Methodenartikel

Analyse van combinatoriële miRNA behandelingen te reguleren celcyclus en angiogenese

DOI:

10.3791/59460

⸱

30 maart 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Basic Pharmaceutical and Toxicological Sciences, College of Pharmacy, University of Louisiana Monroe, 2Department of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, Texas Tech University Health Sciences Center, 3Department of Obstetrics and Gynecology, School of Medicine, Texas Tech University Health Sciences Center

In dit artikel

Erratum-melding

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

miRNA therapeutics hebben aanzienlijke potentieel bij het reguleren van de progressie van kanker. Hier gedemonstreerd worden analytische benaderingen gebruikt voor de identificatie van de activiteit van een combinatorische miRNA behandeling in het stoppen van de celcyclus en angiogenese.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Longkanker (LC) is de belangrijkste oorzaak van kanker sterfgevallen wereldwijd. Gelijkaardig aan andere kankercellen, een fundamenteel kenmerk van LC cellen is ongereguleerde proliferatie en celdeling. Remming van de proliferatie door stopzetting van de celcyclus is aangetoond dat een veelbelovende benadering voor de behandeling van kanker, met inbegrip van LC.

miRNA therapeutics opgedoken als belangrijk post-transcriptional gene regelgevers en worden steeds bestudeerd voor gebruik in de behandeling van kanker. In recente werk gebruikt wij twee miRNAs, miR-143 en miR-506, voor het regelen van de celcyclus. A549 niet-kleincellige longkanker (NKCLK) kankercellen waren transfected, gen expressie veranderingen werden geanalyseerd en apoptotic activiteit als gevolg van de behandeling was ten slotte geanalyseerd. Downregulatie van cycline-afhankelijk kinases (CDKs) werden gedetecteerd (dat wil zeggen, CDK1, CDK4 en CDK6) en celcyclus halt bij de G1/S en G2/M fase-overgangen. Analyse van het traject aangegeven potentiële antiangiogenic activiteit van de behandeling, dat de aanpak met veelzijdige activiteit schenkt. Hier beschreven zijn de methoden voor het identificeren van miRNA activiteit met betrekking tot de celcyclus remming, inductie van apoptosis en effecten van behandeling op de endotheliale cellen door remming van angiogenese. Gehoopt wordt dat de hier gepresenteerde methoden toekomstig onderzoek op miRNA therapeutics en overeenkomstige activiteit steunen zullen en dat de representatieve gegevens andere onderzoekers tijdens de experimentele analyses begeleiden zal.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De celcyclus is een combinatie van meerdere regelgevende gebeurtenissen waarmee verdubbeling van DNA en cel proliferatie door middel van de mitotische proces1. Cycline-afhankelijk kinases (CDKs) regelen en bevorderen van de celcyclus2. Onder hen hebben de mitotische CDK (CDK1) en de interfase CDKs (CDK2, CDK4 en CDK6) een sleutelrol in de celcyclus progressie3. Eiwit Retinoblastoom (Rb) is door de CDK4/CDK6 complex dat celcyclus progressie4phosphorylated, en CDK1 activering is essentieel voor succesvolle celdeling5. Talrijke CDK-remmers zijn ontwikkeld en geëvalueerd in klinische proeven in de afgelopen paar decennia, met vermelding van het potentieel van de doelgerichtheid van CDKs in de behandeling van kanker. In feite, drie CDK-remmers zijn goedgekeurd voor de behandeling van kanker van de borst onlangs6,7,8,9,10. Dus, CDKs, en in het bijzonder, CDK1 en CDK4/6, zijn van groot belang bij het reguleren van de progressie van kanker cellen.

miRNAs (miRs) zijn kleine, niet-coderende RNAs en post-transcriptional regulatoren van genexpressie, regulering van ongeveer 30% van alle menselijke genen11. Hun activiteit is gebaseerd op translationeel onderdrukking of afbraak van messenger RNAs (mRNAs)12. Illustratief voor hun biologische betekenis, meer dan 5.000 miRNAs geconstateerd en een enkele miRNA molecuul kan meerdere genen11,13regelen. MiRNA expressie geweest en wat nog belangrijker is, gekoppeld aan verschillende ziekten en ziekte statussen, met inbegrip van kanker13. In feite, miRNAs hebben gekenmerkt als oncogene of tumor suppressors, kunnen bevorderen of onderdrukken tumor ontwikkeling en progressie14,15. De relatieve uitdrukking van miRNAs in zieke weefsels kan reguleren de progressie van de ziekte; exogene levering van miRNAs heeft dus therapeutisch potentieel.

