Het inducerende apicale periodontitis bij muizen

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor het lokaal opwekken van apicale parodontitis bij muizen. We laten zien hoe we een gat in de tand van de muis boren en de pulp ervan blootstellen, om lokale ontstekingen te veroorzaken. Analysemethoden om de aard van deze ontsteking te onderzoeken, zoals micro-CT en histologie, worden ook aangetoond.

Samenvatting

De mechanismen die betrokken zijn bij lokale geïnduceerde ontstekingen kunnen worden bestudeerd met behulp van verschillende beschikbare diermodellen. Eén daarvan is de inductie van apicale parodontitis (AP). Apicale parodontitis is een veelvoorkomende pathologie van een ontstekings natuur in de parodontale weefsels rond de tandwortel. Om de aard en het mechanisme van deze pathologie beter te begrijpen, is het voordelig om de procedure bij muizen uit te voeren. De inductie van deze odontogene ontsteking wordt bereikt door het boren in de muis tand totdat de tand pulp wordt blootgesteld. Vervolgens blijft de tand pulp blootgesteld aan besmet door de natuurlijke orale flora na verloop van tijd, waardoor apicale parodontitis. Na deze periode wordt het dier geofferd en kunnen de tand en het kaakbeen op verschillende manieren geanalyseerd worden. Typische analyses omvatten micro-CT-beeldvorming (om botresorptie te evalueren), histologische kleuring, immunohistochemie en RNA-expressie. Dit protocol is nuttig voor onderzoek op het gebied van orale biologie om dit ontstekingsproces beter te begrijpen in een in vivo experimentele setting met uniforme omstandigheden. De procedure vereist een zorgvuldige omgang met de muizen en de geïsoleerde kaak, en een visuele demonstratie van de techniek is nuttig. Alle technische aspecten van de procedures die leiden tot geïnduceerde apicale parodontitis en de karakterisering ervan in een muismodel worden gedemonstreerd.

Inleiding

Het doel van deze methode is om apicale parodontitis in een muis te induceren door de Apex te besmetten met de natuurlijke microflora en vervolgens verschillende kenmerken van dit pathologische proces te bestuderen.

Apicale parodontitis (AP) is een veelvoorkomende pathologie van een ontstekings natuur in de parodontale weefsels rond de tandwortel. Deze tandheelkundige aandoening kan ernstige pijn veroorzaken en moet worden behandeld door een tandarts. De behandelingsopties omvatten wortelkanaal behandeling (primair of secundair), endodontische chirurgie, tandextractie, of follow-up afhankelijk van de klinische en radiografische bevindingen, en de mening van de clinicus. Het mechanisme van dit ontstekingsproces, hoewel bestudeerd voor enkele decennia^1,2,3, is nog steeds niet volledig begrepen. Gezien de ernst van deze pathologie is er dus een duidelijke behoefte aan onderzoek om de fundamentele aard ervan aan te pakken. Zo zijn systemen waar de studie van AP mogelijk is van groot wetenschappelijk belang.

Aangezien AP een complex pathologisch proces is waarbij de lokale weefsels en het immuunsysteem betrokken zijn, zijn in vitro studies onvoldoende voor een volledig begrip van de processen. Studie van klinische monsters van deze ziekte zijn ook problematisch als gevolg van ethische beperkingen en significante variabiliteit tussen verschillende mensen en verschillende klinische stadia^4,5, en vandaar de noodzaak van in vivo modellen. Deze modellen zijn gebaseerd op het concept van het blootstellen van de tand pulp aan verontreiniging en het observeren van de ontstekingsreactie van het lichaam op deze stimulus in de periapicale weefsels^6,7. Veelgebruikte modellen in vivo zijn knaagdieren of grotere diersoorten, zoals honden. Ondanks de klinische uitdaging bij de behandeling van muizen, die zeer kleine dieren met miniatuur tanden zijn, zijn de voordelen van het muismodel significant: praktisch is het werken met muizen technisch eenvoudig in termen van faciliteiten en is het meest kosteneffectief, en wetenschappelijk, de muis is een goed bestudeerde diermodel met gemakkelijk beschikbare genetische en moleculaire instrumenten en een goed bestudeerde genoom. Inderdaad, eerdere studies gebruikten een muismodel voor het bestuderen van inflammatoire en bot resorptie signalen en cellen die betrokken zijn bij apicale parodontitis^8,9,10,11. Daarom is een duidelijk protocol over het gebruik van een muismodel voor de studie van AP nodig. Hier beschrijven we een dergelijk protocol.

