Lipidomics en Transcriptomics bij neurologische aandoeningen

Samenvatting

Dit artikel presenteert een modulair protocol voor weefsellipideomica en transcriptomica, en plasmalipideomica in neurologische ziektemuismodellen gericht op lipiden die ten grondslag liggen aan ontsteking en neuronale activiteit, membraanlipiden, stroomafwaartse boodschappers en mRNA-coderende enzymen / receptoren die ten grondslag liggen aan de lipidefunctie. Bemonsterings-, monsterverwerkings-, extractie- en kwantificeringsprocedures worden beschreven.

Samenvatting

Lipiden dienen als de primaire interface voor hersenbeledigingen of stimuli die bevorderlijk zijn voor neurologische ziekten en zijn een reservoir voor de synthese van lipiden met verschillende signalerings- of ligandfuncties die het begin en de progressie van ziekten kunnen onderstrepen. Lipiden veranderen vaak op presymptomatisch niveau en zijn een opkomende bron van medicijndoelen en biomarkers. Veel neurologische ziekten vertonen neuro-inflammatie, neurodegeneratie en neuronale prikkelbaarheid als gemeenschappelijke kenmerken, gedeeltelijk gemoduleerd door specifieke lipide signaleringssystemen. De onderlinge afhankelijkheid en onderlinge samenhang van de synthese van verschillende lipiden leidt tot een multilipiden-, multi-enzym- en multireceptoranalyse om de overeenkomsten en specificiteiten van neurologische contexten af te leiden en de ontrafeling van mechanistische aspecten van het begin en de progressie van de ziekte te versnellen. Het toeschrijven van lipiderollen aan verschillende hersengebieden bevordert de bepaling van lipide moleculair fenotype en morfologie geassocieerd met een neurologische ziekte.

Hier wordt een modulair protocol gepresenteerd dat geschikt is voor de analyse van membraanlipiden en downstream lipidesignalen, samen met mRNA van enzymen en mediatoren die ten grondslag liggen aan hun functionaliteit, geëxtraheerd uit discrete hersengebieden die relevant zijn voor een bepaalde neurologische ziekte en / of aandoening. Om nauwkeurige vergelijkende lipidomische profilering te garanderen, werden de workflows en operationele criteria geoptimaliseerd en gestandaardiseerd voor: i) hersenbemonstering en dissectie van interessante regio's, ii) co-extractie van meerdere lipidesignalen en membraanlipiden, iii) dubbele lipide / mRNA-extractie, iv) kwantificering door vloeistofchromatografie multiple reaction monitoring (LC / MRM), en v) standaard mRNA-profilering. Deze workflow is vatbaar voor de lage weefselhoeveelheden die worden verkregen door bemonstering van de functioneel discrete hersensubregio's (d.w.z. door brain punching), waardoor bias in multimoleculaire analyse als gevolg van weefselheterogeniteit en / of dierlijke variabiliteit wordt voorkomen. Om perifere gevolgen van neurologische ziekten te onthullen en translationele moleculaire uitlezingen van neurologische ziektetoestanden vast te stellen, worden perifere orgaanbemonstering, verwerking en hun daaropvolgende lipidomische analyse, evenals plasmalipideomica, ook nagestreefd en beschreven. Het protocol wordt gedemonstreerd op een acuut epilepsiemuismodel.

Inleiding

Recente ontwikkelingen in de functie van lipiden en hun rol in het begin en de progressie van neurologische ziekten openen nieuwe onderzoeks- en ontwikkelingslocaties van nieuwe therapeutische doelen en opheldering van het ^{ziektemechanisme1}. Gedocumenteerde verschillen in lipidesamenstelling in verschillende hersengebieden, benadrukt door moderne moleculaire beeldvormingstechnieken zoals massaspectrometrie beeldvorming en geavanceerde massaspectrometrieprofilering, verschuift het paradigma van lipidenonderzoek van hele hersenen naar functioneel verschillende en discrete hersengebieden. Het feit dat de lipidesamenstelling varieert in verschillende hersengebieden leidt tot nieuwe conceptualisering van zowel membraanlipidegevoeligheid als stroomafwaartse lipidesignalering als reactie op een hersenbelediging of stimuli in de functioneel verschillende hersengebieden. Daarom vereisen lipideprotocollen nieuwe ontwikkelingen om de uitdaging van lage weefselhoeveelheden aan te pakken voor detectie en kwantificering met een hogere ruimtelijke resolutie, en tegelijkertijd analyse van meerdere lipidecomponenten van celmembranen en signaalroutes. Ook de bepaling van enzymen, lipideliganden en receptoren die betrokken zijn bij de regulatie van hun niveaus en functie is van het grootste belang om de signaalroutes die bij een neurologische ziekte worden beïnvloed, op te helderen en nieuwe mechanistische onderzoeken in een pathofysiologische context te begeleiden.

