Het doel van dit protocol is om een nieuwe borstkanker modellerings aanpak te beschrijven op basis van de intraductale injectie van CRE-uitdrukken van adenovirus in muizen borstklieren. Deze aanpak maakt zowel cel-type-en orgaan-specifieke manipulatie van oncogene gebeurtenissen op een tijdelijk gecontroleerde manier mogelijk.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Het modelleren van borstkanker via een Intraductale injectie van CRE-uitdrukken van adenovirus in de muis borstklier
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Borstkanker is een heterogene ziekte, mogelijk als gevolg van complexe interacties tussen verschillende cellen van oorsprong en oncogene gebeurtenissen. Muismodellen zijn instrumentaal in het verkrijgen van inzicht in deze complexe processen. Hoewel er veel Muismodellen zijn ontwikkeld om bijdragen te bestuderen van verschillende oncogene voorvallen en cellen van oorsprong aan borst tumorigenese, zijn deze modellen vaak geen celtype of orgaan specifiek of kunnen ze de initiatie van borsttumor vorming niet induceren in een op een tijdelijk gecontroleerde manier. Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van een nieuw type borstkanker Muismodellen op basis van de intraductale injectie van CRE-uitdrukken van adenovirus (AD-CRE) in muis borstklieren (MGs). Als gevolg van de directe injectie van AD-CRE in de melk kanalen, deze aanpak is MG specifiek, zonder ongewenste kanker inductie in andere organen. De intraductale injectieprocedure kan worden uitgevoerd bij muizen in verschillende stadia van hun ontwikkeling van MG (dus, het maakt temporele controle van de inductie van kanker, vanaf ~ 3-4 weken leeftijd). De specificiteit van het celtype kan worden bereikt door verschillende cel-type-specifieke promoters te gebruiken om CRE-expressie in de adenovirale vector te stimuleren. We tonen aan dat luminal en basale borst cellen epitheel (MECs) nauw kunnen worden gericht op CRE/loxP-gebaseerde genetische manipulatie via een intraductale injectie van AD-CRE onder de controle van de keratine 8 of Keratin 5 promotor, respectievelijk. Door het opnemen van een voorwaardelijke CRE Reporter (bv, CRE/loxP-inducible Rosa26-YFP Reporter), laten we zien dat MECS gericht door AD-CRE, en tumorcellen afgeleid van hen, kan worden getraceerd door het volgen van de reporter-positieve cellen na intraductale injectie.
Inleiding
Het algemene doel van deze methode is het ontwikkelen van een nieuwe borstkanker Modeling aanpak op basis van een intraductale injectie van AD-CRE in de muis MG. De CRE/loxP recombinatie-gebaseerde genetische benadering is op grote schaal gebruikt voor het modelleren van menselijke borstkanker bij muizen. De eerste generatie van CRE/loxP-gebaseerde borstkanker Muismodellen worden gegenereerd door het gebruik van CRE-uitdrukken transgene muizen onder controle van MEC-specifieke promoters (bijv. Mmtv-CRE voor Luminale MECS en een deel van de basale Mecs, WAP-CRE en Blg-CRE voor Luminale voor ouders en alveolaire Luminale Mecs, K14-CRE voor basaal en een deel van luminal MECS1,2,3,4,5)6, 7 , 8 , 9. Hoewel deze CRE-transgene lijnen ruimtelijke controle van CRE-expressie mogelijk maken (d.w.z. in verschillende deelverzamelingen van MECS), staan zij de temporele controle van CRE-expressie en CRE/loxp-gemedieerde genetische manipulatie echter niet toe. De tweede generatie van CRE/loxp-gebaseerde borstkanker Muismodellen maken gebruik van induceerbare cytochromen CRE activiteit/expressie benaderingen (bijvoorbeeld, gebruik van CRE-oestrogeen receptor fusie [creer], die kan alleen induceren CRE/loxp recombinatie bij toediening van Tamoxifen), en Als gevolg hiervan maken deze genetische hulpmiddelen zowel ruimtelijke als temporele controles mogelijk van de activering van oncogene gebeurtenissen in MECS (bijv. K8-creer-en K5-creer-gebaseerde modellen) 10,11,12 . In beide generaties borstkanker muizen modellen, als promotors gebruikt om CRE of CreER uitdrukking (bijvoorbeeld, Krt8, Krt5) ook actief in epitheelcellen van andere organen (dat wil zeggen, ze zijn cel-type-specifieke maar niet orgaan-specifieke) of een ledende uitdrukking hebben in andere celtypen dan epitheelcellen (bijv. Mmtv, die ledende activiteit heeft in beenmerg hematopoietische cellen), kunnen deze benaderingen leiden tot de ontwikkeling van ongewenste kanker (s) in ander orgaan (en). Als deze onverwachte kankers veroorzaken letaliteit in de aangetaste muizen, het oorspronkelijke doel van het modelleren van borstkanker in deze muizen kan worden verboden (bv, Mmtv-CRE-driven oncogene gebeurtenissen kunnen leiden tot hematopoietische maligniteiten en vroegtijdige dood van de muizen , als gevolg van lektigheid van de promotor Mmtv in hematopoietische cellen)4.