Het hier beschreven protocol heeft het grote voordeel dat het geschikt is om knock-out (ko) muizen te bestuderen en te leren hoe het ontbreken van een specifiek gen de tandheelkundige ontsteking^7,12beïnvloedt. Andere nuttige toepassingen van dit protocol zijn onder meer de studie van de effecten van medicatie en systemische condities op de ontwikkeling van apicale parodontitis¹³, het effect van apicale parodontitis op de ontwikkeling van osteonecrose van de kaken^{14 , 15} en stamceltherapie voor botregeneratie¹⁶.

Dit protocol kan ook worden gegeneraliseerd als een model om lokale ontsteking te bestuderen. Om het ontstekingsproces te bestuderen, zijn verschillende Muismodellen ontwikkeld, waaronder bijvoorbeeld geïnduceerde colitis of artritis^17,18. Deze modellen hebben systemische effecten en hebben geen ingebouwde controle in hetzelfde dier. Modellen voor geïnduceerde apicale parodontitis, die een contralaterale controle zonder ontsteking omvatten, hebben het voordeel van het overwinnen van deze beperkingen^14,19.

Het hieronder beschreven protocol is daarom nuttig voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in lokale ontstekingsprocessen. De gecontroleerde aard van deze ontsteking, de opsluiting ervan op een specifieke locatie, en de contralaterale controle tand, maken dit protocol allemaal waardevol voor het bestuderen van de mechanismen die bij dit proces betrokken zijn. Bovendien, het protocol is nuttig voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in de klinische aspecten van periapicale ontsteking. Het muismodel is ideaal om verschillende variabelen van de ziekte te bestuderen, naast het voordeel dat het gemakkelijk is om genetische manipulaties in het muismodel uit te voeren, om de activiteit van specifieke genen in periapicale ontsteking te onderzoeken.

Technisch gezien is de klinische procedure uitdagend om uit te voeren door de kleine afmetingen van de muizen tanden. Het is nuttig om deze procedure te visualiseren om te leren over positionering, apparatuur die nodig is, en prestaties.

Protocol

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van de Hebreeuwse Universiteit (ethisch nr. MD-17-15093-5).

1. dieren anesthesie en positionering

1. Bereid steriele oplossingen zoals hieronder beschreven.
   1. Bereid 5 mL van 7 mg/mL ketamine en 0,09 mg/mL Medetomidine verdund in fosfaat buffer oplossing (PBS)/Saline.
   2. Bereid een steriele oplossing van Atipamezol (0,4 mg/mL) verdund in PBS/zoutoplossing (aanbevolen om een hoeveelheid van 5 mL te bereiden).
   3. Bereid een steriele oplossing van Mepivacaine (7,5 mg/mL) verdund in PBS/zoutoplossing voor lokale anesthesie (een meegeleverde flacon Mepivacaine is voldoende voor een voorraad van 7,2 mL).
2. Gebruik 6-8 weken oude vrouwelijke C57BL/6 muizen voor het experiment. Houd dieren in een specifiek pathogeen vrij (SPF) dier eenheid, met standaard water en voedsel geleverd door de faciliteit en het dier voeden ad libitum.
3. Weeg muizen en Injecteer intraperitoneaal (IP) een volume van 10 μL voor elke gram van het gewicht. Bijvoorbeeld, voor een muis die 20 gram weegt,
   Injecteer 200 μL ketamine/Medetomidine oplossing. Dit geeft een eindconcentratie van (70 mg/kg) ketamine en (0,9 mg/kg) Medetomidine
   voor elk dier.
4. Om oogulceratie te voorkomen als gevolg van droogheid tijdens de procedure, breng oogzalf met chlooramfenicol (5%) op de ogen van de dieren terwijl ze onder anesthesie. Houd de dieren warm met een lamp terwijl ze verdoiliseerd zijn. Controleer de diepte van de anesthesie door het controleren van pedaal reflex (het uitvoeren van stevige teen knijpen).
5. Nadat de muis is verdomd, Positioneer de muis op zijn rechterkant (voor een rechtshandige onderzoeker) op een gesloten-cel geëxtrudeerd polystyreenschuim oppervlak en bevestig de voeten aan het oppervlak met behulp van tape.
6. Open de mond met behulp van kleine elastiekjes rond de snijtanden (1 voor de bovenste snijtanden, en 1 voor de onderste snijtanden) die op zijn plaats worden gehouden door lange naalden die zijn vastgemaakt aan het geëxtrudeerde polystyreenschuim oppervlak van de gesloten cellen.
7. Trek de rechter wang met behulp van de Tang geplakt naar het oppervlak. Gebruik de Tang die in steady state gesloten zijn.
8. Plaats het oppervlak met de muis in een comfortabele werkpositie die toegang tot mandibulaire Molars mogelijk maakt, met behulp van de juiste vergroting (een binoculaire Microscoop of klinische Microscoop) en licht.
9. Trek de tong aan met behulp van een tang of tand spatel en Injecteer lokale verdoving met een 27 gauge naald in de mucobuccale plooi grenzend aan de eerste mandibulaire molaire. 25-50 μL volstaat. Zwelling van het weefsel rond de injectieplaats moet worden gevisualiseerd.

