Visualisatie van Germinosomes en het binnenste membraan in sporen van Bacillus subtilis

Summary

Germinant receptor eiwitten cluster in 'germinosomes' in het binnenste membraan van sporen van Bacillus subtilis . We beschrijven een protocol met behulp van super resolutie microscopie en TL verslaggever eiwitten om te visualiseren van germinosomes. Het protocol geeft ook spore binnenste membraan domeinen die zijn bij voorkeur gekleurd met de membraan kleurstof FM4-64.

Abstract

De geringe omvang van de sporen en de relatief lage abundantie van kiemkracht eiwitten, veroorzaken moeilijkheden in hun microscopische analyses met behulp van microscopie van epifluorescence. Super resolutie driedimensionale gestructureerde verlichting microscopie (3D-SIM) is een veelbelovende instrument om deze hindernis overwinnen en onthullen de moleculaire details van het proces van ontkieming van sporen van Bacillus subtilis (B. subtilis). Hier beschrijven we het gebruik van een gemodificeerde SIMcheck (ImageJ)-Assistent 3D imaging proces en fluorescerende verslaggever eiwitten voor SIM microscopie van B. subtilis sporen germinosomes, cluster (s) van kiemkracht eiwitten. Ook presenteren wij een procedure (standaard) 3D-SIM imaging voor FM4-64 kleuring van B. subtilis spore membranen. Met behulp van deze procedures, we verkregen onovertroffen resolutie voor germinosome lokalisatie en tonen aan dat > 80% van B. subtilis KGB80 slapende sporen na sporevorming op een gedefinieerde minimale MOPS voedingsbodem verkregen hebben één of twee GerD-GFP en GerKB-mCherry Foci. Heldere foci werden ook waargenomen in FM4-64 gekleurd sporen 3D-SIM beelden suggereren dat binnenste membraan lipide domeinen van verschillende vloeibaarheid waarschijnlijk bestaan. Verdere zijn studies die dubbele etikettering procedures met membraan kleurstoffen en germinosome verslaggever eiwitten gebruiken om te beoordelen co lokalisatie en dus krijgt een optimaal overzicht van de organisatie van Bacillus kiemkracht eiwitten in het membraan van de innerlijke spore mogelijk.

Introduction

Sporen van de orders, Bacillales en Clostridiales zijn metabolisch slapende en buitengewoon resistent tegen harde decontaminatie regimes, maar tenzij ze ontkiemen, geen schadelijke effecten in mens¹. In voedende germinant geactiveerde kieming van sporen van Bacillus subtilis (B. subtilis) is de inleiding gebeurtenis germinant binding aan germinant receptoren (GRs) gelegen in de spore binnenste membraan (IM). Vervolgens transduce de GRs signalen aan de SpoVA kanaal proteïne ook gelegen in de IM. Dit resulteert in het begin van de uitwisseling van spore kern pyridine-2,6-dicarbon zuur (dipicolinic zuur; DPA; bestaande uit 20% van de spore kern dry wt) voor water via het SpoVA-kanaal. Vervolgens de release DPA activeert de activering van de cortex peptidoglycaan hydrolyse en extra water opname volgt^2,3,4. Deze gebeurtenissen leiden tot mechanische belasting op de vacht lagen, zijn latere breuk, het begin van de uitgroei en, ten slotte, vegetatieve groei. De exacte moleculaire details van het proces van ontkieming zijn echter nog lang niet opgelost.

Een belangrijke vraag over spore kiemkracht betreft de biofysische eigenschappen van de vetten rondom de IM kiemkracht eiwitten evenals de IM SpoVA kanaal eiwitten. Deze grotendeels immobiel IM lipide dubbelgelaagde is de belangrijkste permeabiliteit barrière voor vele kleine molecules, met inbegrip van toxische chemische conserveringsmiddelen, waarvan sommige hun optreden in de kern van de spore of vegetatieve cel cytoplasma^{5,6 oefenen}. De IM lipide dubbelgelaagde is waarschijnlijk in een gel staat, hoewel er een significante fractie van mobiele lipiden in de IM-⁵. De spore IM heeft ook het potentieel voor aanzienlijke uitbreiding⁵. Dus, de oppervlakte van de IM 1.6-fold verhoogt op kiemkracht zonder extra membraan synthese en gepaard gaat met het verlies van dit membraan de karakteristieke lage permeabiliteit en lipide immobiliteit^5,6.