Hier rapporteren we een borstkanker modellerings benadering bij muizen die zowel celtype-als orgaan-specifieke manipulatie van oncogene gebeurtenissen op een temporeel gecontroleerde manier mogelijk maakt. Deze aanpak is gebaseerd op een intraductale injectie van AD-CRE in MGs voor muizen (en is dus orgaan-specifiek). CRE-expressie kan worden bestuurd door gebruik te maken van verschillende MEC subpopulation-specifieke promoters die zijn ingebed in de adenovirale vector (bijv. Krt8 voor Luminale Mecs, Krt5 voor basale Mecs, waardoor de specificiteit van het celtype wordt bereikt). Kanker inductie in MGs kan tijdelijk worden gecontroleerd door een injectie van AD-CRE in muizen op verschillende leeftijden, beginnend vanaf 3-4 weken leeftijd (puberale) tot het volwassen stadium.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van Brigham en het vrouwen ziekenhuis.
1. opwekking en onderhoud van floxed muizen
- Borstkanker-relevante floxed voorwaardelijke Knockout verkrijgen (bijv. Trp53tm1Brn [aangeduid als Trp53L/l], Brca1tm1Aash [Brca1l/l]) of voorwaardelijke muis lijnen (bijv. Gt (Rosa) 26SorTm1 (PIK3CA * H1047R) Egan) uit het Jackson Laboratory (JAX) of de NCI Mouse-modellen van de repository van Human Cancer Consortium (MMHCC). Ter vergemakkelijking van het achtervolgen van MECs die CRE-gemedieerde recombinatie ondergaan, kan ook een voorwaardelijke CRE-reporter lijn worden verkregen van JAX (bijv. gt (Rosa) 26SorTM1 (Eyfp) cos [genoemd R26Y]).
- RAS Trp53L/l homozygoot muizen met R26Y homozygoot reporter muizen of met homozygoot muizen die de R26Y reporter allelen dragen en eventuele extra floxed voorwaardelijke knock-out of knock-in allelen voor verschillende Muismodellen, om heterozygoot F1 mannelijke en vrouwelijke nakomelingen te verkrijgen.
- Intercross heterozygoot F1 mannelijke en vrouwelijke muizen om F2 samengestelde vrouwelijke muizen te verkrijgen die homozygoot zijn voor elk allel (als experimentele muizen), evenals R26Y-alleen homozygoot vrouwtjes (als controle muizen). Genotype F2-muizen op basis van de hieronder vermelde PCR-primers en-fiets condities, door twee standaard PCR-reacties van 20 μL (met gebruik van Taq 5X Master Mix) in twee verschillende PCR-buizen, één met de R26Y primers en de andere met de Trp53L primers. Gebruik volwassen muizen (meestal ongeveer 2 – 4 maanden oud) voor alle kweek.
- Voer voor R26YPCR bij 94 °c gedurende 3 minuten, daarna bij 94 °c gedurende 30 sec., 60 °c gedurende 30 sec. en 72 °c gedurende 1 minuut voor 35 cycli, gevolgd door 72 °c gedurende 3 minuten en bij 14 °c. Gebruik primers (i) R26YFP-1: AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT; (II) R26YFP-2: GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC; (III) R26YFP-3: GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG.
Opmerking: een enkele PCR-band van 250 BP duidt op een R26Y homozygote, een enkele PCR-band van 500 BP duidt op een wild type (WT) en twee PCR-bands (R26Y: 250 bp, WT: 500 BP) duiden op een R26Y heterozygote (Figuur 1a).