Naast de verhoogde ruimtelijke resolutie van de hersenen, zijn er twee grote problemen die de ontwikkeling van nieuwe neurolipidomische benaderingen uitdagen. Ten eerste zijn de lipide-signaleringsmoleculen meestal van zeer lage abundantie in vergelijking met membraanvormende lipiden. Ten tweede vertoont het lipidoom een hoge structurele heterogeniteit, moeilijk te ontleden met behulp van een enkele analytische benadering. Daarom zijn extractie- en analysemethoden afgestemd op verschillende lipidecategorieën en worden ze vaak uitgevoerd in verschillende weefselmonsters². Shotgun lipidomische methoden³ zijn uitstekende hulpmiddelen om snel een breed profiel van membraanlipiden te onthullen, terwijl verhoogde gevoeligheid en selectiviteit die worden geboden door de gerichte ontdekking en kwantificering massaspectrometrische methoden worden benut voor onderzoek van laag overvloedige signaallipiden, waaronder: i) inflammatoire lipiden en ii) lipiden die betrokken zijn bij de modulatie van neuronale activiteit, zoals endocannabinoïden (eCB's), aminozuurgerelateerde lipiden, enz.^4,5. Om lipideveranderingen op zowel het celmembraan als het signaleringsniveau te omvatten die optreden in hersengebieden van neurologische ziektemodellen, worden de lipide-extractie en -analyse meestal uitgevoerd in verschillende weefselmonsters, verkregen uit verschillende dierlijke batches of uit verschillende hemisferen, of door een groter weefselgebied in meerdere stukken te ontleden. Wanneer mRNA-niveaus van enzymreceptoren ook van belang zijn, vereist hun onderzoek meestal de verkrijging van een afzonderlijk weefselmonster. Het onderzoek van membraanlipiden, endogene cannabinoïden en mRNA zou bijvoorbeeld drie verschillende weefselmonsters vereisen (bijvoorbeeld twee monsters voor de twee lipide-extractiemethoden - membraanlipiden en signaleringslipiden - en daaropvolgende twee lipidenanalysemethoden - en één monster voor mRNA-analyse). Onderzoek naar inflammatoire lipiden en endogene cannabinoïden vereist respectievelijk twee verschillende weefselmonsters, extractiemethoden en analysemethoden. Een ander voorbeeld is het onderzoek van mRNA en van elke lipidecategorie in een hersenpunch- of lasermicrodissectiemonster, waardoor twee verschillende dieren twee monsters per hersengebied (sub)regio moeten verkrijgen. Een aanzienlijke mate van variabiliteit en/of slechte reproduceerbaarheid van de resultaten komt in dergelijke gevallen vaak voor, als gevolg van biologische variabiliteit en/of weefselheterogeniteit. Geleid door deze praktische beperkingen van multimoleculaire analyse, die met name optreden bij hoge ruimtelijke resolutie in de hersenen, werd een driemodule neurolipidomicsprotocol ontworpen dat omvat: 1) co-extractie en co-analyse door LC / MRM van inflammatoire lipiden (bijv. Eicosanoïden (eiCs)) en lipiden die betrokken zijn bij modulatie van neuronale activiteit, zoals eCB's²; 2) co-extractie van fosfolipiden (PR's) en eCB's met daaropvolgende multiscan LC/MRM en precursor/neutrale verliesscananalyse²; en 3) dubbele extractie van membraan (fosfo)lipiden en eCB's, evenals mRNA, met daaropvolgende LC/MRM en qPCR of RNA sequencing analyse⁶. Afhankelijk van de biologische vraag die moet worden behandeld bij een neurologische ziekte en het hersengebied van belang, kan een combinatie van het eerste en het tweede protocol, of het eerste en het derde protocol, worden toegepast op hetzelfde weefselmonster voor weefsels met een gewicht van ongeveer 4 mg. Het eerste en derde protocol kunnen onafhankelijk worden toegepast voor weefsels rond 2 mg. Het tweede protocol kan worden toegepast voor weefsels met een gewicht van slechts 0,5 mg. Ongeacht de geselecteerde neurolipidomische protocolmodule zijn de weefselbemonstering en pre-analytische verwerking, de hersenisolatie en regiodissectie, evenals de procedure voor het opofferen van het diermodel gestandaardiseerd en identiek voor alle drie de modules van het protocol. In ons onderzoek naar neurologische aandoeningen worden perifere organen die relevant zijn voor de pathologische gevolgen van de ziekte altijd ook verzameld en geanalyseerd met behulp van deze modulaire protocollen. Bovendien wordt bloed regelmatig bemonsterd voor plasmalipideomica om te dienen als een uitleesinstrument van neurologische ziekten met het oog op prospectieve translationele toepassingen. Het hier gepresenteerde modulaire lipidomics-protocol is zeer veelzijdig: schaalbaar naar grotere weefselhoeveelheden en gemakkelijk toepasbaar voor vrijwel elk weefseltype en elke ziekte. Voor de toepassing van het modulaire protocol (Figuur 1) bij neurologische ziekten is elk gestandaardiseerd knaagdiermodel van het begin en de progressie van neurologische aandoeningen, zoals traumatisch hersenletsel, de ziekte van Parkinson, de ziekte van Alzheimer of epilepsie vatbaar.

Deze protocollen zijn uitgebreid toegepast om veranderingen in het weefsellipideoom en /of transcriptoom in de acute fase van epilepsie te bestuderen in het door kaïnzuur (KA) geïnduceerde muismodel van ^epilepsie2,7, een model dat veel wordt gebruikt in preklinische studies vanwege de gelijkenis met humane temporale kwab epilepsie (TLE)^8,9,10,11. Met behulp van deze protocollen werd het therapeutisch potentieel van geneesmiddelen zoals Palmitoylethanolamide (PEA)^12,13 beoordeeld in hetzelfde muismodel van epilepsie. De studie identificeerde lipide- en mRNA-veranderingen bij hoge en lage ruimtelijke resolutie in de hersenen en periferie, op het tijdstip van maximale acute aanvalsintensiteiten (bij 60 min posteizure inductie), en bij subchronische en acute behandeling met PEA op vier verschillende tijdstippen (20, 60, 120 en 180 min) na KA-aanvalsinductie, een tijdvenster dat de acute fase van epilepsie bestrijkt. Plasma, hersenen en perifere organen van onbehandelde KA-geïnjecteerde muizen, acute en subchronisch PEA-behandelde muizen, evenals voertuig- en PEA-voertuigcontrolemuizen, werden verzameld op elk ^{tijdstip12,13} en onderzocht met deze moleculaire analyse. De moleculaire gegevens werden gecorreleerd met gedragsfenotypen verkregen door het scoren van aanvallen, evenals met immunohistochemische afgeleide gegevens over neurodegeneratieve processen, om de progressie van de acute epilepsiefase en het potentieel van PEA om het te verlichten te ontrafelen.

Protocol

Alle hier beschreven experimentele procedures zijn in overeenstemming met de richtlijn van de Raad van de Europese Gemeenschap van 22 september 2010 (2010/63EU) en zijn goedgekeurd door het plaatselijke dierencomité van de deelstaat Rijnland-Palts, Duitsland (dossierreferentie: 23 177-07/G16-1-075).