2. blootstelling aan pulp

1. Gebruik een 1/4 Round Dental Burr, of een zelfde grootte diamant Braam (een lange schacht wordt aanbevolen) met een snelheid van 800 rondes per minuut (rpm), bevestigd aan een geschikte tandheelkundige motor (bijvoorbeeld een automatische koppel reductie (ATR) motor).
2. Boor op het occlusale deel van de eerste rechter mandibulaire molaire totdat de pulp hoorns zichtbaar zijn door de dentine. Gebruik korte uitbarstingen van de motor om te voorkomen dat het gebied over-verwarming.
3. Gebruik een K-bestand of H-bestand #8 of #10 om de pulp door te boren en voeg het bestand in de pulp hoorns (mesial en distale) door het breken van de dentine die hen bedekt. Bestanden worden gesteriliseerd door autoclaaf.
4. Blijf werken met de bestanden in de pulp zo diep mogelijk, terwijl het verbreden van de openingen met de bestanden. Meestal zal er bloeden zichtbaar van de pulp.
5. Zorg ervoor dat u de scherpe randen van de tand rond met de Braam en verwijder de tand van occlusie, om pijn tijdens het experiment te verminderen. Reinig vuil tijdens de procedure met een micro borstel.
6. Laat de contralaterale tand (linker eerste mandibulaire Molar) als een controle.

3. einde van de klinische procedure

1. Laat de muis los van de fixatie status en Injecteer Atipamezole IP (10 μL voor elke gram lichaamsgewicht. Dit geeft een laatste dosis van (4 mg/kg) Atipamezol.
2. Injecteer buprenorfine verdund in PBS/Saline (0,05 mg/kg) IP (aanbevolen om een hoeveelheid van 3 mL op de dag van de procedure te bereiden). Zie discussie voor uitleg waarom pijnbestrijding noodzakelijk is.
3. Zorg ervoor dat de dieren te herstellen van de anesthesie voor het verlaten van hen. Geef ze zacht voedsel omdat ze mogelijk niet in staat zijn om hard voedsel te eten als gevolg van tandpijn.

4. follow-up van de post procedure (42 dagen)

1. Weeg gedurende de eerste 3 dagen na de ingreep de dieren af en Injecteer eenmaal daags een buprenorfine (0,1 mg/kg) IP (aanbevolen om een hoeveelheid van 6 ml te bereiden).
2. Gedurende de tijd van het experiment (42 dagen wanneer de ontsteking opbouwt) bewaken van de dieren op gewicht en algemene gedrags beoordeling 2-3 keer per week.
3. In de loop van de opvolgings periode zacht voedsel leveren aan de dieren. Bevochtig het voedsel met water en zet het in een petrischaaltje op de vloer van de kooi.