Voer voor Trp53LPCR bij 94 °c gedurende 3 minuten, daarna bij 94 °c gedurende 30 sec., 60 °c gedurende 30 sec. en 72 °c gedurende 1 minuut voor 35 cycli, gevolgd door 72 °c gedurende 3 minuten en bij 14 °c. Gebruik primers (i) p53F2-10 1F: CAC AAA AAC AGG TTA AAC CCA G; (II) p53F2-10 1R: AGC ACA TAG GAG GCA GAG AC.
Opmerking: een enkele PCR-band van 370 BP duidt op een Trp53L/l homozygote, een enkele PCR-band van 288 bp duidt op een Trp53+/+ WT, en twee PCR-banden (WT: 288 BP, Trp53L: 370 BP) duiden op een Trp53L /+ heterozygote (Figuur 1b).
- Voer voor R26YPCR bij 94 °c gedurende 3 minuten, daarna bij 94 °c gedurende 30 sec., 60 °c gedurende 30 sec. en 72 °c gedurende 1 minuut voor 35 cycli, gevolgd door 72 °c gedurende 3 minuten en bij 14 °c. Gebruik primers (i) R26YFP-1: AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT; (II) R26YFP-2: GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC; (III) R26YFP-3: GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG.
2. preoperatieve voorbereiding
- Autoclaaf alle chirurgische hulpmiddelen 1 dag voor de operatie.
- Bereid 0,1% broomfenolblauw in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en bewaar het op 4 °c. Verdun de AD-CRE die zal worden gebruikt voor de intraductale injectie in DMEM medium met 0,01 M CACL2 en broomfenolblauw in een verhouding van 1:10 (d.w.z. het injectie mengsel).
Opmerking: de AD-CRE hier gebruikt werd verkregen van de Universiteit van Iowa virale vector kern, met een voorraad virale titer van ~ 1010– 1011 Pfu/ml. - Anesthetiseer de vrouwelijke muis (F2-generatie zoals beschreven in stap 1,2, leeftijd variërend van 3 – 4 weken leeftijd tot volwassen) met behulp van een Isofluraan kamer en breng oogzalf. Tijdens de procedure, anesthetiseer de muis continu door ervoor te zorgen dat het inhaleert 1% – 2.5% Isofluraan in zuurstof. Controleer de diepte van de anesthesie ten minste elke 15 min door het uitvoeren van een teen knijpen. Bewaak de muis zorgvuldig voor elke verandering in de ademhalingsfrequentie, waarbij het niveau van Isofluraan dienovereenkomstig wordt aangepast, indien nodig.
- Injecteer Meloxicam als analgesie subcutaan in een dosis van 5 mg/kg, voorafgaand aan de chirurgische ingreep.
- Bloot de tepel operatie site door het toepassen van verschillende druppels ontharing crème; Verwijder overmatige room en losse haren met zachte papieren handdoeken.
Opmerking: Voer deze stap uit in een gebied dat losstaat van de plaats waar de operatie moet worden uitgevoerd. Scheren wordt niet aanbevolen om beschadiging van de tepels te voorkomen. Wees voorzichtig met het verwijderen van chemische ontharings agent op een tijdige manier. Als u de agent te lang laat staan, kan dit leiden tot chemische verbranding op de huid - Desinfecteer de operatieplaats met iodophors eerst, gevolgd door 70% alcohol, en eindig met een definitieve toepassing van scrubiodophors. Doe dit in een cirkelvormige beweging vanuit het midden van het werkgebied naar de omtrek met behulp van een gaas spons of met katoen getipt applicator. Herhaal de cyclus 3x – 4x.
3. intraductale injectie
- Gebruik aseptische technieken gedurende de chirurgische ingreep.
- Maak een incisieplaats op de huid met een lengte van ~ 1 cm tussen de twee vierde inguinale MGs (Figuur 2). Scheid voorzichtig de huid flap (met de MG) van het pariëtale peritoneum om de borst boom te visualiseren.
- Houd de tepel voorzichtig vast met de Tang van de horlogemaker en verwijder de uitwendige tepel zonder de huid in de buurt te snijden, met behulp van een micro-dissectie schaar.
- Laad ~ 3 – 5 μL AD-CRE injectie mengsel in een 25 μL Hamilton spuit met een 33 G metalen naaf naald aangebracht. Bereken het volume van het injectie mengsel in de spuit op basis van de blauwe kleurstof die in het mengsel is opgenomen.
