voor 5 s drie keer met meer dan een 30 s-interval. Als wattage controle beschikbaar is, pas dan de vermogensinstelling aan op 5 W en verwerk de monsters voor totaal 15 s zoals hierboven vermeld om het totale vermogen van 70-75 J te geven. Controleer of de celstructuur is gebroken zoals hierboven vermeld. Als dat niet genoeg is, herhaalt u nog een keer. De hierboven beschreven voorwaarde wordt praktisch toegepast op alle geteste cellijnen.
    7. Centrifugeer bij 9.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c, breng de supernatant over naar een nieuwe micro centrifugebuis van 1,5 ml en bewaar 20 μL van het verteerde chromatine voor stap 2,3. Bewaar het restant op-80 °C.
  3. Omgekeerde crosslinking, zuivering van DNA, en analyse van verteerd chromatine
    1. Voeg 75 μl water, 4 μl van 5 M NaCl en 1 μl proteïnase K toe aan een schroef buis van 1,5 ml. Voeg 20 μL verteerd chromatine toe uit verschillende MNase digestie condities die zijn bereid in stap 2.2.7 tot buisjes met water, NaCl en Proteïnurie K. Sluit de dop strak, meng volledig en inbroed de buis bij 65 °C 's nachts.
      Opmerking: Deze stap is voor het verwijderen van crosslinking tussen eiwitten en DNA.
    2. Bereid twee micro centrifugebuizen van 1,5 mL per conditie. Voeg 100 μL fenol toe: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1) (PCI) tot een buis van 1,5 mL. Voeg 10 μL Natriumacetaat van 3 M (pH 5,2) en 2 μL glycogeen toe aan een andere buis.
      Opmerking: Het gebruik van chloroform: Isoamylalcohol is niet nodig7. Toenemend volume kan resulteren in een lage DNA-herstel na ethanol neerslag8.
    3. Centrifugeer de buis met verteerde chromatine uit stap 2.3.1 kort en voeg 100 μL PCI toe. Sluit de dop strak en Vortex krachtig om emulsie te vormen. Centrifugeer de buis op maximale snelheid (bijv. 20.000 x g) gedurende 30 sec. bij kamertemperatuur.
    4. Neem voorzichtig de bovenste fase met DNA en voeg toe aan de buis met PCI bereid in stap 2.3.2. Vortex krachtig en centrifugeer de buis als stap 2.3.3.
      Opmerking: Als de onderste fase is verontreinigd, centrifugeer de buis opnieuw, of verwijder de meeste van de onderste fase eerst, centrifugeer de buis en neem de bovenste fase.
    5. Neem voorzichtig de bovenste fase zoals beschreven in stap 2.3.4 en voeg toe aan de buis met natriumacetaat en glycogeen bereid in stap 2.3.2. Voeg 250 μL ethanol toe. Meng door inversie en incuberen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer de buis op maximale snelheid (bijv. 20.000 x g) gedurende 30 minuten bij 4 °c.
      Opmerking: Incubatie van de oplossing bij kamertemperatuur heeft geen invloed op de DNA-terugwinning8,9.
    6. Bevestig de pellets op de bodem van de buis. Verwijder voorzichtig de supernatant om de pellet niet te storen en voeg 500 μL 70% ethanol toe. Centrifugeer de buis op maximale snelheid (bijv. 20.000 x g) gedurende 5 minuten bij 4 °c.
    7. Verwijder de supernatant volledig en droog de pellet gedurende ongeveer 5 min bij kamertemperatuur. Los de pellet op in 20 μL van 10 mM tris · HCl/1 mM EDTA (pH 8,0) (TE). Meet de DNA-concentratie met behulp van een UV-spectrofotometer.
    8. Meng 0,5 μg DNA met een gel loading Dye en breng aan op 2% agarose gel. Elektroforese de monsters bij 100 V in tris-acetaat-EDTA-buffer tot paarse kleurstof gemigreerd naar de twee derde van de gel en vlek een gel met 0,5 μg/mL ethidiumbromide bromide gedurende 10 minuten. Neem een foto van de gel.
      Opmerking: Zie afbeelding 2 voor details.