1. Diermodel van acute en profylactisch behandelde KA-geïnduceerde epilepsie

1. Voer epileptische inductie, behandeling en gedragsscores uit.
   1. Scheid muizen (minimaal n = 6 muizen per groep) in enkele kooien.
   2. Bereid de injectieoplossing voor aanvallen en inductie en het bijbehorende medium (zie tabel 1), alsmede de behandelingsinjectieoplossing en het bijbehorende medium (zie tabel 2).
   3. Injecteer muizen intraperitoneaal (i.p.) (10 ml / kg lichaamsgewicht van de muis) zonder anesthesie volgens hun groepsidentiteit: ziekte, behandeld of behandeld vehikel (d.w.z. KA, met PEA behandeld KA en de twee voertuiggroepen). Zie figuur 2, tabel 1 en tabel 2.
   4. Monitor en scoor het gedrag volgens de volgende gestandaardiseerde aanvalsintensiteitsschaal: 0 = geen respons; 1 = immobiliteit en staren; 2 = voorpoot en/of staartverlenging, stijve houding; 3 = repetitieve bewegingen, hoofd dobberen; 4 = opfokken en vallen; 5 = continu opfokken en vallen; 6 = ernstige clonische-tonische aanvallen; 7 = ^{overlijden14,15} (figuur 3).
2. Voer een opofferingsprocedure uit voor lipidomische en transcriptomische analyse.
   1. Op vier tijdstippen (d.w.z. respectievelijk 20, 60, 120 en 180 minuten na KA- of voertuiginjectie) offeren zes muizen uit elk van de volgende groepen: PEA-behandeld, PEA-onbehandeld epileptisch voertuig 1 en voertuig 2, volgens IACUC-goedgekeurde protocollen.
   2. Tien seconden nadat elk tijdstip is bereikt, verdooft u de muizen met behulp van een met isofluraan doordrenkt weefsel in een glazen kamer. Bevestig de anesthesie door het verlies van de rechtrichtreflex, aangegeven door het onvermogen om te bewegen terwijl de glazen kamer langzaam omvalt. Onthoofd muizen met een chirurgische schaar en verzamel plasma, hersenen en perifere organen (zie stappen 2.2.2−2.2.2.4).
      LET OP: Ethische voorschriften voor het opofferen van procedures variëren tussen lokale dierencomités. Zorg ervoor dat u de voorschriften van de lokale dierencommissie controleert en volgt.
3. Volg de opofferingsprocedure voor immunohistochemische analyse.
   1. Voor immunohistochemische ^kleuring13, gedragsmatig scoren drie muizen uit elk van de volgende groepen: PEA behandeld, PEA-onbehandelde epilepsie en voertuiggroepen, over het hele tijdsverloop (180 min).
   2. Offer en laat muizen 5 dagen later doordringen. Verdoving muizen diep (zie stap 1.3.1 voor de muizengroepen) door o.a. injectie van pentobarbital (100 mg/kg) en buprenorfine (0,1 mg/kg) als verdovende middelen. Bevestig diepe anesthesie door het verlies van reflex tussen de tenen.
   3. Bevestig de muis op een polystyreenplaat en open de thorax onmiddellijk met een fijne schaar en standaardtang. Plaats de vlinder in de linkerhartkamer en knip het rechteratrium met een fijne schaar.
   4. Pas de snelheid en druk van de pomp aan op een constante peristaltische stroom met een snelheid van 2−3 ml/min. Perfuseer met ijskoude fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende ~ 5 min. Vervang indien nodig de vlinder.
      OPMERKING: Met de juiste perfusie beginnen de inwendige organen (behalve de milt) binnen 1−2 min uit te bleken.
   5. Schakel perfusie over op ijskoude 4% paraformaldehyde (PFA) oplossing gedurende ~ 5 min. Isoleer hele hersenen zoals beschreven in stap 2.2.2 en fixeer gedurende 24 uur in 4% PFA-oplossing bij 4 °C.
   6. Incubeer de hersenen in 30% sucrose-oplossing gedurende 48 uur bij 4 °C. Verwijder de overgebleven sucrose met een droog tissuepapier en vries de hersenen in op een metalen plaat (-80 °C). Bewaar de hersenen bij -80 °C voor de ^{kleuringsprocedures13}.

