Methodenartikel

Een in vitro batch cultuur model om de effecten van Interventionele regimes op menselijke fecale microbiota te schatten

DOI:

10.3791/59524

⸱

31 juli 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine- Molecular Medicine, Wake Forest School of Medicine, 2Department of Microbiology and Immunology, Wake Forest School of Medicine, 3Department of Food Science and Technology, Isfahan University of Technology, 4Research Institute for Biotechnology and Bioengineering, College of Agriculture, Isfahan University of Technology, 5Department of Geriatrics and Gerontology, Wake Forest School of Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een in vitro batch cultuur fermentatiesysteem van menselijke fecale microbiota, met behulp van inuline (een bekende prebiotisch en een van de meest bestudeerde microbiota modulatoren) om het gebruik van dit systeem te demonstreren bij het inschatten van de effecten van specifieke interventies op fecale microbiota samenstelling en metabole activiteiten.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De opkomende rol van het microbioom van de darmen bij verschillende menselijke ziekten vereist een doorbraak van nieuwe instrumenten, technieken en technologieën. Dergelijke verbeteringen zijn nodig om te ontcijferen van het gebruik van microbiome modulatoren voor voordelen voor de menselijke gezondheid. Echter, de grootschalige screening en optimalisatie van modulatoren om te valideren microbiome modulatie en voorspel gerelateerde gezondheidsvoordelen kunnen praktisch moeilijk zijn als gevolg van de noodzaak voor een groot aantal dieren en/of menselijke proefpersonen. Hiertoe kunnen in vitro-of ex vivo-modellen een voorafgaande screening van microbiome-modulatoren vergemakkelijken. Hierin, het is geoptimaliseerd en aangetoond een ex vivo fecale microbiota cultuur systeem dat kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de effecten van verschillende interventies van gut microbiome modulatoren met inbegrip van probiotica, prebiotica en andere voedselingrediënten, afgezien van nutraceuticals en drugs, over de diversiteit en samenstelling van de menselijke gut microbiota. Inuline, een van de meest bestudeerde prebiotische verbindingen en microbiome modulatoren, wordt gebruikt als een voorbeeld hier te onderzoeken van het effect ervan op de gezonde fecale microbiota samenstelling en de metabole activiteiten, zoals fecale pH en de fecale niveaus van organische zuren met inbegrip van lactaat en korte-keten vetzuren (SCFAs). Het protocol kan nuttig zijn voor studies die gericht zijn op het inschatten van de effecten van verschillende interventies van modulatoren op fecale microbiota-profielen en op het voorspellen van hun gevolgen voor de gezondheid.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De humane microbiota is een complexe Gemeenschap bestaande uit bacteriën, Archaea, virussen en eukaryotische microben1, die het menselijk lichaam zowel intern als extern bewonen. Recente bewijzen hebben de fundamentele rol van de darm microbiota en het darm-microbiome (de gehele verzameling van microben en hun genen gevonden in het menselijk maagdarmkanaal) vastgesteld in verschillende menselijke ziekten, waaronder obesitas, diabetes, hart-en vaatziekten, en kanker1,2,3. Bovendien produceren de micro-organismen die in onze darmen leven een breed spectrum van metabolieten die een aanzienlijke invloed hebben op onze gezondheid en kunnen ook bijdragen aan de pathofysiologie van verschillende ziekten, evenals een verscheidenheid aan metabole functies4, 5. abnormale veranderingen (verstoringen) in de samenstelling en functie van deze darm microbiële populatie worden over het algemeen aangeduid als "gut dysbiosis". Dysbiosis wordt meestal geassocieerd met een ongezonde toestand van de gastheer en kan dus worden onderscheiden van de normale (homeostatische) microbiële Gemeenschap die is gekoppeld aan een gezonde controle staat van de gastheer. Specifieke patronen van gut microbiome dysbiosis worden vaak gevonden in verschillende ziekten1,2,3,6,7.