Longkanker is de belangrijkste oorzaak van sterfgevallen ten gevolge van kanker en groter is dan 60% van alle longen maligniteiten non-small zijn cell lung kankers16,17, met een 5-jaars overlevingskansen van minder dan 20%18. Het gebruik van miR-143-3 p en miR-506-3 p is onlangs geëvalueerd voor de cel cycli in long kanker cellen11targeting. miR-143 en miR-506 sequenties die complementariteit te CDK1 en CDK4/CDK6 en de gevolgen van deze twee miRs voor A549 cellen werden geanalyseerd. De experimentele gegevens worden gepresenteerd en in dit Groenboek besproken. Genexpressie, celcyclus en apoptosis werden geëvalueerd aan de hand van verschillende experimentele designs en timepoints na transfectie. We gebruikten real-time kwantitatieve PCR (RT-qPCR) methoden samen met microarray analyse voor het meten van specifieke genexpressie, en volgende-generatie RNA sequencing werd gebruikt om te bepalen van globale gene disregulatie11. De laatste methode geeft de relatieve overvloed van afschrift van elk gen met hoge gevoeligheid en reproduceerbaarheid, terwijl duizenden genen van een enkele experimentele analyse kunnen worden geanalyseerd. Bovendien apoptotic analyse als gevolg van miRNA behandeling werd uitgevoerd en hier wordt beschreven. Bioinformatics aangevuld de route-analyse. Hier gepresenteerd worden protocollen gebruikt voor analyse van het therapeutisch potentieel van de combinatorische miR-143 en miR-506.

Het hoofddoel van dit protocol is de effecten van miRNAs in cellen, met een focus op de celcyclus te kunnen identificeren. Het scala aan technieken gepresenteerd hier span van gen expressie analyse voorvertaling (met qPCR) om te werken en nieuwe technieken voor genetische analyse op het niveau van eiwitten, zoals microarray analyse. Gehoopt wordt dat dit verslag nuttig voor onderzoekers die geïnteresseerd is in het werken met miRNAs. Bovendien wordt methodologie voor flow cytometrische analyse van de celcyclus en apoptosis van cellen gepresenteerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. miR-143 en miR-506 transfectie

Let op: Gebruik latex handschoenen, beschermende brillen en een laboratorium jas tijdens het uitvoeren van de beschreven experimenten. Indien nodig, gebruik de bioveiligheid kabinet met het kabinet ventilator op, zonder het blokkeren van de luchtwegen of verstoren van de laminaire luchtstroming. Altijd ingesteld de beschermende glazen raam op de juiste hoogte, zoals beschreven door de fabrikant.

  1. Zaad NKCLK A549 cellen in een T25 cm2 kolf/6/96 goed plaat in DMEM/F12K media aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine (voedingsbodems) in de kap van een weefselkweek en na een nacht bebroeden bij 37 ° C met 5% CO2 in een incubator weefselkweek.
  2. Op te schorten van de miR-143 en/of miR-506 nabootsers of klauteren van siRNA met transfecting agent (2,4 µg miR waren gemengd met 14 µL van transfecting agent; Zie Tabel van materialen) in 500 µL van transfectie media en 1,5 mL serum en antibioticum-gratis DMEM/F12K media op een definitieve miRNA concentratie van 100 nM. miRNA bedrag mogelijk optimalisatie op verschillende cellen en concentraties. Passende benaderingswijzen omvatten de transfectie van cellen met toenemende concentraties van miRNA (dat wil zeggen, 50-200 nM) en evaluatie van meningsuiting Downregulatie van de genen van belang.
  3. Verwijder voedingsbodems uit kolf/plaat en een keer wassen met 1 x PBS.
  4. Toevoegen van miRNA/scramble-transfecting agent complexen en Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2 voor 6 h (kolf grootte bepaalt het volume van de toegevoegde incubatie).
  5. Vervangen van de media met 4 mL cultuurmedia en cellen voor 24u en/of 48 uur uit te broeden.
  6. Oogsten van transfected cellen door trypsinebehandeling, door toevoeging van 1 mL trypsine-EDTA in elke kolf T25 cm2 , Incubeer gedurende 5-10 minuten bij 37 ° C en voeg 3 mL van voedingsbodems te oogsten van de cellen. Plaats de inhoud van elke kolf in een aparte, gemarkeerde 15 mL-buis. Werken in de kap van een weefselkweek.
  7. Centrifugeer bij 751 x g gedurende 5 minuten en verwijder de bovendrijvende substantie.
    Opmerking: Terughoudendheid is geboden tijdens het supernatant verwijderen, zoals agitatie van de buis leiden verlies van cellen tot kan.
  8. Voeg 2 mL 1 x PBS en Centrifugeer gedurende 5 min op 751 x g.
  9. Herhaal stap 7 en 8 keer geen sporen van media en de bovendrijvende vloeistof verwijderen.
    Opmerking: In dit stadium, monster buizen kunnen worden achtergelaten bij-80 ° C of onmiddellijk kunnen worden gebruikt.