Hoewel de moleculaire details van de activering van kiemkracht eiwitten en organisatie van IM lipiden in sporen zijn aantrekkelijke onderwerpen voor studie, vormen de geringe omvang van B. subtilis sporen en de relatief lage overvloed van kiemkracht eiwitten, een uitdaging voor microscopische analyses. Griffiths et al. dwingende epifluorescence Microscoop bewijs, suggereert met behulp van fluorescerende verslaggevers aan kiemkracht eiwitten, gesmolten dat in B. subtilis sporen de steiger proteïne GerD organiseert drie GR subeenheden (A, B en C) voor de GerA, B en K GRs, in een cluster⁷. Zij bedacht de term 'germinosome' voor dit cluster van kiemkracht eiwitten en de structuren als ~ 300 nm groot IM eiwit foci⁸beschreven. Na de inleiding van spore kiemkracht, dispergeren fluorescerende germinosome foci uiteindelijk veranderen in grotere fluorescerende patronen, met > 75% van de populaties van de spore weergeven van dit patroon in sporen ontkiemd voor 1 h met L-valine⁸. Merk op dat het papier bovengenoemde gebruikte gemiddeld beelden uit tientallen opeenvolgende fluorescerende afbeeldingen, tot statistische macht bezaten en overwinnen van de horde van lage fluorescerende signalen waargenomen tijdens de beeldvorming. Deze visualisatie van deze structuren in bacteriële sporen was aan de rand van wat technisch haalbaar met klassieke microscopische tools en noch een evaluatie van de hoeveelheid foci in een enkele spore is noch hun meer gedetailleerde subcellular localisatie was mogelijk met deze aanpak.

Wij tonen hier, het gebruik van gestructureerde verlichting microscopie (SIM) te verkrijgen van een gedetailleerde visualisatie en kwantificering van de germinosome(s) in de sporen van B. subtilis, alsmede van hun IM lipide domeinen⁹. Het protocol bevat ook instructies voor de sporevorming, prepareren van objectglaasjes en beeldanalyse door SIMcheck (v1.0, een imageJ plugin) evenals ImageJ^10,11,12.