5. beëindiging en analyse van experimenten

1. Wanneer 42 dagen¹¹ van follow-up zijn voltooid, anesthetiseren dieren IP met ketamine/xylazine in een concentratie van 106,25 mg/kg ketamine, en 75 mg/kg xylazine (een stamoplossing van 42,5 mg/ml ketamine, en 1,5 mg/ml xylazine in een totaal volume van 2 ml is Aanbevolen) en preform cervicale dislocatie.
   Opmerking: er zijn verschillende opties voor mogelijke analyses om de ontsteking te evalueren^20,21. Hier wordt de analyse van het weefsel door micro-CT en histologische kleuring beschreven.
2. Gebruik na euthanasie een chirurgische schaar en een tang om een deel van de kaak te knippen, inclusief de 3 kiezen (afzonderlijk voor elke met de zijkant behandelde en niet-behandelde controle). Door het gebruik van de Tang schil zo veel mogelijk het zachte weefsel, waardoor meestal bot en tanden op het monster.
3. Spoel het weefsel kort af in PBS en plaats het vervolgens in Paraformaldehyde (PFA) 4% (verdund in PBS) gedurende 24-48 uur voor fixatie.
   Let op: gebruik PFA in een chemische afzuigkap, en volgens de richtlijnen van het materiaal veiligheidsinformatieblad (MSDS).
4. Na 24-48 uur spoelen met PBS 3x om de PFA te wassen.
5. Micro-CT
   1. Neem voor micro-CT-analyse de geoogste weefsels (een deel van de onderkaak met inbegrip van 3 Molars, in afmetingen van ongeveer 4 mm x 5 MMX 1 mm) naar een micro-CT-scanner, plaats ze in een buis met een diameter van 12 mm, gevuld met 1,5 mL PBS-georiënteerd, zodat de buccale of linguale oppervlakken van de tand en wortel leggen parallel aan de onderkant van de buis. Scheid tussen de monsters met spons, en dek de bovenkant van de buis met flexibele film.
   2. Open het Scan paneel en kies het meet nummer. Kies het besturingsbestand met de volgende parameters: energie van 70 kV, intensiteit van 114 μA, en resolutie van 6 μm³ Voxel grootte.
   3. Klik op de Scout-weergaveen wanneer de afbeelding verschijnt, klikt u op referentielijn en markeert u het gebied van de voorbeelden om te scannen. Klik na elk voorbeeld op Scan toevoegen. Wanneer u klaar bent met het markeren van de voorbeelden, gaat u naar de takenlijst en kiest u interactieve taken starten.
      Opmerking: dezelfde monsters kunnen vervolgens worden gebruikt voor histologie. Het is belangrijk dat ze niet uitdrogen tijdens de CT-scan.
6. Gebruik een geschikt computerprogramma voor micro-CT-uitlijning en-analyse.
   1. Open het monster op het XY-vlak in de micro-CT-evaluatie. Kies drie punten voor elk voorbeeld voor uitlijning:
      De mesiale apicale vernauwing-definieert de oorsprong van het coördinatenstelsel.
      Het coronale deel van het mesiale kanaal-definieert een punt op de Z-as.
      De distale apicale vernauwing-definieert een punt op het XZ-vlak.
   2. Gebruik het gereedschap meten in het linkerdeelvenster en teken een lijn die elk punt bereikt. Definieer elk van de drie punten met een X, Y & Z-waarde, zoals deze in het rechterdeelvenster wordt weergegeven.
   3. Definieer het interessegebied in het voorbeeld door taak onder μct-evaluatiete kiezen en klik op 3D-evaluatie. Op het scherm verschijnt een rechthoek en een venster met de afmetingen per as. Overeenkomen met de afmetingen van de rechthoek aanpassen aan het gebied van belang op de XY-as door te klikken in de hoeken met de middelste knop van de muis. Kies de dimensies in de Z-as door het eerste Segmentnummer van de belangstelling in het Z-kwadraat onder VOI-startin te voegen en het aantal segmenten van de eerste tot het laatste Segmentnummer van de belangstelling in het z-vierkant onder Dim.
   4. Klik op toepassingen onder Session Manager, en kies decterm. Wacht een paar seconden tot een venster is geopend en typ vervolgens de vijf stappen van het schuine script dat hieronder wordt beschreven volgens de volgende instructies (tussen de regels op Enter):
      Ipl
      isq_to_aim
      aim1
   5. Kopieer de naam van de ISQ (bestand van belang): Kies ' views ' onder Session Manager en klik op microctdata. Zoek het bestand waaraan u werkt en klik in het midden op het bestand. Klik vervolgens midden op terug in het venster van de DECterm.
   6. Voer de X, Y & Z waarden (met een spatie daartussen) die zijn bepaald onder VOI bij het kiezen van regio van belang.
   7. Voer de X, Y & Z waarden (met een spatie daartussen) die zijn bepaald onder Dim bij het kiezen van regio van belang.
   8. Wacht tot een bericht wordt ontvangen: ISQ om te richten voltooid.
      (stap II-uitlijning):
      uitlijnen z
      aim1
      aim2
   9. Voer de X-, Y & Z-waarden in (met een spatie daartussen) die voor de oorsprong van het coördinatensysteem zijn vastgesteld.
   10. Voer de waarden X, Y & Z in (met een spatie daartussen) die voor het punt op de Z-as zijn bepaald.
   11. Voer de X-, Y & Z-waarden in (met een spatie daartussen) die voor het punt op het XZ-vlak zijn bepaald.
   12. Wacht tot een bericht wordt ontvangen: "align_Z completed"