2. RNA extractie

  1. Reinig het werkgebied door te besproeien met 70% isopropylalcohol en RNAse decontaminatie oplossing.
  2. RNA extractie moet worden uitgevoerd met behulp van een passende RNA kit (Zie Tabel van materialen).
  3. Verwijder de buizen van-80 ° C en laat hen te ontdooien. Voeg 300 µL van lysis buffer en Pipetteer omhoog en omlaag te breken van de celmembraan.
  4. Voeg een gelijk volume van 100% ultra pure ethanol.
  5. Meng goed en plaats in het scheiden van de kolom.
  6. Centrifugeer tussen 11 en 16 x g voor 30 s en verwijder de doorstroming.
  7. Voeg 400 µL buffer en centrifuge om de buffer te wassen.
  8. Voeg 5 µL van DNAse I met 75 µL van de spijsvertering van DNA van de buffer in elk monster en incubeer gedurende 15 minuten.
  9. Het wassen van het monster met 400 µL van RNA prep buffer.
  10. Wassen 2 x met RNA was buffer.
  11. Voeg nuclease-gratis water naar de kolom, centrifuge, vervolgens verzamelen de RNA.
  12. Meet de totale concentratie van RNA met een UV spectrofotometer.

3. RT-qPCR

  1. Voorafgaand aan de RT-qPCR, cDNA te synthetiseren. Na RNA concentratie kwantificering, 1 microgram van RNA in een 20 µL eindvolume van reactie voor te bereiden van cDNA in een PCR-buis te plaatsen. Werkt altijd op een schone bankje.
  2. Alle andere benodigde ingrediënten zijn opgenomen in tabel 1.
IngrediëntenHoeveelheid (µL) / proeven (20 µL)
5 X cDNA Master mix4
dNTPs2
Willekeurig hexamers1
RT enhancer1
Verso enzym mix1
DNase en RNase gratis waterVereiste aantal na het toevoegen van RNA om 20 µL

Tabel 1: Materialen voor cDNA synthese van RNA monsters. Benodigde hoeveelheid van de respectieve ingrediënten voor te bereiden op een master mix één monster voor cDNA synthese.

  1. Incubeer in een thermische cycler met de volgende temperaturen: 42 ° C gedurende 30 minuten; 95 ° C gedurende 2 min; 4 ° C tot het verzamelen van monsters.
  2. Gebruik onmiddellijk in regelmatige PCR of qPCR, of bewaar cDNA bij-20 ° C.
  3. Bereiden voorwaartse en omgekeerde primer oplossingen met DNase/RNase-gratis water met een concentratie van 10 µM uit voorraad primer oplossing.
  4. Aparte master mixen voor elk gen worden gedetecteerd, volgens het aantal monsters voor te bereiden. Voor elk monster cDNA (goed qPCR), is de hoeveelheid reactie bereid volgens tabel 2.
IngrediëntenHoeveelheid (µL) / proeven (20 µL)
SYBR master mix10
Voorwaartse Primer - 10 μM2
Omgekeerde Primer - 10 μM2
DNase en RNase gratis water3
cDNA monster3

Tabel 2: materialen voor kwantitatieve PCR in real time van cDNA monsters. Vereist aantal stuks van ingrediënten voor te bereiden op een master mix één monster voor qPCR.

  1. Plaats elk monster in de respectieve putten.
  2. Ontwerp de indeling van de steekproef voor de plaat met 96 goed qPCR. Voor elk monster en geanalyseerd gen, voeren de reactie in triplicates, of ten minste in duplicaten.
  3. Het zegel van de 96 goed plaat met een optisch duidelijk zelfklevende dekking.
  4. Quick-draai de plaat om het reactiemengsel te bereiken onder aan elk putje.
  5. RT-qPCR uitvoeren volgens het volgende thermische verloop:
    1) 50 ° C gedurende 2 minuten
    2) 95 ° C gedurende 2 min
    3) 95 ° C gedurende 15 s
    4) Neem lezing
    5) 60 ° C gedurende 1,5 min
    6) Herhaal stap 3 voor 39 keer
  6. Voer het volgende thermische verloop in het verlengde van het bovenstaande te bepalen van de smeltende kromme waarin versterking van één product.
    7) 65 ° C gedurende 0.31 min
    8) +0.5 ° C/cyclus
    9) plaat lezen
    10) Herhaal stap 8 voor 60 keer tot het bereiken van 95 ° C
    11) 72 ° C gedurende 2 minuten