Protocol

1. B. subtillis sporevorming (Timing: 7 dagen vóór de microscopische observatie)

1. Dag 1
   1. Strijk een bacteriële cultuur op een Luria Bertani Bouillon (LB) agar plaat (1% trypton gistextract 0,5%, 1% NaCl, 1% agar)¹³ en na een nacht bebroeden bij 37 ° C te verkrijgen van enkele kolonies. Gebruik de B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry kat, gerD-gfp kan) stam en zijn achtergrond ouderstam B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) zoals eerder beschreven⁷.
      Opmerking: Het gebruik van sporen met de achtergrond van de ΔcotEΔgerE is van essentieel belang in germinosome visualisatie, om te minimaliseren van de autofluorescence van de spore vacht lagen⁷.
   2. Het steriliseren van alle media, buizen, pipets en andere materialen van de cultuur met passende methoden worden gebruikt.
2. Dag 2
   1. Enten van een één kolonie in 5 mL van LB medium vroeg in de ochtend en de cultuur onder continu roeren in een schroefdop buis bij 200 rpm/min en 37 ° C te incuberen totdat de OD₆₀₀ 0,3-0,4 (ongeveer 7 h tot).
   2. 500 mL van MOPS medium (pH 7.5) maken met 3 nM (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O, 0.4 μM H₃BO₃, 30 nM CoCl₂·6H₂O, 10 nM CuSO₄·5H₂O, 10 nM ZnSO₄·7H₂O, 1,32 mM K₂HPO₄, 0,4 mM MgCl₂·6H₂O, 0.276 mM K₂zo₄, 0,01 mM FeSO₄·7H₂O, 0,14 mM CaCl₂·2H₂O, 80 mM WIPES, Tricine, 0,1 mM MnCl₂·2H₂O, 10 mM D-glucose-monohydraat 4 mM en 10 mM NH₄Cl.
   3. Bereiden in schroefdop buizen 10^-1- 10^-7 seriële verdunningen van de LB-cultuur in 5 mL MOPS medium en Incubeer de culturen 's nachts onder voortdurende agitatie bij 200 rpm/min en 37 ° C.
      Opmerking: De seriële verdunningen bereid hier streven naar het verkrijgen van een verdunning in vroege exponentiële fase in de volgende ochtend. Deze stap en de volgende stap zijn nodig om de cellen aan te passen aan de MOPS gebufferde groeimedium toestaan.
3. Dag 3
   1. Selecteer een van de verdunningen van de MOPS met een OD₆₀₀ van 0,3-0,4. Inoculeer 0,2 mL van de cultuur tot voorverwarmde (37 ° C) 20 mL MOPS voedingsbodem in een conisch 250 mL-kolf en incubeer onder continu roeren totdat de OD₆₀₀ 0,3-0,4 (~ 7 h tot).
   2. Beënt de MOPS gebaseerde sporevorming medium (250 mL) met 1% (v/v) pre cultuur uit stap 1.3.1 en incubeer gedurende 3 dagen bij 37 ° C in een conische liter kolf onder continu roeren. Voor FM4-64 kleuring van PS4150 sporen, voeg 2 µg/mL FM4-64 probe (Zie Tabel van materialen) tot de sporevorming medium 1 of 2 uur na het bereiken van de top₆₀₀ OD-waarde van vegetatieve groei (in het algemeen ongeveer 2) en laat de cultuur vervolgens sporulate terwijl het beschermen van lichte⁵.
4. Dag 7: Oogsten van sporen
   1. Het bepalen van de sporevorming opbrengst (sporen vs vegetatieve cellen) gebruik van fase contrast microscopie bij 100 X vergroting om te onderscheiden van de fase lichte sporen van donkere cellen in de fase en eventueel niet-oudere sporen. Een rendement van 90% fase heldere spore wordt verwacht.
   2. Pellet de sporen bij 4270 x g gedurende 15 min bij 4 ° C in ronde onderkant centrifuge buizen. De spore pellet 2 - 3 keer met 40 mL steriele Ultra zuivere Type 1 gedemineraliseerd water wassen in 50 mL conische centrifuge buizen (Zie Tabel van materialen). Spin-down op elke wassen bij 4270 x g gedurende 15 minuten (4 ° C).
5. Dag 7: Spore zuivering
   1. Spore zuivering: Suspendeer de pellet spore in 750 µL van 20% nonionic dichtheid kleurovergang medium (Zie tabel van materialen) en laden op 800 µL van 50% nonionic dichtheid kleurovergang medium in gesteriliseerde microcentrifuge buizen. Centrifugeer gedurende 60 min bij 21.500 x g. De pellet verkregen bevat de vrije sporen. Suspendeer de pellet spore in 200 µL van 20% nonionic dichtheid kleurovergang medium en op 1 mL voor 50% nonionic dichtheid kleurovergang medium in een microcentrifuge buis, en Centrifugeer gedurende 15 min bij 21.500 x gladen.
   2. Wassen van de voorbereiding van de definitieve spore en opslag: de pellet verkregen bevat de gezuiverde slapende sporen. Wash de spore pellet 2 - 3 keer met 1,5 mL steriele Ultra zuivere Type 1 water (Zie Tabel van materialen) en spin-down tussendoor bij 9,560 x g gedurende 15 min bij 4 ° C. Tot slot, het opschorten van de pellet in steriele Ultra Zuiver Type 1 water tot een definitieve OD₆₀₀ van ongeveer 30. Hoeveelheden van de sporen kunnen worden achtergelaten bij-80 ° C gedurende 8 weken¹⁴.