2. Bemonsteringsprocedures voor lipidomische/transcriptomische analyse

1. Bereid je voor op bemonstering.
   1. Voorkoelde EDTA-buizen voor plasmabemonstering tot 4 °C. Koel de centrifuge en vortexapparatuur voor tot 4 °C. Koel de metalen plaat bedekt met aluminiumfolie (om bevroren hersenen en /of andere interessante weefsels te breken) op droogijs (-80 °C). Precool de gelabelde buizen van 2 ml en 5 ml op droogijs (-80 °C) voor respectievelijk plasma-aliquots, bevroren weefsel en hersenverzameling. Gebruik amberkleurige buizen om lichtgevoelige moleculen, zoals eiCs, te beschermen.
   2. Reinig de weefselbemonsterings- en isolatieapparatuur (chirurgische schaar, rechte scherpe fijne schaar, rechte gladde standaardtang, fijne tang met spiegelafwerking, gebogen tang en spatel, polystyreenschuimplaat en naalden voor fixatie) met een ontsmettingsmiddel (bijv. 70% ethanol).
2. Bemonsteringsprotocollen
   1. Bepaal de volgorde van de bemonstering.
      1. Verzamel bloed onmiddellijk na onthoofding in voorgekoelde EDTA-buisjes van 1 ml (zie stap 2.2.3).
      2. Verwijder de hele hersenen en klik onmiddellijk na verwijdering vast. Deze stap duurt 1−2 min. Bewaar bevroren hersenen bij -80 °C voor verdere verwerking (zie stap 2.2.2).
      3. Verwijder perifere organen van belang (bijv. long, hart, lever), binnen 5 minuten na hersenverwijdering, en klik in en bewaar bij -80 °C voor verdere verwerking (zie stap 2.2.4).
   2. Verwijder de hersenen voor dissectie- of ponsprocedures. Deze procedure duurt 1−2 min/hersenen.
      1. Begin na onthoofding (zie stap 1.2) met het maken van een middellijnincisie in de huid met behulp van een fijne schaar. Bevrijd de schedel door de huid over de ogen te draaien. Reik naar de bovenkant van de schedel en maak een kleine caudale incisie beginnend ter hoogte van het intrapariëtale bot. Vermijd het doorsnijden van de hersenen.
      2. Snijd stevig door het meest voorste deel van de schedel tussen de ogen om hersenverwijdering te vergemakkelijken. Kantel een kant van het pariëtale bot met behulp van een gebogen tang met smal patroon en breek af. Herhaal de laatste stap voor de andere kant.
      3. Verwijder de hersenvliezen. Schuif een spatel onder het voorste deel van de hersenen (d.w.z. de reukbol) en kantel de hersenen voorzichtig naar boven. Schuif de spatel verder naar beneden om de optische en andere hersenzenuwen te breken.
      4. Til de hersenen uit de schedel en knip de hele hersenen onmiddellijk in op een voorgekoelde (-80 °C) metalen plaat met de ventrale kant naar de metalen plaat (dorsaal omhoog).
      5. Laat de hersenen volledig bevriezen en overbrengen in voorgekoelde buizen van 5 ml en bewaar bij -80 °C tot de dissectie van de hersengebieden of de ponsprocedure (zie stappen 3.1. en 3.2).
   3. Voer plasmamonsters uit.
      1. Spike voorgekoelde EDTA-buizen met 10 μL vers bereide indomethacine-verdunning tot een streefconcentratie van 10 μM.
      2. Verzamel het rompbloed onmiddellijk na onthoofding door het lichaam zachtjes in voorgekoelde EDTA-buizen te knijpen tot een maximaal bloedvolume van 1 ml.
         OPMERKING: In het geval van de juiste bloeddruk is knijpen niet nodig. Als het bloedvolume minder dan 1 ml is, verlaag dan de isofluraan incubatietijd om een goede bloedstroom mogelijk te maken.
      3. Centrifugeer onmiddellijk bloedbuizen bij 2.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
      4. Verwijder de resulterende bovenste plasmafase en met het oog op multilipid-analyse aliquot gedefinieerde plasmavolumes in voorgekoelde buizen van 2 ml als volgt: 50 μL voor eCB's/eiCs-analyse, 30 μL voor PR-analyse en het resterende plasmavolume als back-upmonster of voor andere soorten analyses.
      5. Bewaar de plasmamonsters bij -80 °C voor verdere extractie (zie stappen 4.1.2 en 4.1.4).
   4. Voer perifere orgaanbemonstering uit.
      OPMERKING: Gebruik muisanatomische ^{referenties16} en documentatie voor de verplichte cursussen (FELASA) die door dieronderzoekers worden bijgewoond om de individuele organen, hun bindweefsels en / of bloedvaten te identificeren.
      1. Immobiliseer de romp van de muis om orgaanverwijdering met behulp van naalden te vergemakkelijken. Maak een ventrale middellijnincisie met een rechte scherpe schaar ter hoogte van het schaambeen. Gebruik stompe standaardtang om de buikwand te fixeren tijdens het snijden om de buikholte te openen.
      2. Immobiliseer de huid om het verwijderen van buikorganen mogelijk te maken met behulp van stompe tangen. Voor hart- of longverwijdering gaat u verder met de mediale snede in de richting van de borstgrot. Verwijder de long en/of het hart met een fijne tang.
      3. Open de borstholte voorzichtig om bloedingen te voorkomen. Snijd de bindweefsels en bloedvaten die het respectieve orgaan verankeren zonder door het orgaan te snijden.
      4. Breng weefselstukken onmiddellijk over op voorgekoelde metalen platen (-80 °C) en laat volledig bevriezen. Breng weefselstukken over in voorgekoelde buizen en bewaar bij -80 °C voor verdere verwerking (zie stap 4.1).

3. Biologische materiaalverwerking

OPMERKING: Gebruik voor co-extractie van eCB's /eiCs 2 ml amberkleurige buizen als extractiebuizen en voeg in elke buis zeven voorgekoelde stalen kogels toe. Gebruik voor co-extractie van PR's /eCB's en voor dubbele lipide- en RNA-co-extractie 2 ml RNAse-vrije extractiebuizen met keramische kralen (tabel met materialen).