4. Agarose de Elektroforese van het gel te bevestigen van één gen versterking

  1. Bereiden 1% agarose gel in 1 x TBE buffer.
  2. Toevoegen van ethidiumbromide (EtBr) in warm (~ 50 ° C) gel tot het bereiken van een eindconcentratie van ongeveer 0,2-0,5 µg/mL. EtBR bindt met DNA en in staat stelt om onder UV-licht in een gel imager worden gevisualiseerd.
  3. Giet de warme gel in een gel-lade geleverd met een doos van de gel elektroforese. Sluit de meegeleverde kam strak voor uniforme putten.
  4. Laat de gel aan rest en koel aan kamertemperatuur (RT) voor ~ 30 min.
  5. Wanneer de gel is gestold, plaatst u de gel en een lade in het vak van de gel.
  6. Vul het vak gel met 1 x TBE buffer totdat de gel is volledig gedekt.
  7. Het meten van de concentratie van het DNA van PCR versterking proces met behulp van een UV-spectrometer.
  8. Nemen ~ 15 ng van DNA in een klein buisje van PCR, voegt toe 5 µL van kleurstof en de benodigde hoeveelheid water tot een totaal volume van 15 µL nuclease-vrij.
  9. Laad de DNA-ladder en de voorbeelden in de putjes.
  10. De gel op 100 V uitvoeren, totdat de lijn van de kleurstof ongeveer 75% - 80% van de gel is.
    Opmerking: Zorg ervoor dat de gel loopt van een negatieve naar de positieve lading.
  11. Verwijderen van de gel en plaats deze in de gel imager te visualiseren van DNA.

5. celcyclus analyse

  1. Zaad 5 x 105 cellen voor elk monster in een kolf van T25 cm2 en uitvoeren van een transfectie volgens het protocol beschreven in sectie 1, stap 1-5.
  2. Na 24 uur en 48 uur, vervolgens de cellen te oogsten door trypsinebehandeling.
  3. De cel schorsingen overbrengen in 15 mL steriele buizen en labelen hen goed.
  4. Centrifugeer steekproeven bij 751 x g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant.
  5. Voeg toe 2 mL ijskoud 1 x PBS, vortex en centrifugeer bij 751 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant.
  6. Herhaal de stap wassen met 1 x PBS om resterende media te verwijderen.
  7. Resuspendeer en breken de pellet door 200 µL van ijskoude 1 x PBS door pipetteren toe te voegen.
  8. Herstellen de cellen door toevoeging van 2 mL ijskoud ethanol 70% dropwise aan de buis terwijl vortexing zachtjes.
  9. Incubeer gedurende 30 minuten op RT buizen en plaats de buizen bij 4 ° C gedurende 1 uur.
  10. Verwijder buizen van 4 ° C en centrifugeer bij 751 x g gedurende 5 min.
  11. Voeg toe 2 mL ijskoud 1 x PBS, vortex en centrifugeer bij 751 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant.
  12. Voeg 500 µL van 1 x PBS met propidium jodide (50 µg/mL) en ribonuclease een (200 µg/mL)
  13. Incubeer gedurende 30 min op RT terwijl de bescherming van de monsters van licht.
  14. Gegevens over stroom cytometer verwerven. Gebruik vooruit vs. kant scatter (FSC vs. SSC) te selecteren van de belangrijkste bevolking van cellen, met uitzondering van puin op de bodem verlaten hoek van de clusters van FSC vs. SSC dichtheid plot en cel aan de bovenkant naar boven-rechterkant van de FSC vs. SSC dichtheid plot.
  15. Gegevens voor de identificatie van cel populaties per fase van de celcyclus met juiste software analyseren.

6. Apoptosis assay

  1. Zaad 5 x 105 cellen voor elk monster in een kolf van T25 cm2 en uitvoeren van een transfectie volgens het protocol beschreven in sectie 1, stap 1-5.
  2. Na 24 uur en 48 uur, door de cellen te oogsten door trypsinebehandeling.
  3. De cel schorsingen overbrengen in 15 mL steriele buizen en labelen hen goed.
  4. Centrifugeer bij 751 x g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant.
  5. Voeg toe 2 mL ijskoud 1 x PBS, vortex en centrifugeer bij 751 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant.
  6. Herhaal de stap wassen met 1 x PBS om resterende media te verwijderen.
  7. Verdun 10 x Annexine V bindende buffer tot 1 x met ijskoude dH2O.
  8. 1 mL van de 1 x Annexine V bindende buffer toevoegen aan elke monsterbuisje en resuspendeer zachtjes.
  9. Plaats 96 µL van celsuspensie in een tube van 1,5 mL microcentrifuge.
  10. Voeg 1 µL van Annexine V-FITC-conjugaat en 12,5 µL van propidium jodide (PI) aan de buis met de celsuspensie.
  11. Incubeer de celsuspensie voor 10 min op ijs in het donker.
  12. Voeg 250 µL ijskoude 1 x Annexine V bindende buffer aan elke Monster buis om te verdunnen.
  13. Analyseren van monsters met stroom cytometer onmiddellijk.