2. decoating

1. Behandelen van PS4150 sporen met 0,1 M NaCl/0,1 M NaOH/1% natrium dodecyl sulfaat (SDS) / 0,1 M dithiothreitol (DTT) bij 70 ° C gedurende 1 h. wassen de sporen 10 keer met gesteriliseerde Ultra zuivere Type 1 water^15,16. Door dit te doen, om het even welk geadsorbeerde FM4-64 sonde in de buitenmembraan spore en buitenste lagen worden verwijderd.

3. dekglaasje aan en prepareren van objectglaasjes¹¹ (Timing: 1 H voor observatie)

1. Vooraf schone hoge precisie coverslips (Zie tabel van materialen) met 1 M HCl gedurende 30 minuten in een waterbad voorzichtig schudden. De coverslips tweemaal in de ultra zuivere Type 1 water wassen en ze opslaan in 100% (vol/vol) EtOH. Laten drogen en controleren hun duidelijkheid vóór gebruik. Vooraf schoon glas dia's in 70% EtOH. Laten drogen en controleren hun duidelijkheid vóór gebruik.

4. de monstername fluorescerende microsferen of sporen in het gen Frame dia¹⁰ (Timing 15 Min)

1. Vooraf warm twee 70% EtOH gereinigd en lucht gedroogd glas dia's (Zie tabel van materialen) voor enkele seconden op een blok van de verwarming 70 ° C, drop 65 μL van gesteriliseerde 2% agarose gehouden bij 70 ° C op de top van een glasplaatje en plaats de andere glasplaatje boven te verspreiden van de agarose b etween de dia's. De agarose patch zal droog in ongeveer 5 min.
2. Snijd de agarose patch in een sectie van 1 x 1cm na het verwijderen van een van de dia's van glas, Voeg 0.4 l sample (fluorescerende microsferen of sporen van ~ 10⁸/mL) en overdracht van de patch op de hoge precisie dekglaasje aan door het plaatsen van het dekglaasje aan op de patch en het glijdt.
3. Een Gene Frame (1,5 x 1,6 cm², 65 µL) vast te stellen op de gedroogde dia, waarop het dekglaasje aan sluiten alle hoeken van het frame ligt, dus de voltooiing van de dia voor gebruik in microscopie.

5. beeldvorming^11,17(Timing: 1 H)

1. Vastleggen van de beelden van het transmissie- en fluorescentie van sporen en een mengsel van rood en geel-groen carboxylaat gemodificeerde fluorescerende microsferen op een gestructureerde verlichting Microscoop (Zie tabel van materialen) uitgerust met een 100 x objectieve () olie Numerieke diafragma = 1,49), een CCD camera en beeld de software van de analyse (Zie tabel van materialen). Alle afbeeldingen op kamertemperatuur zonder de verstoring van het omgevingslicht te genereren. Zorg ervoor dat altijd schoon de 100 x doelstelling en de dia met 75% ethanol voor imaging.
2. Focus op 100 nm (diameter) TL microbolletjes en optimaliseren van het punt verspreiden functie (psf) door de ring van de correctie op de doelstelling van 100 x aan te passen totdat een symmetrische psf is verkregen, dus het minimaliseren van vervagen van het beeld. De psf is de impuls antwoord of de reactie van een imaging systeem op een puntbron of een object point.
3. Selecteer een gezichtsveld met ongeveer 10 ronde TL microsferen. Een rooster van toepassing focus aanpassing voor beide 561 nm en 488 nm excitatie golflengten als de gids voor de software van de analyse van de afbeelding.
4. Focus van de sporen met het licht van de transmissie en een transmissie lichte opname in de 16 × gemiddelde modus met 200 ms posities voor elke afbeelding.
5. 3D-SIM rauwe fluorescerende foto's vastleggen van de sporen met de wijze van de verlichting "3D-SIM", de camera-instellingen te-afleestoestand elektron te vermenigvuldigen (EM) winst 10MHz op 14-bits, en EM winst op 175. De sonde FM4-64 in PS4150 sporen met 561 nm laserlicht op 20% laser kracht, en een tijd van de verlichting van 400 ms opwekken.
6. Wekken van de GerKB-mCherry en GerD-GFP in KGB80 sporen met, respectievelijk, 561 nm laserlicht op 30% laser kracht voor 1 s en 488 nm laserlicht op 60% laser macht voor 3 s. Z-Stack-instellingen zijn in de top naar bodem modus, 0,2 µm / stap 7 stappen en 20 stappen voor germinosome en IM analyse, respectievelijk.
   Opmerking: Deze laser parameters werden toegepast om zich te verzekeren van een waarde van de maximale helderheid van het histogram venster van ongeveer 4.000.