1. Voer hersendissectie en perifere orgaanverwerking uit.
   OPMERKING: Gebruik vergrootlampen om de zichtbaarheid van de hersenen voor dissectie te vergroten.
   1. Reinig de chirurgische hulpmiddelen, waaronder de tang met superfijne uiteinden, 2x met 70% ethanol.
   2. Breng de bevroren hersenen over van -80 °C naar een petrischaal met voorgekoelde fysiologische buffer (pH 5,5) Zorg ervoor dat de petrischaal op 4 °C staat. Laat hersenen volledig ontdooien om dissectie mogelijk te maken. Test zorgvuldig met een tang.
      LET OP: Houd de hersenen niet langer op 4 °C dan nodig is om te ontdooien.
   3. Precool een metalen plaat op ijs (4 °C) en bedek deze met natte weefsels gedrenkt in ijskoude fysiologische buffer (pH 5,5) en breng de hersenen met ventrale zijde voorzichtig over op een voorgekoelde (4 °C) metalen plaat op ijs. Bedek het met natte weefsels gedrenkt in ijskoude fysiologische buffer (pH 5,5).
   4. Ontleed hersengebieden binnen maximaal 5 minuten met behulp van superfijne tiptang. Begin met de hypothalamus (HYP) en draai de dorsale kant omhoog om verder te gaan met de rechterkant. Isoleer de hippocampus (HCr), prefrontale cortex (PFCr), striatum (STRr) en hersenschors (cCTXr). Ontleed vervolgens de linkerkant. Isoleer de hippocampus (HCl), prefrontale cortex (PFCl), striatum (STRl) en hersenschors (cCTXl). Ontleed het cerebellum en het thalamische gebied. Gebruik gepubliceerde anatomische ^{referenties16,17} voor de identificatie van hersengebieden.
   5. Breng elk ontleed stuk rechtstreeks over op een met aluminiumfolie bedekte, voorgekoelde metalen plaat (-80 °C). Laat bevriezen en breng de geïsoleerde hersengebieden over in de gelabelde voorgekoelde buizen van 2 ml.
   6. Verpulver de weefselstukken met behulp van een weefselverpulver (bij -80 °C), waardoor het ontdooien van het weefsel wordt voorkomen. In de koelcel, aliquot weefselpoeder in gelabelde, voorgekoelde extractiebuizen met keramische kralen of stalen ballen. Voor de dual lipidomics/transcriptomics analyse, weeg de weefselpoeder aliquots in de koude kamer. Voor analyse van alleen lipidomics kunt u kiezen tussen normalisatie van het weefselgewicht of het eiwitgehalte. Voor de laatste, ga verder zonder weefselweging.
   7. Snijd de perifere orgaanweefsels in stukken met een maximumgewicht van 20 mg. Ga verder met weefselverpulvering zoals in stap 3.1.6.
   8. Ga verder met de extractie van weefselmonsters (zie stappen 4.1.1, 4.1.3 of 4.1.5) of bewaar buizen bij -80 °C voor latere extractie.
      OPMERKING: De hersenmatrix kan ook worden gebruikt als de onderzoeksopzet dit toelaat. De methode is echter meer geschikt voor een discreet en beperkt aantal hersengebieden en het is niet praktisch om alle bovengenoemde hersengebieden binnen het gestelde tijdsbestek te ontleden en te isoleren.
2. Voer hersenstoten uit.
   1. Monteer de hele, bevroren hersenen op het montagesysteem (Table of Materials) in de cryostaat. Stel de dikte in op 50 μm en snijd in trim-modus dicht bij het gewenste gebied.
   2. Kleuring hersenschijf (18−20 μm) met behulp van toluidineblauw (0,1%−1%) als referentie om de subregio van belang te lokaliseren. Inspecteer de gekleurde plakjes met behulp van een microscoop om de gebieden van belang te identificeren die moeten worden gestanst. Gebruik een muizenatlas als referentie om de juiste anatomische hersengebieden te ^vinden16. Neem ponsen met een diameter van 0,8−1,0 mm met behulp van monstercorers in voorgekoelde buizen.
   3. Weeg bevroren ponsen in de koelcel in gelabelde, voorgekoelde afzuigbuizen van 2 ml met keramische kralen of stalen ballen. Gebruik amberkleurige buizen voor eCBs en eiCs co-extractie.
   4. Begin met de extractie (zie stappen 4.1.1, 4.1.3 of 4.1.5) of bewaar buizen bij -80 °C voor verdere extractie.
3. Voer plasmaverwerking uit.
   1. Plaats de ingevroren plasmamonsters op ijs (4 °C) en laat ze ontdooien (~20 min).
   2. Zorg ervoor dat het plasma volledig is ontdooid voordat u met de extractie begint.
   3. Ga verder met de plasma-extractieprocedure (zie stap 4.1.2 of 4.1.4).
      OPMERKING: Plasmamonsters moeten bij -80 °C blijven tot de extractie. Vermijd cycli van ontdooien en opnieuw invriezen.