3. Chromatinimmunoprecipitatie

  1. Bereiding van verteerd chromatine
    1. Bereid de thecells voor. Voor aanhandige cellen, zaad 2-10 x 106 cellen per gerecht in 2 gerechten (6 cm of 10 cm) per behandelingsgroep en laat de cellen te hechten aan de bodem van de gerechten voor meer dan 1 dag. Voor hangende cellen, zaad in 2 T25 kolven per behandelingsgroep. Behandel de cellen naar wens.
    2. Neem één gerecht of kolf uit elke groep en Tel het celnummer zoals beschreven in stap 2.1.2. Bereid gecrosslinkt chromatine zoals vermeld in de stappen 2.1.3-2.1.7.
    3. Lyse de celpellet en MNase spijsvertering zoals beschreven in de stappen 2.2.1-2.2.7. Gebruik de optimale hoeveelheid MNase voor verteren chromatine zoals bepaald in stap 2. Bewaar verteerde chromatine bij-80 °C.
    4. Omgekeerde kruiskoppeling 20 μL verteerd chromatine en zuiveren DNA zoals beschreven in stap 2.3.8. Meet de DNA-concentratie zoals beschreven in stap 2.3.7. Elektroforese de monsters in 2% agarose gel om te controleren van de grootte van verteerd chromatine zoals vermeld in stap 2,3.
      Opmerking: De DNA-concentratie is identiek aan die van opgeslagen verteerd chromatine bereid in stap 3.1.3.
    5. Verdun een reverse-cross-linked verteerd chromatine monster uit stap 3.1.4 om 10 ng/μL met water en een serie verdunnen te geven om concentraties van 1, 0,1 en 0,01 ng/μL te maken. bewaren bij-20 °C.
      Opmerking: Deze samples worden gebruikt voor real-time PCR-normen.
  2. Immunoprecipitation
    Opmerking: in de stappen 3.2-3.5 van Protocol, anti-trimethylated Histon H3 lysine 4 (H3K4me3) bezetting in vcap cellen wordt bepaald. Zie ook Figuur 3.
    1. Ontdooien chromatine uit stap 3.1.3. Houd alle monsters op ijs.
    2. Bereid ChIP verdunningsbuffer aangevuld met PIC door 1/100 volume van 100x PIC toe te voegen aan de buffer. Verdun verteerde chromatine tot 5 μg/500 μL met ChIP verdunningsbuffer aangevuld met PIC. Bereid 1.000 μL plus extra voor (1) IP met niet-immuun IgG (Control IgG), (2) IP met H3K4me3.
    3. Voeg 5 μL van 5 μg/500 μL verteerd chromatine toe aan een schroef buis van 1,5 mL als ingangs monster (1% van één IP). Bewaar het monster bij-80 °C.
    4. Voeg 500 μL van 5 μg/500 μL verteerd chromatine toe aan een schroef buis van 1,5 mL als IP-monster. Voeg 2 μg antilichaam toe aan de buis. Sluit de dop en inbroed de buis bij 4 °C 's nachts met zachte menging met behulp van een schommel platform.
      Opmerking: Hoewel het optimale antilichaam bedrag empirisch moet worden bepaald, wordt eerst 2 μg per IP aanbevolen.
    5. Voeg 30 μL ChIP-grade proteïne G magnetische kralen per IP toe. Inbroed de buis bij 4 °C voor 2 uur met zachte menging met behulp van een schommel platform.
      Opmerking: Voorwas van magnetische kralen is niet nodig.
  3. Wassen immuun complex en omkeren crosslinking
    1. Draai de buis uit stap 3.2.5 kort. Plaats de buis in een polyethyleenrek met Neodinium-magneten gedurende 1 minuut. Verwijder voorzichtig het supernatant door aspiratie.
    2. Voeg toe 0,5 mL per buis van lage zout immuun complex Wash buffer. Dispergeren de kralen door zachtjes te tikken of kort grondig van de buis. Inbroed de buis bij 4 °C gedurende 5 minuten met zachte menging met behulp van een schommel platform. Herhaal na 5 minuten stap 3.3.1.