7. eiwit expressie door microarray antilichaam-celcyclus

  1. Zaad 5 x 105 cellen voor elk monster in T25 cm2 kolven en uitvoeren van een transfectie volgens het protocol beschreven in sectie 1, stap 1-5.
  2. Na 24 uur en 48 uur, oogst cellen door trypsinebehandeling.
  3. Cel schorsingen overbrengen in 15 mL buizen en labelen hen dienovereenkomstig.
  4. Centrifugeer bij 751 x g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant.
  5. Voeg toe 2 mL ijskoud 1 x PBS, vortex en centrifugeer bij 751 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant.
  6. Herhaal de stap wassen met 1 x PBS.
  7. Voeg 150 µL van lysis buffer aangevuld met proteaseinhibitors. Pipetteer omhoog en omlaag zachtjes te verstoren de celmembranen.
  8. Uitvoeren om te voorkomen dat elke inmenging van lysis buffer, een buffer uitwisseling ter vervanging van de lysis-buffermengsel met labeling buffer, met behulp van de fabrikant oplosmiddel uitwisselen kolommen.
  9. Kwantificeren van de totale proteïne met een BCA-test.
  10. Neem 70 µg eiwitSteekproef en labeling buffer om een eindvolume van 75 µL toevoegen.
  11. Voeg 100 µL van dimethylformamide (DMF) tot 1 mg van biotine reagens (Biotine/DMF).
  12. 3 µL van de Biotine/DMF toevoegen aan elke eiwitSteekproef (biotinyleerd eiwitSteekproef) en incubeer gedurende 2 uur op RT.
  13. Voeg 35 µL stop reagens en meng door vortexing.
  14. Incubeer monsters op RT voor 30 min.
  15. De microarray dia's te verwijderen uit de koelkast zodat ze warm aan RT gedurende 1 uur vóór gebruik.
  16. Uitvoeren van niet-specifieke binding worden geblokkeerd door het broeden van de dia's met 3% droge melk oplossing (in blokkerende reagens geboden door fabrikant) in een petrischaal met continue schudden voor 45 min op RT.
  17. De dia's met ddH2O water wassen (tenzij anders aangegeven, wassen plaatsvindt met ddH2O).
  18. Herhaal de stap wassen ~ 10 x de blokkerende oplossing volledig te verwijderen uit de dia oppervlakken. Dit is belangrijk om een uniforme en lage achtergrond.
  19. Verwijderen van buitensporige water van de oppervlakken van de dia en ga naar de volgende stap zonder dat de dia's droog.
  20. Bereid koppeling oplossing door 3% droge melk in een koppeling reagens oplost.
  21. 6 mL van de oplossing van de koppeling en het volledige aantal van de eerder bereid biotinyleerd eiwitSteekproef uit stap 7.12 toevoegen.
  22. Plaats één dia in een put van de koppeling kamer geleverd door de leverancier en voeg ~ 6 mL eiwit mix koppelen aan het.
    Opmerking: Zorg ervoor dat de dia wordt volledig ondergedompeld in eiwit mix oplossing te koppelen.
  23. Bedek de koppeling kamer en incubeer gedurende 2 uur op RT met voortdurende agitatie in een roteerschudapparaat.
  24. De dia's overbrengen in een petrischaal en Voeg 30 mL 1 x wassen buffer. Plaats de petrischaal in roteerschudapparaat, schud gedurende 10 minuten en negeren de oplossing.
  25. Herhaal stap 7.24 2 x.
  26. Spoel de dia's met ddH2O water uitgebreid zoals beschreven in stappen 7.17 en 7.18 en gaat u verder met de volgende stap onmiddellijk om te voorkomen dat drogen.
  27. Voeg 30 µL van Cy3-streptavidine (0,5 mg/mL) in 30 mL detectie buffer.
  28. Plaats van de dia in een petrischaal en Voeg 30 mL detectie buffer met Cy3-daar.
  29. Incubeer in een roteerschudapparaat voor 20 min met continue schudden beschermd tegen licht.
    Opmerking: Cy-3 is een fluorescente kleurstof. Dek af met aluminiumfolie of opereren onder donkere omstandigheden te handhaven van de intensiteit van de fluorescentie.
  30. Stappen 7.24-7,26 en laat de dia met behulp van een zachte stroom van lucht of het plaatsen van de dia in een conische tube van 50 mL en centrifuge op 1300 x g gedurende 5-10 min. drogen.
  31. Plaats de dia in de dia houder en bedek met de aluminiumfolie.
  32. Scan de dia in een microarray scanner met de juiste excitatie en emissie golflengten. In het geval van Cy3, is de excitatie golflengte piek bij ~ 550 nm en uitstoot piek bij ~ 570 nm.
  33. Analyseren van de gegevens (Zie Tabel of Materials) voor software die wordt gebruikt).