4. Extractieprocedures

1. Voer Liquid-Liquid (LLE) lipide co-extractieprotocollen uit.
   1. Voer co-extractie uit van eCB's en eiCs uit hersenstukken, ponsen of weefselpoedermonsters.
      OPMERKING: Nauwkeurig pipetteren is vereist tijdens de hele procedure.
      1. Plaats de extractiebuizen met de weefselmonsters en zeven stalen ballen op ijs (4 °C). Voeg 600 μL ijskoude MTBE en 50 μL ACN/_H2O (1:1; v/v) toe met daarin de interne normen. De streefconcentratie van de interne normen in het uiteindelijke analysevolume (50 μL) is als volgt: 1 ng/ml AEA-d4, 125 ng/ml 2-AG-d5, 3.000 ng/ml AA-d8, 2 ng/ml OEA-d4; PEA-d4, 12,5 ng/ml 1-AG-d5, 2,5 ng/ml PGF2α-d4 en 5 ng/ml voor PGD2-d4; PGE2-d9; 5(S)-HETE-d8; 12(S)-HETE-d8; Respectievelijk 20-HETE-d6 en TXB2-d4.
      2. Voeg 400 μL mierenzuur van 0,1 M toe en homogeniseer met een weefsellyser (30 s-1 min). Centrifugeer het homogenaat gedurende 15 minuten bij 5.000 x g bij 4 °C. Laat het invriezen van de waterige onderste fase gedurende 10 minuten bij -80 °C toe om de overdracht van de bovenste organische fase te vergemakkelijken.
      3. Breng de organische fase over in nieuwe buizen. Verdamp onder een zachte stroom van _N2 bij 37 °C en reconstitueer in 50 μL ACN/_H2O (1:1; v/v) voor verdere analyse.
      4. Bewaar de waterige fase bij -20 °C of -80 °C voor verdere analyse van het eiwitgehalte.
   2. Voer co-extractie uit van eCB's en eIC's uit plasmamonsters.
      1. Ontdooi plasma aliquots bij 4 °C. Voeg 800 μL MTBE en 50 μL ACN/_H2O (1:1; v/v) toe met de interne normen (analoog aan die welke worden gebruikt voor weefselanalyse, zie stap 5.1.1). Optimaliseer de interne standaardconcentratie voor spiking met behulp van referentieplasmamonsters.
      2. Voeg gedurende 2 minuten 600 μl mierenzuur en vortexmonsters bij 4 °C 600 μL mierenzuur en vortexmonsters toe. Centrifugeer monsters bij 4.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C.
      3. Breng de organische fase over in nieuwe buizen, verdamp onder een zachte stroom van _N2 bij 37 °C en reconstitueer in 50 μL ACN/_H2O (1:1; v/v) voor LC/MRM-analyse.
         OPMERKING: Vermijd indien mogelijk de opslag van gedroogde extracten van eiCs en ga onmiddellijk over tot LC/MRM-analyse. Als opslag niet kan worden vermeden, gebruik dan een korte opslag gedurende slechts 2−3 dagen bij 4 ° C met monsters in LC-injectieoplosmiddel.
   3. Voer co-extractie uit van PR's en eCB's uit hersengebieden, stoten of andere weefselpoedermonsters.
      1. Plaats de extractiebuizen met de weefselmonsters en keramische kralen op ijs (4 °C). Voeg 800 μL MTBE/MeOH (10:3; v/v) en 10 μL MeOH toe met daarin de interne normen. De streefconcentratie van de interne normen in het eindvolume voor analyse (100 μL) is als volgt: 150 ng/ml voor PC 17:0/14:1, PE 17:0/14:1, PA 17:0/14:1, 100 ng/ml PG 17:0/14:1; PS 17:0/14:1; PI 17:0/14:1; LPC 17:0; LPA 17:0; SM d18:1/12: 0,1 ng/ml AEA-d4, 60 ng/ml 2-AG-d5, 4.000 ng/ml AA-d8, 2 ng/ml OEA-d2 en 3 ng/ml PEA-d4 respectievelijk.
      2. Voeg 200 μL 0,1% mierenzuur toe dat 25 μM tetrahydrolipstatine/URB597 en 50 μg/ml BHT bevat. Homogeniseer met de weefselhomogenisator (Materiaaltafel) en centrifugeer bij 5.000 x g en 4 °C gedurende 15 min.
      3. Herstel de bovenste organische fase in nieuwe buizen en verdamp onder een zachte stroom van _N2 bij 37 °C. Reconstitueer in 90 μL MeOH en bewaar bij -20 °C of -80 °C of ga verder met de volgende stap.
      4. Voeg 10% _H2O toe aan een hoeveelheid lipidenextract (4.1.3.3) en injecteer 10 μL in de LC/MS voor PLs-analyse. Ga voor verdere eCB-analyse verder met stap 4.3.5.
      5. Neem een aliquot van het extract (4.1.3.3), verdamp tot droogheid en reconstitueer in ACN/_H2O (1:1; v/v). Gebruik 20 μL voor LC/MS-injectie voor eCB-analyse.
   4. Voer co-extractie uit van PR's en eCB's uit plasmamonsters.
      1. Ontdooi plasma aliquots bij 4 °C, voeg 1.000 μL MTBE/methanol (10:3; v/v) en 10 μL MeOH met interne normen (analoog aan stap 4.1.3) en vortex toe bij 4 °C gedurende 1 min.
      2. Voeg 250 μL _H2O en vortex gedurende 45 minuten bij 4 °C toe. Centrifugeer monsters gedurende 15 minuten bij 5.000 x g en 4 °C. Herstel de bovenste organische fase, verdamp onder een zachte stroom van _N2 bij 37 °C en reconstitueer in 90 μL methanol voor verdere LC/MS-analyse. Bewaren bij -20 °C of -80 °C of doorgaan naar de volgende stap.
      3. Voeg voor de analyse van DE's 10% water toe aan een hoeveelheid lipidenextract (4.1.2.2).
      4. Voeg voor eCB-analyse 10% water toe aan een hoeveelheid lipidenextract (zie 4.1.4.3), verdamp tot droogheid en reconstitueer in 50% ACN/_H2O (1:1; v/v).
   5. Voer dubbele extractie van RNA en lipiden (co-extractie van PR's en eCB's) uit weefselmonsters uit.
      LET OP: Zorg ervoor dat u onder RNA-vrije omstandigheden werkt om RNA-degradatie te voorkomen.
      1. Ontdooi weefselpoeder aliquots of hersenbossen (bij 4 °C) en voeg 600 μL RLT-buffer met 5 μM THL/URB597, 10 μg/ml BHT en 1% β-mercaptoethanol (voor percentages van het uiteindelijke volume homogenisatiebuffer, zie stap 4.1) samen met 200 μL chloroform toe aan extractiebuizen met bevroren hersenstoten en keramische kralen.
      2. Spikemonsters met 10 μL intern standaardmengsel voor PR's en eCB-co-extractie (zie stap 4.1.3) en homogeniseren via weefselhomogenisator (hoge snelheid, 20 s).
      3. Breng lysaten over in nieuwe centrifugebuizen en centrifugeer gedurende 5 minuten op volle snelheid en 4 °C om de fasescheiding mogelijk te maken.
      4. Herstel en gebruik de bovenste fase voor RNA-extractie met behulp van standaard RNA-extractieprocedurekits (Tabel met materialen). Eluut-RNA in een totaal volume van 50 μL RNase-vrij water en opslaan bij -80 °C.
         OPMERKING: Het monster in stap 4.1.5.4 is geschikt voor zowel RNA-sequencing als qPCR met behulp van de juiste methoden en instrumentatie.
      5. Gebruik de onderste chloroform-bevattende fase voor lipide-extractie. Voeg 800 μL MTBE/methanol (10:3; v/v) en 200 μL 0,1% mierenzuur en vortex toe gedurende 45 minuten bij 4 °C. Herstel de bovenste organische fase en verdamp onder een zachte stroom van _N2 bij 37 °C.
      6. Reconstitueer in 90 μL methanol voor verdere LC/MS-analyse. Bewaren bij -20 °C of -80 °C of ga verder met stap 5.
      7. Voeg 10% _H2O toe aan een aliquot lipide-extract (zie bovenstaande stap 4.1.5.6) en injecteer 10 μL in de LC/MS voor PR-analyse. Ga voor verdere eCB-analyse verder met stap 5.7.
      8. Neem een aliquot van het extract (zie stap 4.1.5.6) verdampen tot droogheid en reconstitueren in ACN/_H2O (1:1; v/v). Gebruik 20 μL voor LC/MS-injectie voor eCB-analyse (analoog aan stap 4.3.5).