Opmerking: gebruik een kleiner volume (bijv. 3 μL) bij het injecteren in Mg's van 3 – 4 weken oude vrouwtjes en een groter volume (bijv. 10 μL) bij het injecteren in MGs van zogende vrouwtjes. - Houd voorzichtig de rand van de huid flap met een fijn gebogen pincet en Injecteer het mengsel van AD-CRE injectie langzaam in de tepel, ondertussen het monitoren van de verspreiding van blauwe kleurstof in de borst ductaal boom. Houd de injectiesnelheid zo laag mogelijk om beschadiging van het ductale lumen te voorkomen.
Opmerking: geïnjecteerde vloeistof (zoals geïllustreerd door de meegeleverde Broom fenol blauwe kleurstof) die zich verspreidt over de gehele ductale boom zonder in het stromale compartiment te lekken, duidt op een geslaagde intraductale injectie. - Trek de naald voorzichtig uit de tepel om lekkage van de geïnjecteerde vloeistof te voorkomen.
- Onderzoek de distale zijde (d.w.z., weg van de tepel) van de MG of het omringende gebied van de geïnjecteerde tepel. Merk op dat zwelling blauwe kleurstof (dat wil zeggen, kleurstof verspreiden in de nabijgelegen stroma) duidt op een injectie van borstkanker vet pad in plaats van een succesvolle intraductale injectie.
- Sluit de chirurgische wonden (vanaf stap 3,2) in de huid met wond klemmen.
4. postoperatieve zorg
- Verwijder de muis van de anesthesie en plaats deze op een verwarmingskussen in een schone kooi voor herstel.
- Dien Meloxicam subcutaan toe bij 5 mg/kg, 24 uur na de operatie.
- Controleer de algemene omstandigheden van het dier en kijk naar tekenen van infectie op de incisie site gedurende 5 dagen.
- Wond clips worden verwijderd ~ 7-10 dagen na de operatie.
5. monitoring van de ontwikkeling van de borsttumor
- Bewaak de geïnjecteerde muizen tweemaal per week door palpatie voor elk teken van borstkanker ontwikkeling.
- Zodra de tumor voelbaar is, controleert u de muis dagelijks en meet u de grootte van de tumor totdat deze het experimentele eindpunt bereikt, zoals bepaald door de grootte (bijv. het bereiken van 10% – 15% van het lichaamsgewicht van de muis) of conditie (bijv., zweren of necrotic) van de tumor, of door de algemene gezondheidstoestand van de muis (bijv. Comatose, moribund).
- Euthanaseren de muis door koolzuurgas verstikking, gevolgd door een secundaire methode (bijv., cervicale dislocatie).
- Isoleer de borstkanker weefsels en analyseer ze door Flowcytometrie, immunofluorescentie of expressie profilering (bijv. door RNA-sequencing [RNAseq] of Microarray), zoals eerder beschreven12.
- Voer Flow cytometrische analyse door gating voor Lineage-negatieve cellen (Lin-: negatief voor Lineage markers CD45 [leukocyten marker], CD31 [endotheliale celmarker] en TER119 [erytrocyten marker]) en analyseer de cellen in de tumor op basis van hun expressie van YFP, CD24 en CD29.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Representatieve PCR-genotype resultaten voor de R26Y en Trp53L allelen worden weergegeven in Figuur 1.