8. RNA sequencing

  1. Zaad 5 x 105 cellen voor elk monster in T25 cm2 kolven en uitvoeren van een transfectie volgens het protocol beschreven in sectie 1, stap 1-5.
  2. Na 24 uur en 48 uur, door de cellen te oogsten door trypsinebehandeling.
  3. De cel schorsingen overbrengen in 15 mL buizen en labelen hen dienovereenkomstig.
  4. Uittreksel RNA volgens sectie 2, stap 1-6.
  5. Selectievakje RNA kwaliteit evenals de concentratie met een bioanalyzer. Een RNA-integriteit (RIN) score boven acht en passende histogrammen nodig zijn om te bevestigen RNA kwaliteit.
  6. Van de totale RNA, ~ 2 µg van het monster te gebruiken voor RNA sequencing (boodschapper-RNA van totale RNA)
  7. Volgorde met behulp van een volgende generatie sequencer11.
  8. Uitvoeren van kwaliteit trimmen en kaart met een referentie-genoom uit FASTQ bestanden gegenereerd op basis van het RNA sequencing machine11.
  9. FASTQ bestanden en ruwe Lees de graaf-gegevens uploaden naar genenbank, volgens de instructies van de < https://www.ncbi.nlm.nih.gov/> website.
    Opmerking: Zie toetreding nummer SRP133420 voor eerdere resultaten.

9. buis vorming assay

  1. Het beoordelen van het potentieel van de angiogenic van miRNA-transfected menselijke navelstreng ader endotheliale cellen (HUVECs) 36 h na transfectie, zoals beschreven in sectie 1, stap 1-5, cuvetten van HUVEC in plaats van A549 cellen.
  2. HUVECs met M199 honger media voor 4 uur bij 37 ° C met 5% CO2verhongeren.
  3. Verwijderen van verminderde groeifactor kelder membraan matrix uit-80 ° C en bewaren bij 4 ° C's nachts, waardoor geleidelijk ontdooien om te voorkomen dat de zeepbel vorming en polymerisatie.
  4. Zorgvuldig en langzaam jas wells van een 96 goed plaat met 0,04 mL van verminderde groeifactor kelder membraan matrix, het vermijden van de vorming van de zeepbel. De hele procedure onder de motorkap van een laminaire flow uitvoeren.
  5. Vullen aangrenzend putjes van de 96 goed plaat met 0,1 mL PBS te handhaven van vochtigheid en temperatuur behouden.
  6. Incubeer de 96 goed plaat bij 37 ° C gedurende ten minste 20 minuten staan zodat de polymerisatie van kelder membraan extract wordt bereikt. Niet Incubeer gedurende meer dan 1 h.
  7. Trypsinize transfected HUVECs uit elke groep en resuspendeer in middellange M199 met een concentratie van 1 x 105 cellen/mL.
  8. Voeg 0,1 mL elke celsuspensie de putjes met gepolymeriseerde kelder membraan matrix in de 96 goed plaat.
  9. Incubeer de 96 goed plaat bij 37 ° C met 5% CO2 terwijl de voorbereiding van de factoren die de groei plaatsvindt. Voorbereiding van groeifactoren vindt ook plaats onder de motorkap laminaire flow.
  10. Reconstrueren van groeifactoren (VEGF) in 2 x de gewenste eindconcentratie (4 ng/mL concentratie voor de definitieve concentratie van 2 ng/mL) en 0,1 mL van groeifactor-bevattende M199 honger medium op de top van de 0,1 mL van M199 honger medium met de cellen toe te voegen. Voeg voor niet-VEGF-behandelde putten, 0,1 mL van M199 honger medium op de top van de 0,1 mL van M199 honger medium met de cellen.
  11. Incubeer de 96 goed plaat voor 6 uur bij 37 ° C met 5% CO2.
  12. Aan het eind van de incubatietijd, krijgen beelden van elk putje met 4 x vergroting, met behulp van een helderveld Microscoop verbonden met een digitale camera.
  13. Verwerken van afbeeldingen met software uitgerust met een "angiogenese analyzer" plug-in19. Gebruik drie parameters, het aantal knooppunten, aantal kruispunten en de lengte van de totale stronk, om te vergelijken de effecten van miRNA behandeling op angiogenese.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gen expressie analyse met behulp van RT-qPCR en gel elektroforese

Differentiële gen expressie analyse met behulp van RT-qPCR aangetoond aanzienlijke Downregulatie van de gerichte genen, CDK1, CDK4 en CDK6. CDK1 en CDK4/6 werden aangetoond dienstig zijn voor de G2/M en G1/S overgangen, respectievelijk. De uitgevoerde analyse toegestaan directe vergelijking tussen individuele miRs en combinatorische miR activiteit...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

miRNAs kan functioneren als gerichte therapieën voor de behandeling van kanker, herkennen de disregulatie van expressie niveaus in zieke vs. normale weefsels. Deze studie gericht op het bepalen van de miRNAs die potentieel celcyclus tijdens meerdere fasen stoppen. Het werd ontdekt dat miR-143 en miR-506 de celcyclus van kankercellen, en de voorgestelde protocollen gericht op het begrijpen van de activiteit van deze combinatorische miRNA behandeling stoppen.