       (stap III-koptekst):
       Header
       aim2
       0 0 0
       0 0 0
   13. Klik op Enter.
       (Stap IV-converteren van het bestand terug van AIM naar ISQ):
       toisq
       aim2
   14. Kopieer de naam ISQ (bestand van belang): Kies ' bekeken ' onder ' sessiebeheer ' en klik op ' microct-gegevens'. Zoek het bestand waaraan u werkt en klik in het midden op het bestand. Klik vervolgens midden op terug in het venster van de DECterm. Wissen (met "Backspace") de ". ISQ "aan het einde van het bestand en schrijf:" _new. ISQ "om het uitgelijnde bestand te herkennen.
   15. Klik op Enter | invoeren.
   16. Wacht tot een bericht wordt ontvangen: "toisq_from_aim completed"
       (stap V-Flip):
       Isq
       A
   17. Kopieer de nieuwe naam ISQ (bestand met interesse): Kies ' bekeken ' onder ' sessie beheer ' en klik op ' microct-gegevens'. Zoek het bestand waaraan u werkt en klik in het midden op het bestand. Klik vervolgens midden op terug in het venster van de DECterm.
   18. Klik op Enter | invoeren. Wachten om een bericht te ontvangen: "isq_to_aim completed"
       Flip
       A
       Aa
       Zx
       wachten om een bericht te ontvangen: "flip_aim completed"
       Van
       Aa
   19. Kopieer de nieuwe ISQ-naam: Kies ' views ' onder Session Manager en klik op microct data. Zoek het bestand waaraan u werkt en klik in het midden op het bestand. Klik vervolgens midden op terug in het venster van de DECterm. Wissen (met "Backspace") de ". ISQ "aan het einde van het bestand en schrijf:" _flip. ISQ "om het uitgelijnde bestand te herkennen.
   20. Wacht tot een bericht wordt ontvangen: "from_aim_to_isq completed"
7. Contouring
   1. Kies het segment dat ongeveer het midden van de tand vertegenwoordigt, waarin de coronale pulp, radiculaire pulp van beide kanalen en beide apicale foramens worden weergegeven.
   2. Markeer de contour van de interesse handmatig op de middelste slice door te klikken op de linker contour panel-beginnend vanaf het distale punt van de distale wortel Apex Mark de apicale grens kronkelig aan het radiopaque apicale gebied, door de mesiale rand van de mesiale wortel Apex na de distale grens van de mesiale wortel en de mesiale grens van de distale wortel door de furcatie regio (Zie Figuur 3 II, IV).
   3. Kopieer deze contour (CTRL + C, CTRL + V) en pas deze vervolgens aan op 5 segmenten die aan beide zijden van het middelste segment zijn geplaatst.
   4. Voor het berekenen van het weefsel volume van de contour gemarkeerd voor elk monster Kies taak onder μct evaluatie, en klik op 3D-evaluatie. Klik in het venster van 3D-evaluatie op selecteren in de buurt van taak en kies een filter om het weefsel volume (TV) te berekenen.
8. Histologie
   1. Nadat de weefsels uit de micro-CT-scanner zijn verwijderd, ontheft u de weefsels door elk monster in een micro centrifugebuis te zetten met 1 mL ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) 0,5 M pH 8,0 gedurende 10 dagen. Verander de EDTA-oplossing elke 3 dagen.
   2. Uitdroging: steek monsters in histologische cassettes en in toenemende ethanol concentraties, elk een uur, als volgt: 70% ethanol (op dit punt kan het proces gedurende enkele weken worden stopgezet, zolang de monsters in ethanol worden gehouden), 90% ethanol 2x, 100% ethanol 2x, xyleen 2x (Let op: gebruik xyleen in een chemische afzuigkap, en volgens de richtlijnen van de MSDS).
      1. Breng cassettes over in vloeibare paraffine (60 °C) en laat de chemische afzuigkap 's nachts voor het xyleen verdampen.
   3. Blokkeren: gebruik een histologische blokkerende machine om de monsters in te bedden in paraffine. Wees voorzichtig om ze in een juiste positie in te bedden (dat wil zeggen, de kroon en wortels moeten parallel aan het onderste deel van de mal worden georiënteerd, op een manier dat de tand "liggend" is) om sagittale secties te krijgen. De monsters zijn nu klaar om te worden gesneden met een microtoom.
   4. Snijden van de secties: begin met het snijden van dikke plakjes ~ 20 μm tot het relevante deel van het weefsel te bereiken. Zodra het herkennen van een deel van de tand (kroon of wortels) veranderen in secties van 6 μm, en verander de hoek van snijden volgens de vorige sectie.
      1. Bijvoorbeeld, als de vorige sectie bevatte de kroon maar niet de wortels, verander de hoek van het blok in de microtoom, zodat de wortels dichter bij het mes komen, en de kroon gaat terug (de delen van de tand kan worden herkend met een blote oog op het blok zelf).
      2. Blijf de hoek aanpassen tot het verkrijgen van sagittale secties met inbegrip van coronale en radiculaire pulp, en de apicale foramen. Snijd in deze richting zoveel mogelijk plakjes, totdat het relevante weefsel is gesneden.
   5. Voor kleurings protocollen (bijv. hemotoxylin en eosine kleuring (H & e), bruin & Brenn kleuring, tartraat-resistente zure fosfatase (val) kleuring, immunohistochemie), Zie^20,21.