5. Kwalitatieve en kwantitatieve profilering van LC/MRM

1. Bereid LC-oplosmiddelsystemen, kalibratieoplossingen en kwaliteitscontrolemonsters voor.
   1. Bereid voor PV's mobiele fase A: methanol/water (1:1; v/v) met 7,5 mM ammoniumformiaat en 0,1% THEE. Bereid mobiele fase B voor: methanol/isopropanol (2:8; v/v) met 7,5 mM ammoniumformiaat en 0,1% TEA. Bewaar oplosmiddelen in LC-flessen.
   2. Bereid voor eCB- en eiC-scheiding de volgende LC-oplosmiddelen voor: 0,1% mierenzuur als mobiele fase A en 100% ACN met 0,1% mierenzuur als mobiele fase B. Bewaar oplosmiddelen in LC-flessen.
   3. Bereid kwaliteitscontroles voor met behulp van de kalibratienormen en interne normen (tabel 3) in een equivalente of door de gebruiker gedefinieerde concentratie.
   4. Bereid kalibratiecurven voor met zeven concentratiepunten. Gebruik dezelfde interne standaardbatch om de kalibratiecurveoplossing en de te analyseren monsters te verhogen.
2. Gebruik de LC-MRM-methode voor kwalitatieve en kwantitatieve lipidenprofilering.
   1. Open het tabblad Build Acquisition Method in de commerciële software (bijv. Analyst) en selecteer LC/MRM-modus met polariteitsschakeling. Stel in de methode de ionovergangen in (zoals aangegeven in tabel 3) voor kwantitatieve profilering. Stel de bezinkingstijd in op 50 ms.
   2. Stel voor PLs-profilering de volgende ionenbronparameters in: gordijngas = 40 psi; temperatuur bronverwarming = 550 °C; ionensproeispanning = -4.500 V in negatieve ionenmodus en = +5.200 V in positieve ionenmodus.
   3. Stel voor co-analyse van eCB's en EIC's de volgende parameters in: gordijngas = 40 psi; temperatuur bronverwarming = 550 °C; ionensproeispanning = -4.500 V in negatieve ionenmodus en = +4.500 V in positieve ionenmodus.
   4. Stel voor PL-analyse de kolomverwarming in op 45 °C en het debiet op 200 μL/min en stel de volgende gradiënt in: min 0 = 40% B; min 3 = 40% B; min 42 = 90% B; min 43 = 99% B; min 50 = 99% B, en min 52 = 40% B. Stel het injectievolume in op 10 μL.
   5. Stel voor de analyse van eCB's en eIC's de kolomtemperatuur in op kamertemperatuur en stel de volgende gradiënt in: min 0 = 20% B; min 1 = 20% B; min 5 = 50% B, min 12 = 50% B; min 13 = 90% B, min 17 = 90% B; min 17,5 = 20% B; min 20 = 20% B. Stel het injectievolume in op 20 μL.
      OPMERKING: MRM-omstandigheden kunnen variëren tussen instrumentele platforms, vandaar dat fragmentatie en MRM-omstandigheden experimenteel moeten worden afgeleid en ionisatieparameters moeten worden getest en indien nodig worden aangepast om maximale gevoeligheid en selectiviteit te krijgen.
3. Batchanalyse uitvoeren.
   1. Open build acquisition batch en vul de vereiste parameters in voor monsterbeschrijving, locatie in het monsterrek van autosampler en acquisitiemethode (ingesteld als stap 5.2).
   2. Neem altijd kwaliteitscontroles op aan het begin en einde van de analyse en binnen de batch. Neem na elke 25−30 monsters ten minste drie kalibratiecurven op in de batch en neem een wasstap op met een oplosmiddel naar keuze na elk kwaliteitscontrolemonster, kalibratiecurve en aan het einde van de monsterbatch.
   3. Breng de bij stap 4 verkregen monsters over in injectieflacons met LC/MS. Plaats de monsters in de laadrekken van de LC autosampler volgens de positie die in de batch is gedefinieerd en laad het monsterrek in de LC autosampler.
   4. Batch indienen en wachtrijanalyse starten.
4. Kwantificering van lipiden
   1. Gebruik de commerciële software (bijv. Analyst) en de geïntegreerde kwantificeringsmodule voor eCB's en eIC-kwantificering en commerciële software (bijv. Multiquant) voor PLs-kwantificering.
      OPMERKING: De tweede software kan ook worden gebruikt voor eCB's en eiCs, vooral wanneer één interne standaard wordt gebruikt voor de kwantificering van meerdere analyten.
   2. Open Build Quantification Method en vul de parameters in voor analyten, interne standaarden, MRM-overgangen en schrijf de interne standaarden toe aan de te kwantificeren analyten (tabel 3). Stel de minimale piekhoogte in op 500 cps.
   3. Gebruik de volgende criteria of combinatie daarvan voor de toewijzing van lipidenidentiteit en de daaropvolgende kwantificering6: retentietijdmatching van lipide-endogene analyten met kalibratiestandaarden en/of gedeutereerde interne normen, indien beschikbaar; fragmentionenmatching door positieve en negatieve ionenmodusfragmentatie voor een bepaalde m/z lipideanalyten waarvoor geen normen zijn voorzien; literatuur-afgeleid elutiegedrag van lipiden onder op vergelijkbare wijze gebruikte LC-omstandigheden om isomeer- en/of isobare structuren te ontleden; en, indien beschikbaar, LC/MS- en MS/MS-analyse met hoge-resolutie massaspectrometrie, waarbij gebruik wordt gemaakt van vergelijkbare LC-omstandigheden als voor gerichte analyse (met behulp van LC/MRM), om de identiteit en het elutiegedrag van endogene lipiden van belang nauwkeurig te ^{identificeren18,19}.
   4. Gebruik voor de validatie van batchanalyse de volgende criteria: nauwkeurigheid van kwantificering ≤ ±20%; regressiecoëfficiënt ≥0,97 (idealiter ≥0,99).
      OPMERKING: Volg de richtlijnen voor de ontwikkeling en validatie van bioanalytische methoden om een betrouwbare, reproduceerbare analyse van de doelmoleculen te garanderen.