    3. Voeg 0,5 mL High Salt immune complex Wash buffer per buis toe. De kralen dispergeren en wassen als stap 3.3.2. Na het wassen herhaalt u stap 3.3.1.
    4. Voeg toe 0,5 mL LiCl immune complex Wash buffer per buis. De kralen dispergeren en wassen als stap 3.3.2. Na het wassen herhaalt u stap 3.3.1.
    5. Plaats de buis gedurende 1 minuut in een magnetisch rek. Verwijder de overgebleven supernatant volledig.
    6. Voeg 150 μL elutie buffer toe aan de buis. Vortex de buis om de kralen volledig te dispergeren. Sluit de dop en inbroed de buis bij 65 °c gedurende 30 minuten, vermenging door omversie of grondig elke 5 min om de kralen grondig te dispergeren.
    7. Maak tijdens de incubatie een 1,5 ml schroef buis en voeg 6 μl 5 M NaCl en 2 μl proteïnase K. ontdooien 1% ingangs monster bereid in stap 3.2.3. Voeg 150 μL elutie buffer, 6 μl van 5 M NaCl en 2 μl proteïnase K tot 1% ingangs monster toe.
    8. Na de incubatie, draai de buis. Plaats de buis gedurende 1 minuut in een magnetisch rek en breng de supernatant over naar de schroef buis die NaCl en proteïnase K bevat, bereid in stap 3.3.7.
    9. Sluit de dop en Vortex alle IP-en input samples om volledig te mengen. Incuberen de buis bij 65 °C 's nachts.
  4. DNA-zuivering
    1. Bereid de buis voor zoals beschreven in 2.3.2 en voeg 150 μL PCI toe in plaats van 100 μL. Voeg in een andere buis 12 μL van 3 M Natriumacetaat (pH 5,2) en 2 μL glycogeen toe.
    2. Verwijder de buis uit de incubator. Draai de buis en voeg 150 μL PCI toe.
    3. Vortex krachtig de buis om emulsie te vormen. Centrifugeer de buis bij maximale snelheid (bv. 20.000 x g) gedurende 30 sec. bij kamertemperatuur.
    4. Breng 140 μL van de bovenste fase voorzichtig over naar de buis met PCI die in stap 3.4.1 is bereid. Herhaal stap 3.4.3.
      Opmerking: Zie ook de opmerking in stap 2.3.4.
    5. Breng 120 μL van de bovenste fase voorzichtig over naar de buis die natriumacetaat en glycogeen bevat, bereid in stap 3.4.1.
      Opmerking: Zie ook de opmerking in stap 2.3.4.
    6. Voeg 300 μL ethanol toe. Meng door inversie en incuberen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    7. Centrifugeer de buis op maximale snelheid (bijv. 20.000 x g) gedurende 30 minuten bij 4 °c. Was de pellet zoals beschreven in stap 2.3.6.
    8. Na droging van de pellet zoals beschreven in stap 2.3.7, Los de pellet op in 50 μL TE. Bewaren bij-20 °C.
  5. Detectie van DNA-fragmenten met behulp van real-time PCR
    1. De volgende monsters ontdooien: (1) IP met Control IgG, (2) IP met anti-H3K4me3, (3) 1% ingangs monster. Ontdooien ook 4 doses van normen bereid in stap 3.1.5 (totaal van 7 monsters).
      Opmerking: Gebruik normen van dezelfde groep voor de kwantificering van DNA-bedragen in de input-en IP-samples.
    2. Maak een PCR-werkoplossing voor 8 samples. Meng 40 μL van 2x real-time PCR-Supermix, 8 μL elk van 4 μM naar voren en omgekeerd primers en 8 μL water.
      Opmerking: Eén PCR-reactiemengsel bevat 5 μL van 2x real-time PCR-Supermix, 1 μL elk van 4 μM naar voren en omgekeerd primers, en 1 μL water. De primer sequenties staan vermeld in tabel 2.
    3. Een PCR-werkoplossing in één put van een PCR-plaat. Voeg 2 μL samples toe van stap 3.4.8 of standaarden uit stap 3.1.5.