De beschreven methoden geven een ove...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs wil John Caskey aan Louisiana State University voor zijn hulp bij de analyse van het traject van de RNA sequencing gegevens, en de Universiteit van Texas Southwestern Medical Center, McDermott Center Next Generation Sequencing kern voor het uitvoeren van de RNA sequencing en data-analyse. Dit onderzoek werd gesteund door het College of Pharmacy, Universiteit van Louisiana Monroe start-up financiering en de National Institutes of Health (NIH) via het nationale Instituut van algemene medische wetenschap subsidies 5 P20 GM103424-15, 3 P20 GM103424-15S1.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geen belangenconflicten worden gedeclareerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
-80 °C FreezerVWRVWR40086A
96 well plateCELLTREAT Scientific 50-607-511
96-well Microwell Plates  Thermo Scientific12-556-008
A549 Non Small Cell Lung Cancer CellsATCCATCC CCL-185
AgaroseVWR0710-25G
Agilent 2100 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2938c
Ambion Silencer Negative Control No. 1 siRNAAmbionAM4611
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x)Gibco15240-062  
Antibody Array Assay Kit, 2 ReactionsFull Moon BioKAS02
Bright field microscope  Microscoptics IV-900
Bright field microscope  New Star Environment LLC
Cell Cycle Antibody Array, 2 SlidesFull Moon BioACC058
Cell Logic+ Biosafety CabinateLabconco342391100
Cellquest ProBD bioscienceSteps 5.14; 6.13: Used for calculating the population distrubution according to the cell cycle  phase and for  calculating the population distribution for the analysis of apoptosis 
CFX96 Real Time SystemBioRadCFX96 Optics Module
Chemidoc Touch Imaging SystemBioRadChemidoc Touch Imaging System
CO2 IncubatorThermo ScientificHERAcell 150i
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane MatrixTrevigen3433-010-01
Digital CameraAmScope FMA050
DMEM 4.5 g/L Glucose, w/out Sodium Pyruvate, w/ L-GlutamineVWRVWRL0100-0500
DNAse IZymo ResearchE1010
Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS)BD Biosciences356006
Eppendorf Pipette Pick-A-Pack SetsEppendrof05-403-152
Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, Fisher BioReagentsBP2818500
Ethidium bromideAlfa acarL07462
F-12K Nutrient Mixture (Kaighn's Mod.) with L-glutamine, CorningCorning45000-354
FACS Calibur FlowcytometerBecton Dickinson
Fetal Bovine Serum - PremiumAntlanta BiologicalsS11150
Fetal Bovine Serum (FBS)Fisher Scientific10438026
Fisherbrand Basix Microcentrifuge Tubes with Standard Snap CapsFisherbrand Basix02-682-002
Forma Series II water Jacket CO2 incubatorThermo Scientific
Heparin Solution (5000 U/mL)HospiraNDC#63739-920-11
Horixontal Electrophoresis systemBenchtop lab systemBT102
hsa-miR-143-3p miRNA MimicABMMCH01315
hsa-miR-506-3p miRNA MimicABMMCH02824
Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)Thermo ScientificPHC9394  
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)Individual donorsIRB# A15-3891
HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS)Fisher ScientificSH30256FS
Ingenuity Pathway AnalysisQiagenResults: Used for bioinformatics pathway analysis
Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free Distilled WaterInvitrogen10-977-015
Lipofectamine 2000 Invitrogen11-668-027
Loading dye 10Xward's science+470024-814
Medium M199 (with Earle′s salts, L-glutamine and sodium bicarbonate)Sigma AldrichM4530
Microscope Digital CameraAmScope MU130
Modfit LTVerity SoftwareStep 5.15: Alternative software for analysis of cell cycle population distributions
NanodropThermo ScientificNanoDrop one C
Opti-MEMGibco by life technologies31985-070
Penicillin-streptomycin 10/10Antlanta BiologicalsB21210
Power UP sybr green master mixApplied BiosystemsA25780
Propidium IodideMP Biochemicals LLCIC19545825
Proscanarray HT Microarray scannerPerkin elmerASCNPHRG. We used excitation laser wavelength at 543 nm.
q PCR optical adhesive coverApplied Biosystems4360954
Quick-RNA KitsZymo ResearchR1055
Ribonuclease A from Bovine pancreasSigmaR6513-50MG
ScanArray ExpressPerkinElmerStep 7.33: Microarray analysis software
ShakerThermo Scientific2314
SimpliAmp Thermal CyclerApplied Biosystems
SpectraTube Centrifuge Tubes 15mlVWR470224-998
SpectraTube Centrifuge Tubes 50mlVWR470225-004
TBS Buffer, 20x liquidVWR10791-796
Temperature controlled  centrifuge matchineThermo ScientificST16R
Temperature controlled micro centrifuge matchineEppendrof5415R
Thermo Scientific BioLite Cell Culture Treated FlasksThermo Scientific12-556-009
Thermo Scientific Pierce BCA Protein AssayThermo ScientificPI23225
Thermo Scientific Pierce RIPA BufferThermo ScientificPI89900
Thermo Scientific Thermo-Fast 96-Well Full-Skirted PlatesThermo ScientificAB0800WL
Thermo Scientific Verso cDNA