Resultaten

De reeks beschreven protocollen kan op verschillende niveaus op een doelspecifieke manier worden gecombineerd, zoals de keuze van het diermodel, de bemonsteringsroute, de extractiemethode en de profilering (figuur 1).

Om veranderingen in het lipidenniveau in de hersenen en de periferie te bepalen gedurende een tijdsverloop van een acute epileptische aanvalstoestand en om het potentiële anti-epilepti...

Discussie

De neurolipidomische en transcriptomische methodologie die hier wordt beschreven, is een levensvatbaar middel om elke ziekte of gezonde ontwikkeling bij hoge en lage ruimtelijke resolutie in de hersenen en perifere organen te onderzoeken. Vanwege de geoptimaliseerde plasmabemonsterings- en behandelingsprocedures kan plasmalipomische analyse ook worden uitgevoerd van dezelfde dieren die zijn opgeofferd voor weefsellipomica en transcriptomica, waardoor de betrouwbaarheid van moleculaire correlaten van weefselbloed en de on...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
12(S)-HETE	Biomol	Cay10007248-25	Lipid Std
12(S)-HETE-d8	Biomol	Cay334570-25	Lipid Std
1200 series LC System	Agilent		Instrumentation/LCMS
2100 Bioanalyzer	Agilent		Instrumentation/qPCR
5(S)-HETE-d8	Biomol	Cay 334230	Lipid Std
ABI 7300 Real-Time PCR cycler	Applied Biosystems		Instrumentation/qPCR
Acetonitrile LC-MS Chroma Solv	Honeywell	9814920	Solvent/LCMS
amber eppendorf tubes	Eppendorf		Sample Prep.
Analyst 1.6.2 Software	AB SCIEX, Darmstadt		Software
Analytical balance	Mettler Toledo		Instrumentation/Sample prep.
Arachidonic Acid-d8 MS Standard	Biomol	Cay-10007277	Lipid Std
Bessmann Tissue Pulverizer	Spectrum Laboratories, Inc. (Breda, Netherlands)		Instrumentation/Sample prep.
Bino	Zeiss		Microscopy
cleaved Caspase 3 antibody	Cellsignaling	9661S	Microscopy
Cryostat, Leica CM3050 S	Leica Biosystems		Instrumentation/Sample prep.
CTC HTC PAL autosampler	CTC Analytics AG		Instrumentation/LCMS
Dumont Curved Forceps Dumoxel #7	FST	11271-30	Surgical Tools
Dumont Forceps Super fine tip #5SF (x2)	FST	11252-00	Surgical Tools
EDTA 1000 A Röhrchen	Kabe Labortechnik	078001	Sample Prep.
EP-1 EconoPump	BioRAD	700BR07757	Instrumentation/Sample prep.
Fine Forceps Mirror Finish	FST	11412-11	Surgical Tools
Fine Iris Scissors straight sharp	FST	14094-11	Surgical Tools
Fine Scissor Tungsten Carbide straight	FST	14568-09	Surgical Tools
Iris Spatulae	FST	10094-13	Surgical Tools
Kainic acid	Abcam	ab120100	Epileptic drug
Lipid View software	AB SCIEX, Darmstadt		Software
LPC 17:0	Avanis Polaris	855676P	Lipid Std
LPC 18:0	Avanis Polaris	855775P	Lipid Std
Luna 2,5µm C18(2)- HAST 100A LC column	Phenomenex	00D-4446-B0	Instrumentation/LCMS
Magnifying lamp	Maul GmbH		Instrumentation/Sample prep.
Methanol LC-MS Chroma Solv 99.9%	Honeywell	9814920	Solvent/LCMS
Motic Camara	Motic		Microscopy
MTBE	Honeywell	34875-1L	Solvent/LCMS
MultiQuant 3.0 quantitation software package	AB SCIEX, Darmstadt		Software
NanoDrop 2000c Spectrophotometer	Thermo Scientific		Instrumentation/qPCR
PA 16:0-18:1	Avanis Polaris	840857P	Lipid Std
PA 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1404	Lipid Std
Palmitoyl Ethanolamide	Biomol	Cay90350-100	Lipid Std
Palmitoyl Ethanolamide-d5	Biomol	Cay9000573-5	Lipid Std
PC 16:0-18:1	Avanis Polaris	850457P	Lipid Std
PC 16:0-18:1	Avanis Polaris	850457P	Lipid Std
PC 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1004	Lipid Std
PE 16:0-18:1	Avanis Polaris	850757P	Lipid Std
PE 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1104	Lipid Std
PG 16:0-18:1	Avanis Polaris	840457P	Lipid Std
PG 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1204	Lipid Std
PI 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1504	Lipid Std
Precelleys 24	Peqlab		Instrumentation/Sample prep.
Precellys Keramik-Kügelchen	Peqlab	91-pcs-ck14p	Sample Prep.
Precellys Stahlkugeln 2,8mm	Peqlab	91-PCS-MK28P	Sample Prep.
Precellys-keramik-kit 1,4 mm	VWR	91-PCS-CK14	Sample Prep.
Prostaglandin D2	Biomol	Cay 12010	Lipid Std
Prostaglandin D2-d4	Biomol	Cay 312010	Lipid Std
Prostaglandin E2	Biomol	Cay10007211-1	Lipid Std
Prostaglandin E2-d9	Biomol	Cay10581-50	Lipid Std
PS 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1304	Lipid Std
Q Trap 5500 triple-quadrupole linear ion trap MS	AB SCIEX	AU111609004	Instrumentation/LCMS
Real Time PCR System	Appliert Biosystem		Instrumentation/qPCR
Resolvin D1	Biomol	Cay10012554-11	Lipid Std
Rneasy Mini Kit - RNAase-Free DNase Set (50)	Qiagen	79254	Sample Prep.
Security Guard precolumn	Phenomenex		Instrumentation/LCMS
Shandon coverplates	Thermo Fisher	72110017	Microscopy
Shandon slide rack and lid	Thermo Fisher	73310017