De fermentatie van onverteerd voedsel, in het bijzonder de fermenteerbare koolhydraten/vezels, door de darm microbiota levert niet alleen energie op, maar produceert ook afwijkende metabolieten, waaronder korte-keten vetzuren (SCFAs), lactaat, formaat, koolstofdioxide, methaan, waterstof en ethanol6. Bovendien, de darm microbiota produceert ook een aantal andere bioactieve stoffen zoals folaat, biotine, trimethylamine-N-oxide, serotonine, tryptofaan, Gamma-aminoboterzuur, dopamine, noradrenaline, acetylcholine, histamine, deoxycholzuur en 4-ethylfenylsulfaat. Dit gebeurt voornamelijk door het gebruik van intrinsieke metabole fluxen binnen de host-microbe niche, die bijdraagt aan verschillende lichaamsprocessen, metabole functies en epigenetische veranderingen1,8,9, 10. De effecten van verschillende interventies op dergelijke microbiële producten blijven echter onkown of onduidelijk vanwege het ontbreken van eenvoudige, efficiënte en reproduceerbare protocollen. De humane gut microbiota samenstelling is een extreem complex en divers ecosysteem, en daarom blijven veel vragen over haar rol in de menselijke gezondheid en ziekte pathologie nog steeds onbeantwoord. De effecten van vele gemeenschappelijke gut microbiome modulatoren (bv., probiotica, prebiotica, antibiotica, fecale transplantatie en infecties) op de samenstelling en metabole functies van de intestinale microbiota blijven grotendeels ongrijpbaar. Bovendien is het onderzoek en de validering van deze effecten in vivo moeilijk, vooral omdat de meeste nutriënten en metabolieten die door de darm microbiota worden geproduceerd, gelijktijdig en snel in de darmen worden geabsorbeerd of afgevoerd; Daarom blijft het meten van de productie, de hoeveelheid en de verwerking van deze metabolieten (bijv. SCFAs) in vivo nog steeds een praktische uitdaging. Inderdaad, fysiologische modellen zoals dieren en menselijke proefpersonen zijn van cruciaal belang voor het bepalen van de rol van gut microbiome en de modulatie ervan op gastheer gezondheid, maar deze mogelijk niet geschikt voor grootschalige screening van verschillende soorten microbiome modulatoren als gevolg van ethische, monetaire of tijdsbeperkingen. Hiertoe kunnen in vitro en/of ex vivo-modellen, zoals het kweken van gut microbiota in vitro en vervolgens interveniëren met verschillende microbiota-modulatoren, tijd-en geldbesparings mogelijkheden bieden en kunnen daarom voorlopige of grootschalige screening van verschillende componenten (zoals probiotica, prebiotica, en andere Interventionele verbindingen) om te onderzoeken/voorspellen hun effecten op de fecale microbiota diversiteit, samenstelling en metabole profielen. Studies met behulp van dergelijke in vitro en ex vivo systemen van het microbioom van de darmen kunnen meer inzicht in de interacties van gastheer-microbiome die bijdragen tot gastheer gezondheid en ziekte te vergemakkelijken, en kan ook leiden tot het vinden van nieuwe therapieën die gericht zijn op de microbiome te verbetering van de gezondheid van de gastheer en voorkomen en behandelen van verschillende ziekten1.