    4. Sluit de PCR-plaat en voer PCR uit aan de volgende voorwaarden: 1) 95 °C gedurende 3 minuten voor initiële denaturatie, 2) 95 °C gedurende 10 s voor denaturatie, 3) 56 °C voor 30 sec. voor gloeien, 4) 72 °C voor 30 sec. voor uitbreiding en gegevensverzameling , herhaalt u stap 2) tot en met 4) voor 55 cycli. Meet na het fietsen een smelt curve van het PCR-product. Analyseer de gegevens.
      Opmerking: Onbewerkte gegevens voor Figuur 3 worden weergegeven in tabel 3. Bereken de Beginhoeveelheid (SQ) van de monsters met behulp van een standaard curve. Vermenigvuldig SQ in 1% invoer door 100 om een SQ van 1% input sample aan te passen aan één IP om aangepaste SQ in input te geven (EQ. 1). Verdelen SQ in IP-voorbeeld door aangepaste SQ in invoer voor het geven van% invoerwaarde (percentage invoermethode, EQ. 2). Voor het berekenen van vouw verrijking, verdelen SQ in IP met anti-H3K4me3 by SQ in IP met Control IgG (fold verrijking methode, EQ. 3).
      Aangepaste SQ in ingang = (SQ in 1% input) x 100 (1)
      Procentuele invoer van H3K4me3 = 100 x (SQ in IP met anti-H3K4me3)/(aangepaste SQ in input) (2)
      Fold verrijking van H3K4me3 = (SQ in IP met anti-H3K4me3)/(SQ in IP met controle IgG) (3)

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verspaning chromatine is een van de belangrijke stappen voor een spaan test. We gebruikten MNase om chromatine te verteren om een mengsel van nucleosome oligomeren te verkrijgen. In de MNase digestie stap kan MNase door het nucleaire membraan en verteerbaar Chromatin gaan. Echter, de verteerde chromatine kan niet door het membraan gaan en blijft in de kernen. Om de verteerde chromatine uit de kernen vrij te geven, is korte sonicatie nodig. Figuur 1a toont micro Foto's voor en na sonicatie va...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hoewel sonicatie vaak wordt gebruikt om gefragmenteerde Chromatin te verkrijgen, is het tijdrovend en omslachtig om reproduceerbare omstandigheden te identificeren. In dit protocol gebruikten we MNase spijsvertering omdat enzym spijsvertering gemakkelijker reproduceerbare condities moet worden geïdentificeerd. Een korte ultrasoonapparaatstap na de spijsvertering van MNase (zie stap 2,2) was noodzakelijk om het celmembraan te breken en de verteerde Chromatin vrij te geven. Daarom moet de sonicatie-kracht in ons protocol z...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek wordt ondersteund door Genentech royalty's naar City of Hope. Dit werk wordt niet geheel of gedeeltelijk gesteund door de National Institutes of Health.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.5 M EDTA (pH 8.0)Thermo ScientificAM9010
2 M KClThermo ScientificAM9010
2x iQ SYBR Green supermixBio-Rad1706862
5 M NaClThermo ScientificAM9010
50 bp DNA ladderNew England BiolabsN3236S
AgaroseResearch Product InternationalA20090
Branched octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolMillipore SigmaI8896IGEPAL CA-630
ChIP-grade protein G magnetic beadsCell signaling technology9006S
Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Dilution BufferMillipore Sigma20-153Buffer samenstelling: 0,01% SDS, 1,1% Triton X- 100, 1,2 mM EDTA, 16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl.
Gel Loading Dye Purple (6x)New England BiolabsB7024S
GlycineBio-Rad161-0724Electropheresis grade
GlycogenMillipore SigmaG176719-22 mg/mL
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-vrij (100x)Thermo Scientific78445
High Salt Immune Complex Wash BufferMillipore Sigma20-155Buffer samenstelling: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8,1, 500 mM NaCl.
Histone H3K4me3 antilichaam (pAb)Active Motif39915
LiCl Immune Complex Wash BufferMillipore Sigma20-156Buffer samenstelling: 0,25 M LiCl, 1% IGEPAL CA630, 1% deoxycholzuur (natriumzout), 1 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 8,1.