6. reconstrueren 3D-SIM Raw-afbeeldingen van FM4-64 gekleurd PS4150 sporen

1. De N-SIM segment wederopbouw voor de FM4-64 gekleurd PS4150 sporen ruwe gegevens uitvoeren Klik op de knop van de Param voor Reconstrueren Slice op de N-SIM pad tabblad om de N-SIM segment wederopbouw-venster te openen.
2. De wederopbouw parameters instellen in het venster van de N-SIM segment wederopbouw . Om perfect gereconstrueerde beeld, de suggestie van de N-SIM instructies volgt en klik op de gewenste besturingselementen in het venster van de N-SIM segment wederopbouw om de Verlichting modulatie Contrast (IMC) ingesteld op Auto, High Resolutie ruis onderdrukking (HRNS) 1,00 en Uit de Focus vervagen onderdrukking (OFBS) naar 0,05 als uitgangspunt.
3. Klik op de knop Reconstrueren Slice in het venster van de N-SIM segment wederopbouw te reconstrueren van de afbeelding. Evalueren van de kwaliteit van de gereconstrueerde beelden door de Fast Fourier getransformeerd (FFT) beelden en de wederopbouw score, welke na wederopbouw¹²worden weergegeven.
4. Aanpassen van de HRNS van 0,10 tot 5,00 en OFBS van 0,01 naar 0,50 door te klikken op de gewenste besturingselementen in de N-SIM segment wederopbouw venster totdat de beste parameterinstellingen worden verkregen.
5. Klik op de knop toepassen in het venster van de N-SIM segment Reconstuction toe te passen van de gewijzigde parameters. Klik op de knop sluiten om het venster te sluiten.
6. Maak een FM4-64 gekleurd PS4150 sporen raw-afbeeldingen actieve en klik op de knop Reconstrueren Slice op de N-SIM Pad tabblad te voeren Segment wederopbouw. Sla het gereconstrueerde beeld.

