miRNA therapeutics hebben aanzienlijke potentieel bij het reguleren van de progressie van kanker. Hier gedemonstreerd worden analytische benaderingen gebruikt voor de identificatie van de activiteit van een combinatorische miRNA behandeling in het stoppen van de celcyclus en angiogenese.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Analyse van combinatoriële miRNA behandelingen te reguleren celcyclus en angiogenese
In dit artikel
Erratum-melding
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Samenvatting
Samenvatting
Longkanker (LC) is de belangrijkste oorzaak van kanker sterfgevallen wereldwijd. Gelijkaardig aan andere kankercellen, een fundamenteel kenmerk van LC cellen is ongereguleerde proliferatie en celdeling. Remming van de proliferatie door stopzetting van de celcyclus is aangetoond dat een veelbelovende benadering voor de behandeling van kanker, met inbegrip van LC.
miRNA therapeutics opgedoken als belangrijk post-transcriptional gene regelgevers en worden steeds bestudeerd voor gebruik in de behandeling van kanker. In recente werk gebruikt wij twee miRNAs, miR-143 en miR-506, voor het regelen van de celcyclus. A549 niet-kleincellige longkanker (NKCLK) kankercellen waren transfected, gen expressie veranderingen werden geanalyseerd en apoptotic activiteit als gevolg van de behandeling was ten slotte geanalyseerd. Downregulatie van cycline-afhankelijk kinases (CDKs) werden gedetecteerd (dat wil zeggen, CDK1, CDK4 en CDK6) en celcyclus halt bij de G1/S en G2/M fase-overgangen. Analyse van het traject aangegeven potentiële antiangiogenic activiteit van de behandeling, dat de aanpak met veelzijdige activiteit schenkt. Hier beschreven zijn de methoden voor het identificeren van miRNA activiteit met betrekking tot de celcyclus remming, inductie van apoptosis en effecten van behandeling op de endotheliale cellen door remming van angiogenese. Gehoopt wordt dat de hier gepresenteerde methoden toekomstig onderzoek op miRNA therapeutics en overeenkomstige activiteit steunen zullen en dat de representatieve gegevens andere onderzoekers tijdens de experimentele analyses begeleiden zal.
Inleiding
De celcyclus is een combinatie van meerdere regelgevende gebeurtenissen waarmee verdubbeling van DNA en cel proliferatie door middel van de mitotische proces1. Cycline-afhankelijk kinases (CDKs) regelen en bevorderen van de celcyclus2. Onder hen hebben de mitotische CDK (CDK1) en de interfase CDKs (CDK2, CDK4 en CDK6) een sleutelrol in de celcyclus progressie3. Eiwit Retinoblastoom (Rb) is door de CDK4/CDK6 complex dat celcyclus progressie4phosphorylated, en CDK1 activering is essentieel voor succesvolle celdeling5. Talrijke CDK-remmers zijn ontwikke....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. miR-143 en miR-506 transfectie
Let op: Gebruik latex handschoenen, beschermende brillen en een laboratorium jas tijdens het uitvoeren van de beschreven experimenten. Indien nodig, gebruik de bioveiligheid kabinet met het kabinet ventilator op, zonder het blokkeren van de luchtwegen of verstoren van de laminaire luchtstroming. Altijd ingesteld de beschermende glazen raam op de juiste hoogte, zoals beschreven door de fabrikant.
- Zaad NKCLK A549 cellen in een T25 cm2 kolf/6/96 goed plaat in DMEM/F12K media aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine (voedingsbodems) in de kap van een weefselkweek en na een nach....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Gen expressie analyse met behulp van RT-qPCR en gel elektroforese
Differentiële gen expressie analyse met behulp van RT-qPCR aangetoond aanzienlijke Downregulatie van de gerichte genen, CDK1, CDK4 en CDK6. CDK1 en CDK4/6 werden aangetoond dienstig zijn voor de G2/M en G1/S overgangen, respectievelijk. De uitgevoerde analyse toegestaan directe vergelijking tussen individuele miRs en combinatorische miR activiteit.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
miRNAs kan functioneren als gerichte therapieën voor de behandeling van kanker, herkennen de disregulatie van expressie niveaus in zieke vs. normale weefsels. Deze studie gericht op het bepalen van de miRNAs die potentieel celcyclus tijdens meerdere fasen stoppen. Het werd ontdekt dat miR-143 en miR-506 de celcyclus van kankercellen, en de voorgestelde protocollen gericht op het begrijpen van de activiteit van deze combinatorische miRNA behandeling stoppen.
De beschreven methoden geven een ove.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs wil John Caskey aan Louisiana State University voor zijn hulp bij de analyse van het traject van de RNA sequencing gegevens, en de Universiteit van Texas Southwestern Medical Center, McDermott Center Next Generation Sequencing kern voor het uitvoeren van de RNA sequencing en data-analyse. Dit onderzoek werd gesteund door het College of Pharmacy, Universiteit van Louisiana Monroe start-up financiering en de National Institutes of Health (NIH) via het nationale Instituut van algemene medische wetenschap subsidies 5 P20 GM103424-15, 3 P20 GM103424-15S1.