Hoewel de in vitro gut microbiota cultuur systemen niet echt de werkelijke intestinale omstandigheden kunnen repliceren, hebben verschillende laboratoria getracht dergelijke modellen te ontwikkelen, waarvan sommige tot op zekere hoogte uitvoerbaar zijn bevonden en met succes zijn gebruikt voor verschillende doeleinden. Een van de recente gut modellen is de Simulator van de menselijke intestinale microbiële ecosysteem, die het hele menselijke maagdarmkanaal nabootst, met inbegrip van de maag, dunne darm, en verschillende gebieden van de dikke darm. Dergelijke technisch complexe modellen zijn echter mogelijk niet toegankelijk voor andere onderzoeksfaciliteiten wereldwijd. Daarom is er nog steeds een kritische behoefte aan de ontwikkeling van nieuwe alternatieve modellen die relatief eenvoudig, betaalbaar en praktisch zijn voor laboratoria die de microbiome modulatoren bestuderen en hun effecten op gut microbiota en host Health. Daarom zou het gebruik van een in vitro (of ex vivo) fecaal microbiota-cultuur systeem nuttig zijn voor het bestuderen van de effecten van dergelijke interventies11,12. Specifiek, het effect van verschillende prebiotica op de microbiota fermentatie capaciteit in termen van periodieke veranderingen in de darm microbiota diversiteit en samenstelling, de fecale pH, en de niveaus van microbiële metabolieten, met inbegrip van SCFAs en lactaat kan worden bestudeerd 13. hierin wordt, met behulp van inuline (een van de meest bestudeerde prebiotische componenten) als voorbeeld van de microbiome modulator, een stapsgewijs Protocol van dit eenvoudige ex vivo microbiota batch-cultuur systeem beschreven om het gebruik ervan aan te tonen om de veranderingen in de fecale microbiota en microbiële metabolieten na interventie met de microbiome modulatoren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Let op: Raadpleeg de juiste veiligheidsinformatiebladen en volg de instructies en richtlijnen voor de juiste training voor Biosafety level 2 (BSL-2). Volg alle kweek stappen volgens de standaard bioveiligheidsregels en gebruik een BSL-2 kast met aseptische condities. Bovendien kunnen fecale monsters van verschillende modellen en menselijke proefpersonen potentieel risico lopen om microbiële overgedragen ziekten te verspreiden. Onmiddellijk medische hulp inroepen bij het optreden van een verwonding en infectie. Bovendien moet het gebruik van monsters van menselijke en dierlijke ontlasting worden goedgekeurd via institutionele ethische comités en moet het voldoen aan de protocollen voor het gebruik van monsters en informatie over het onderwerp.

1. voorbereiding van cultuur media

  1. Voorbereiding van de cultuur media, bereid negen soorten stockoplossingen voor
    1. Oplossing A (1.000 mL): Los 5,4 g natriumchloride (NaCl), 2,7 g kalium diwaterstoffosfaat (KH2po4), 0,16 g calciumchloridedihydraat (CACL2· 2H2O), 0,12 g van magnesium chloride-hexahydraat (MgCl2 · 6h2o), 0,06 g mangaan chloride-tetrahydraat (mncl2· 4h2O), 0,06 g van Cobalteus chloride-hexahydraat (COCl2· 6h2O) en 5,4 g ammoniumsulfaat (NH4)2so4, in gedeïoniseerd water om het totale volume te maken tot 1.000 mL.
    2. Oplossing B (1.000 mL): los 2,7 g kalium waterstof fosfaat (K2HPO4) op in gedeïoniseerd water om een totaal volume te maken tot 1000 mL.
    3. Minerale oplossing (1.000 mL): Los 500 mg dinatriumethyleendiamine-tetraacetaatdihydraat op (na2EDTA), 200 mg ferrosulfaat heptahydraat (Feso4· 7h2O), 10 mg Zinksulfaat-heptahydraat (znso4 · 7h2o), 3 mg mangaan (II) chloride-tetrahydraat (mncl2· 4h2o), 30 mg fosforzuur (H3po4), 20 mg COCl2· 6h2o, 1 mg koper-chloride dihydraat (cucl2 · 2H2o), 2 mg nikkel (II) chloride-hexahydraat (nicl2· 6h2o) en 3 mg natriummolybdaat dihydraat (na2Moo4· 2H2O) in gedeïoniseerd water om een totaal volume te maken tot 1.000 ml.
      Opmerking: Deze oplossing is lichtgevoelig, dus zorg ervoor om te worden opgeslagen in donker/zwart of aluminium verpakt buizen/flessen.
    4. In water oplosbare vitamine oplossing (1.000 mL): los 100 mg thiamine hydrochloride (thiamine-HCl), 100 mg D-pantotheenzuur, 100 mg niacine, 100 mg Pyridoxine, 5 mg P-aminobenzoëzuur en 0,25 mg vitamine B12 in gedeïoniseerd water om het totale volume te maken 1.000 mL.
    5. Folaat: Biotine oplossing (1.000 mL): Los 10 mg foliumzuur, 2 mg D-Biotine en 100 mg Ammoniumbicarbonaat (NH4HCO3) in gedeïoniseerd water op om een totaal volume te maken tot 1.000 ml.
    6. Riboflavine oplossing (1.000 mL): Los 10 mg riboflavine op in 5 mM HEPES (1,19 g/L) oplossing om een totaal volume te maken tot 1.000 mL.
    7. Hemin-oplossing (10 mL): Los 5.000 mg Hemin op in 10 mM natriumhydroxide (NaOH) (0,4 g/L) oplossing om een totaal volume te maken tot 10 mL.
    8. Korte-keten vetzuur mengsel (10 mL): Combineer 2,5 mL N-valeraat, 2,5 mL isovaleraat, 2,5 mL isobutyraat en 2,5 mL: DL-α-methylbutyraat.
      Opmerking: Deze oplossing wordt aanbevolen om te gebruiken in rook afzuigkap om geur en dampen te voorkomen.
    9. Resazurin (1.000 mL): Los 1 g resazurin op in gedeïoniseerd water en breng het totale volume naar 1.000 mL.
  2. Medium gebruikt voor in-vitro anaerobe gisting
    1. Om deze media voor te bereiden, meng 330 mL oplossing A, 330 mL oplossing B, 10 mL trace minerale oplossing, 20 mL in water oplosbare vitamine oplossing, 5 mL folaat: Biotine oplossing, 5 mL riboflavine oplossing; 2,5 mL Hemin oplossing, 0,4 mL van de korte keten vetzuur mengsel, 1 mL Resazurin, 0,5 g gistextract, 4 g natriumcarbonaat (na2co3), 0,5 g cysteïne HCL-H2O, en 0,5 g Trypticase, en voeg 296,1 ml gedistilleerd water toe.
    2. Controleer de pH en zorg ervoor dat het rond 7,0, zo niet, pas de pH met 1 N HCl of 1 N NaOH. Steriliseren door vacuüm de media te filteren met behulp van een fles filter onder het aseptische werkstation.
    3. U ook alle componenten (behalve vitamine-en wijk haemin-oplossingen) en autoclaaf bij 121 °C gedurende 20 minuten mengen en laten afkoelen tot kamertemperatuur. Tegelijkertijd, filter-steriliseren vitamine en wijk haemin oplossingen met behulp van 0,22 μm membraanfilters en voeg deze toe aan de geautoclaveerd en gekoelde media voor het doseren.