7. de beeldanalyse

1. Converteren van Pseudo-Widefield beelden van de KGB80 germinosome
   1. 3D-SIM raw-afbeeldingen van KGB80 converteren door Pseudo-Widefield beelden door te activeren met een linker muisknop de ImageJ plugin SIMcheck nut, Raw Data SI Pseudo-Widefield¹². Pseudo-Widefield gemiddelden van beelden van de ruwe gegevens van de SIM- en assembleert, ter vergelijking, een afbeelding gelijk aan conventionele widefield verlichting¹². Zie https://imagej.net/Welcome voor ImageJ zelf. Selecteer willekeurig ~ 25 sporen in elk beeld van de omgekeerde transmissie voor latere analyse van de germinosome in de fluorescerende Pseudo-Widefield beelden.
   2. In totaal ongeveer 350 (in dit voorbeeld, 346) KGB80 sporen in 14 gezichtsveld van twee dia's selecteren De GerD-GFP en GerKB-mCherry fluorescerende foci nummers in geselecteerde KGB80 sporen moeten onafhankelijk worden geteld door twee onderzoekers. De onderzoeker kan terug verwijzen naar de 3D-SIM raw beelden wanneer in twijfel van de aanwezigheid van afzonderlijke fluorescerende germinosome foci in sporen.
   3. De maximale intensiteiten van elke GerD-GFP en GerKB-mCherry focus en de geïntegreerde intensiteit van elke KGB80 spore 3D beeld met ImageJ beoordelen.
2. Analyseren van Pseudo-Widefield beelden van de KGB80 germinosome
   1. De intensiteitswaarde van de gemiddelde geïntegreerde van 7 stapels gebruiken als de geïntegreerde signaal intensiteit van de spore KGB80. Achtergrond intensiteit bepalen door imaging de achtergrond stam PS4150 met identieke instellingen. Betreft fluorescerende vlekken in individuele KGB80 sporen germinosome foci wanneer ze duidelijk te onderscheiden van de achtergrond zijn.
   2. Toepassing one-way ANOVA-tests voor de bepaling van de betekenis met software oorsprong 9.0. overwegen van P-waarden < 0.05 als statistisch significant. Gebruik van de Spearman rank correlatiecoëfficiënt¹⁸ om te evalueren van de correlatie van GerD-GFP en GerKB-mCherry foci nummer en de metingen van de geïntegreerde signaal intensiteit.

Results

Het huidige protocol presenteert een SIM Microscoop imaging procedure voor bacteriële sporen. De voorbereiding van de procedures sporevorming en dia werden uitgevoerd zoals aangegeven in Figuur 1 voor imaging. Later, de beeldvorming en analyse procedures werden toegepast zowel voor dim (fluorescent proteïne label kiemkracht eiwitten) en lichte (lipofiele sonde gekleurd IM) spore monsters zoals in de volgende tekst wordt weergegeven.

Discussion

Het protocol gepresenteerd bevat een procedure van de standaard 3D-SIM voor analyse van FM4-64 gekleurd van B. subtilis sporen die sporevorming, prepareren van objectglaasjes en imaging processen omvat. Bovendien, het protocol beschrijft een gemodificeerde SIMcheck (ImageJ)-3D-imaging proces voor SIM microscopie van B. subtilis spore germinosomes gelabeld met de fluorescerende verslaggevers bijgestaan. De laatste procedure konden we observeren deze dim substructuur met verbeterde contrast. Door de koppe...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air dried glass slides	Menzel Gläser	630-2870
APO TIRF N20R8 100× oil objective (NA=1.49)
B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)
B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet)
Erlenmeyer flasks 1 L	Sigma-Aldrich	Z567868
Erlenmeyer flasks 250 mL	Sigma-Aldrich	Z723088
FluoSpheres carboxylaat-gemodificeerde microspheres	Invitrogen, 0.1 µm	F8803
FM4-64	Thermo Fisher Scientific	F34653
Histodenz nonionisch dichtheidsgradiëntmedium	Sigma-Aldrich	D2158
ImageJ
iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera	Andor Technology		https://imagej.net/Welcome
LB Agar	Sigma-Aldrich	L2897
Microfuge tubes 1.5 mL	Thermo Fisher Scientific	3451PK
Microscoopbeeldsoftware	Nikon, Japan	NIS-Element AR 4.51.01
MilliQ Ultrapure gedemineraliseerd water	Millipore	Milli-Q IQ 7003
Nikon Eclipse Ti microscoop
Polypropyleen schroefdop fles 180 mL	Thermo Fisher Scientific	75003800
Precisiedeksels	Paul Marienfeld	117650
Buisjes met ronde bodem 15 mL	Thermo Fisher Scientific		Nunc TM
Schroefdopbuisjes 50 mL	Thermo Fisher Scientific		Nunc TM