Hoewel, in principe, alle 10 MGs kunnen worden onderworpen aan de intraductale injectieprocedure, praktisch, de twee vierde inguinale MGs zijn meestal geselecteerd voor injectie, als gevolg van hun gemakkelijkere toegankelijkheid en grotere MG maten (
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het succes van deze aanpak voor het induceren van borsttumoren van verschillende subpopulaties van MECs berust niet alleen op het kiezen van geschikte Cell-Type-specifieke promoters (om CRE-expressie te stimuleren), maar ook op de intraductale injectieprocedure zelf. Het idee achter deze aanpak is dat de geïnjecteerde AD-CRE virussen worden bewaard in de ductale boom, die een verborgen structuur met lumen, en daarom, alleen MECs worden blootgesteld aan de virussen en zijn geïnfecteerd door AD-CRE. Vanwege de geringe lume...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesteund door National Institutes of Health (NIH) Grant R01 CA222560 en door Department of Defense baanbrekende Award W81XWH-18-1-0037.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 33-gauge naald | Hamilton | 7803-05 | point style 3 blunt |
| 7mm Reflex Clip | Braintree Scientific | RF7 CS | |
| Adenovirus, Ad-K5-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547) | |
| Adenovirus, Ad-K8-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5mK8-nlsCre | |
| Alcohol | Fisher | HC800-1GAL | Bereid tot 70% in gebruik |
| gebiotinyleerd CD31 | eBiosciences | 13-0311-85 | |
| gebiotinyleerd CD45 | eBiosciences | 13-0451-85 | |
| gebiotinyleerd TER119 | eBiosciences | 13-5921-85 | |
| Bromofenol Blauw | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| CD24-AF-700 | BD Pharmingen | 564237 | |
| CD24-PE | eBiosciences | 12-0242-83 | |
| CD29-APC | eBiosciences | 17-0291-82 | |
| CD29-PE | eBiosciences | 12-0291-82 | |
| Haarverwijderingslotion | Nair | 9 Oz | |
| Hamilton-spuit | Hamilton | 7636-01 | 0,025 mL |
| Jodoforen | Betadine | 10% Povidone-jodium | |
| Isofluran | Baxter | NDC 10019-360-40 | 1-2,5% |
| Loxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | 5 mg/ml |
| Smeersel voor ogen | Akorn | NDC 17478-062-35 | |
| Micro-dissectie schaar | Pentair | 9M | Uurwerkerstangen |
| Micro-dissectie pincet | Dumont | M5 | |
| Taq 5X Master Mix | New England Biolabs | M0285L |
Referenties
- Wagner, K. U., et al. Cre-mediated gene deletion in the mammary gland. Nucleic Acids Research. 25 (21), 4323-4330 (1997).
- Selbert, S., et al. Efficient BLG-Cre mediated gene deletion in the mammary gland. Transgenic Research. 7 (5), 387-396 (1998).
- Jonkers, J., et al. Synergistic tumor suppressor activity of BRCA2 and p53 in a conditional mouse model for breast cancer. Nature Genetics. 29 (4), 418-425 (2001).
- van Bragt, M. P., Hu, X., Xie, Y., Li, Z. RUNX1, a transcription factor mutated in breast cancer, controls the fate of ER-positive mammary luminal cells. eLife. 3, e03881(2014).
- Tao, L., van Bragt, M. P., Li, Z. A Long-Lived Luminal Subpopulation Enriched with Alveolar Progenitors Serves as Cellular Origin of Heterogeneous Mammary Tumors. Stem Cell Reports. 5 (1), 60-74 (2015).
- Xu, X., et al. Conditional mutation of Brca1 in mammary epithelial cells results in blunted ductal morphogenesis and tumour formation. Nature Genetics. 22 (1), 37-43 (1999).
- Li, Z., et al. ETV6-NTRK3 fusion oncogene initiates breast cancer from committed mammary progenitors via activation of AP1 complex. Cancer Cell. 12 (6), 542-558 (2007).
- Liu, X., et al. Somatic loss of BRCA1 and p53 in mice induces mammary tumors with features of human BRCA1-mutated basal-like breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (29), 12111-12116 (2007).
- Molyneux, G., et al. BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells. Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).
- Koren, S., et al. PIK3CA induces multipotency and multi-lineage mammary tumours. Nature. 525 (7567), 114-118 (2015).
- Van Keymeulen, A., et al. Reactivation of multipotency by oncogenic PIK3CA induces breast tumour heterogeneity. Nature. 525 (7567), 119-123 (2015).
- Tao, L., Xiang, D., Xie, Y., Bronson, R. T., Li, Z. Induced p53 loss in mouse luminal cells causes clonal expansion and development of mammary tumours. Nature Communications. 8, 14431(2017).
- Tao, L., van Bragt, M. P. A., Laudadio, E., Li, Z. Lineage Tracing of Mammary Epithelial Cells Using Cell-Type-Specific Cre-Expressing Adenoviruses. Stem Cell Reports. 2 (6), 770-779 (2014).
- Sutherland, K. D., et al. Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung. Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- The Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
- Nik-Zainal, S., et al. The life history of 21 breast cancers. Cell. 149 (5), 994-1007 (2012).
- Abba, M. C., et al. A Molecular Portrait of High-Grade Ductal Carcinoma In Situ. Cancer Research. 75 (18), 3980-3990 (2015).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