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schafer, K. A. The cell cycle: a review. Veternary Pathology. 35 (6), 461-478 (1998).
  2. Barnum, K. J., O'Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
  3. Malumbres, M., Barbacid, M. Cell cycle, CDKs and cancer: a changing paradigm. Nature Reviews Cancer. 9 (3), 153-166 (2009).
  4. Chen, Z., et al. Multiple CDK inhibitor dinaciclib suppresses neuroblastoma growth via inhibiting CDK2 and CDK9 activity. Science Repository. 6, 29090(2016).
  5. Brown, N. R., et al. CDK1 structures reveal conserved and unique features of the essential cell cycle CDK. Nature Communications. 6, 6769(2015).
  6. Sanchez-Martinez, C., Gelbert, L. M., Lallena, M. J., de Dios, A. Cyclin dependent kinase (CDK) inhibitors as anticancer drugs. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (17), 3420-3435 (2015).
  7. Shah, A., et al. FDA Approval: Ribociclib for the Treatment of Postmenopausal Women with Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Advanced or Metastatic Breast Cancer. Clinical Cancer Research. , (2018).
  8. Asghar, U., Witkiewicz, A. K., Turner, N. C., Knudsen, E. S. The history and future of targeting cyclin-dependent kinases in cancer therapy. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (2), 130-146 (2015).
  9. Mullard, A. FDA approves Novartis's CDK4/6 inhibitor. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (4), 229(2017).
  10. Walker, A. J., et al. FDA Approval of Palbociclib in Combination with Fulvestrant for the Treatment of Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Metastatic Breast Cancer. Clinical Cancer Research. 22 (20), 4968-4972 (2016).
  11. Hossian, A., Sajib, M. S., Tullar, P. E., Mikelis, C. M., Mattheolabakis, G. Multipronged activity of combinatorial miR-143 and miR-506 inhibits Lung Cancer cell cycle progression and angiogenesis in vitro. Science Repository. 8 (1), 10495(2018).
  12. Inamura, K., Ishikawa, Y. MicroRNA In Lung Cancer: Novel Biomarkers and Potential Tools for Treatment. Journal of Clinical Medicine. 5 (3), (2016).
  13. Mizuno, K., et al. The microRNA expression signature of small cell lung cancer: tumor suppressors of miR-27a-5p and miR-34b-3p and their targeted oncogenes. Journal of Human Genetics. 62 (7), 671-678 (2017).
  14. Zhang, B., Pan, X., Cobb, G. P., Anderson, T. A. microRNAs as oncogenes and tumor suppressors. Developmental Biology. 302 (1), 1-12 (2007).
  15. Peng, Y., Croce, C. M. The role of MicroRNAs in human cancer. Signal Transduction and Targeted Therapy. 1, 15004(2016).
  16. Wang, X., et al. Prediction of recurrence in early stage non-small cell lung cancer using computer extracted nuclear features from digital H&E images. Science Repository. 7 (1), 13543(2017).
  17. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).
  18. Saxon, J. A., et al. p52 expression enhances lung cancer progression. Science Repository. 8 (1), 6078(2018).
  19. Carpentier, G. Angiogenesis Analyzer for ImageJ. ImageJ User and Developer Conference. , (2012).
  20. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
  21. Robinson, M. D., Oshlack, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology. 11 (3), R25(2010).
  22. DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments. (91), e51312(2014).
  23. Kong, D. H., Kim, M. R., Jang, J. H., Na, H. J., Lee, S. A Review of Anti-Angiogenic Targets for Monoclonal Antibody Cancer Therapy. International Journal of Molecular Science. 18 (8), (2017).
  24. Wong, P. P., Bodrug, N., Hodivala-Dilke, K. M. Exploring Novel Methods for Modulating Tumor Blood Vessels in Cancer Treatment. Current Biology. 26 (21), R1161-R1166 (2016).
  25. Evan, G. I., Brown, L., Whyte, M., Harrington, E. Apoptosis and the cell cycle. Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 825-834 (1995).
  26. Haab, B. B., Dunham, M. J., Brown, P. O. Protein microarrays for highly parallel detection and quantitation of specific proteins and antibodies in complex solutions. Genome Biology. 2 (2), RESEARCH0004(2001).
  27. Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. Overview of protein microarrays. Currrent Protocols in Protein Science. 27, Chapter 27, Unit 27 21(2013).
  28. St-Pierre, C., et al. Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells. Science Repository. 3, 1860(2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis
Posted by JoVE Editors on 4/26/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis.  An author name was updated.

One of the authors' names was corrected from:

George Matthaiolampakis

to:

George Mattheolabakis

Trefwoorden

miRNA behandelingcelcyclusregulatieangiogeneseremminglongkankercellengenexpressieanalyseflowcytometrieqPCR analyseRNA extractietransfectieprotocolmicroarray analyse

Gerelateerde artikelen