Resultaten

Een stroomschema van de experimentele stappen wordt weergegeven in Figuur 1. Zoals vermeld in het Protocol, de muizen zijn verdouild, en hun eerste mandibulaire molaire aan de ene kant wordt geboord tot de blootstelling aan pulp, terwijl de contralaterale tand wordt achtergelaten als een controle. Vervolgens worden de tanden gelaten om te worden verontreinigd door de orale flora voor 42 dagen, waarin ze worden bewaakt en krijgen pijnmedicatie. Na 42 dagen wor...

Discussie

Hier wordt een methode geïntroduceerd voor de inductie van apicale parodontitis bij muizen. Het doel van de methode is om de apicale parodontitis voorwaarde voor het bestuderen van mechanismen en gevolgen van dit ontstekingsproces te exploiteren. Apicale parodontitis werd geïnduceerd in 6-8 weken oude muizen, een leeftijd waarin de wortels volledig zijn ontwikkeld²⁴. Om apicale parodontitis in dit model te veroorzaken, wordt de tand pulp van muis mandibulaire kiezen blootgesteld met b...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Atipamezole hydrochloride	Eurovet Animal Health	CAS 104075-48-1
ATR	dentsply	tecnika
blocking machine	Leica	EG1150H
buprenorfine	vetmarket	163451
klinisch microscope/binocular	Olympus	Sz61
tandboor	Komet dental	ZR8801L 315 008
tandspatel	Premier	1003737
EDTA	J.T Baker	8993
entelan	mercury	1.07961
Eosin Y oplossing, alcoholisch	SIGMA	HT110116
hematoxylinline oplossing, Mayer's	SIGMA	MHS 16
Ketamine hydrochloride	Vetoquinol	CAS 1867-669
Medetomidine hydrochloride (cepetor)	CP-pharma GmbH	CAS 86347-15-1
Mepivacaine HCl 3%	Teva	CAS 96-88-8
microbrushes - instelbare precisie applicatoren	PARKELL	S379
micro-CT scanner	scanco	uCT 40
parafin	Leica	39602004
PBS	SIGMA	D8537
PFA	EMS	15710
Chloramfenicol oogzalf (5%)	Rekah pharmaceutical	CAS 56-75-7
pincet	WAM	Ref-CT
xylazine	Eurovet Animal Health	CAS 7361-61-7
xyleen	Gadot	CAS 1330-20-7