Dankbetuigingen
Geen belangenconflicten worden gedeclareerd.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
```html
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| -80 °C Freezer | VWR | VWR40086A | |
| 96 well plate | CELLTREAT Scientific | 50-607-511 | |
| 96-well Microwell Plates | Thermo Scientific | 12-556-008 | |
| A549 Non Small Cell Lung Cancer Cells | ATCC | ATCC CCL-185 | |
| Agarose | VWR | 0710-25G | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938c | |
| Ambion Silencer Negative Control No. 1 siRNA | Ambion | AM4611 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) | Gibco | 15240-062 | |
| Antibody Array Assay Kit, 2 Reactions | Full Moon Bio | KAS02 | |
| Bright field microscope | Microscoptics | IV-900 | |
| Bright field microscope | New Star Environment LLC | ||
| Cell Cycle Antibody Array, 2 Slides | Full Moon Bio | ACC058 | |
| Cell Logic+ Biosafety Cabinate | Labconco | 342391100 | |
| Cellquest Pro | BD bioscience | Steps 5.14; 6.13: Used for calculating the population distrubution according to the cell cycle phase and for calculating the population distribution for the analysis of apoptosis | |
| CFX96 Real Time System | BioRad | CFX96 Optics Module | |
| Chemidoc Touch Imaging System | BioRad | Chemidoc Touch Imaging System | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | HERAcell 150i | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Trevigen | 3433-010-01 | |
| Digital Camera | AmScope | FMA050 | |
| DMEM 4.5 g/L Glucose, w/out Sodium Pyruvate, w/ L-Glutamine | VWR | VWRL0100-0500 | |
| DNAse I | Zymo Research | E1010 | |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | BD Biosciences | 356006 | |
| Eppendorf Pipette Pick-A-Pack Sets | Eppendrof | 05-403-152 | |
| Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, | Fisher BioReagents | BP2818500 | |
| Ethidium bromide | Alfa acar | L07462 | |
| F-12K Nutrient Mixture (Kaighn's Mod.) with L-glutamine, Corning | Corning | 45000-354 | |
| FACS Calibur Flowcytometer | Becton Dickinson | ||
| Fetal Bovine Serum - Premium | Antlanta Biologicals | S11150 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | 10438026 | |
| Fisherbrand Basix Microcentrifuge Tubes with Standard Snap Caps | Fisherbrand Basix | 02-682-002 | |
| Forma Series II water Jacket CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| Heparin Solution (5000 U/mL) | Hospira | NDC#63739-920-11 | |
| Horixontal Electrophoresis system | Benchtop lab system | BT102 | |
| hsa-miR-143-3p miRNA Mimic | ABM | MCH01315 | |
| hsa-miR-506-3p miRNA Mimic | ABM | MCH02824 | |
| Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) | Thermo Scientific | PHC9394 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Individual donors | IRB# A15-3891 | |
| HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | SH30256FS | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | Results: Used for bioinformatics pathway analysis | |
| Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Invitrogen | 10-977-015 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11-668-027 | |
| Loading dye 10X | ward's science+ | 470024-814 | |
| Medium M199 (with Earle′s salts, L-glutamine and sodium bicarbonate) | Sigma Aldrich | M4530 | |
| Microscope Digital Camera | AmScope | MU130 | |
| Modfit LT | Verity Software | Step 5.15: Alternative software for analysis of cell cycle population distributions | |
| Nanodrop | Thermo Scientific | NanoDrop one C | |
| Opti-MEM | Gibco by life technologies | 31985-070 | |
| Penicillin-streptomycin 10/10 | Antlanta Biologicals | B21210 | |
| Power UP sybr green master mix | Applied Biosystems | A25780 | |
| Propidium Iodide | MP Biochemicals LLC | IC19545825 | |
| Proscanarray HT Microarray scanner | Perkin elmer | ASCNPHRG. We used excitation laser wavelength at 543 nm. | |
| q PCR optical adhesive cover | Applied Biosystems | 4360954 | |
| Quick-RNA Kits | Zymo Research | R1055 | |
| Ribonuclease A from Bovine pancreas | Sigma | R6513-50MG | |
| ScanArray Express | PerkinElmer | Step 7.33: Microarray analysis software | |
| Shaker | Thermo Scientific | 2314 | |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | ||
| SpectraTube Centrifuge Tubes 15ml | VWR | 470224-998 | |
| SpectraTube Centrifuge Tubes 50ml | VWR | 470225-004 | |
| TBS Buffer, 20x liquid | VWR | 10791-796 | |
| Temperature controlled centrifuge matchine | Thermo Scientific | ST16R | |
| Temperature controlled micro centrifuge matchine | Eppendrof | 5415R | |
| Thermo Scientific BioLite Cell Culture Treated Flasks | Thermo Scientific | 12-556-009 | |
| Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay | Thermo Scientific | PI23225 | |
| Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Thermo Scientific | PI89900 | |
| Thermo Scientific Thermo-Fast 96-Well Full-Skirted Plates | Thermo Scientific | AB0800WL | |
| Thermo Scientific Verso cDNA |
Referenties
- Schafer, K. A. The cell cycle: a review. Veternary Pathology. 35 (6), 461-478 (1998).
- Barnum, K. J., O'Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
- Malumbres, M., Barbacid, M.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Erratum
Formal Correction: Erratum: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis
Posted by JoVE Editors on 4/26/2019. Citeable Link.
An erratum was issued for: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis. An author name was updated.
One of the authors' names was corrected from:
George Matthaiolampakis
to:
George Mattheolabakis