Low Salt Immune Complex Wash BufferMillipore Sigma20-154Buffer samenstelling: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8,1, 150 mM NaCl.
Magna GrIP Rack (8 wel)Millipore Sigma20-400Elke soort magnetische scheidingsstandaard die compatibel is met een buis van 1,5 ml is prima.
Micrococcal nucleaseNew England BiolabsM0247Skomt met 10x buffer (500 mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, pH 7,9 bij 25 °C) en 100x BSA (10 mg/mL)
NaHCO3JT Baker3506-01
Normal rabbit IgGMillipore Sigma12-370
PIPESMillipore SigmaP6757
Proteinase KMillipore Sigma3115887001
Real-time PCR systeemBio-RadCFX96, C1000
RNA pol II CTD fosfo Ser5 antilichaamActive Motif39749
SDSBoehringer Mannheim100155Electropheresis grade
sodium acetateMillipore SigmaS5636
Sonicator uitgerust met een microtip-sondeQSONICAQ700Elke soort sonicator die compatibel is met een buis van 1,5 ml is prima.
UltraPure Fenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v)Thermo Scientific15593031pH 8,05

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nikolov, D. B., Burley, S. K. RNA polymerase II transcription initiation: a structural view. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (1), 15-22 (1997).
  2. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
  3. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).
  4. Jackson, V., Chalkley, R. Use of whole-cell fixation to visualize replicating and maturing simian virus 40: identification of new viral gene product. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (10), 6081-6085 (1981).
  5. Jackson, V., Chalkley, R. A new method for the isolation of replicative chromatin: selective deposition of histone on both new and old DNA. Cell. 23 (1), 121-134 (1981).
  6. Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).
  7. Ausubel, R. B., Kingston, R. E., Moore, D. D., Smith, J. A., Struhl, K. Preparation of Genomic DNA. Short Protocols in Molecular Biology. , Second Edition, Unit 2.1, 2-4 (1992).
  8. Crouse, J., Amorese, D. Ethanol Precipitation: Ammonium Acetate as an Alternative to Sodium Acetate. Focus. 9 (2), 3-5 (1987).
  9. Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol Precipitation of DNA. Focus. 7 (4), 1-2 (1985).
  10. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
  11. Guenther, M. G., Levine, S. S., Boyer, L. A., Jaenisch, R., Young, R. A. A chromatin landmark and transcription initiation at most promoters in human cells. Cell. 130 (1), 77-88 (2007).
  12. Louie, M. C., et al. Androgen-induced recruitment of RNA polymerase II to a nuclear receptor-p160 coactivator complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2226-2230 (2003).
  13. Liu, X., et al. Positive feedback loop mediated by protein phosphatase 1alpha mobilization of P-TEFb and basal CDK1 drives androgen receptor in prostate cancer. Nucleic Acids Research. 45 (7), 3738-3751 (2017).
  14. Zhao, H., et al. Identification of valid reference genes for mRNA and microRNA normalisation in prostate cancer cell lines. Scientific reports. 8 (1), 1949(2018).
  15. Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method. Nature. 1 (1), 179-185 (2006).
  16. Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods in molecular biology. 809, Clifton, N.J. 85-104 (2012).
  17. Lund, E. G., Duband-Goulet, I., Oldenburg, A., Buendia, B., Collas, P. Distinct features of lamin A-interacting chromatin domains mapped by ChIP-sequencing from sonicated or micrococcal nuclease-digested chromatin. Nucleus. 6 (1), 30-39 (2015).
  18. Dahl, J. A., Collas, P. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP). Nature protocols. 3 (6), 1032-1045 (2008).
  19. Yamakawa, T., Waer, C., Itakura, K. AT-rich interactive domain 5B regulates androgen receptor transcription in human prostate cancer cells. Prostate. 78 (16), 1238-1247 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Micrococcaal nucleaseChIP assayhistonmodificatieseiwit DNA interactieschromatinfragmentatieMNase digestiecellyseDNA zuivering

Gerelateerde artikelen