2. bereiding van de anaerobe kamer en het vereiste materiaal

  1. Houd alle materialen, oplossingen en hulpmiddelen die nodig zijn voor het fermentatie-experiment binnen de anaerobe kamer ten minste 48 uur vóór de aanvang van het experiment, om ervoor te zorgen dat eventuele rest zuurstof in verband met gereedschappen en oplosbare zuurstof in buffers/oplossingen verwijderd en alle materialen worden geacclimatiseerd op de ingestelde anaerobe condities.
    Opmerking: Benodigde materialen in de anaerobe kamer (48 h eerder van het experiment om te starten): i) fermentatie media; II) anaerobe oplossing (bereid overeenkomstig punt 4,1), III) vortexer, (IV) Weeg balans, (v) mousseline kaas doeken, (VI) schaar, (VII) trechter, (VIII) 1,5, 2,0, 15, 50 ml buizen, (IX) Pipet (2, 20, 200 en 1.000 μL) en compatibele pipetpunten, (x) pistool Pipet en pipets (5 en 10 mL), (XI) papier weefsels, (XII) markers, (XIII) buis staat voor verschillende buizen, (XIV) afvalbak, (XV) O2 indicator en (xvi) 70% ethanol spuitfles (ontsmettingsmiddel).

3. bereiding van buizen en vezels

  1. Gewicht 300 mg inuline en overdracht naar een buis van 50 mL gevolgd door de aseptisch optellen van 26 mL fermentatie media die reeds zijn voorbereid en opgeslagen in de anaerobe kamer. Bereid een lege buis voor elk fecaal monster type en experimentele buis (en) (volgens het aantal verbindingen dat wordt getest), in drievand.
  2. Laat deze buizen in de anaerobe kamer gedurende ongeveer 24 uur om de hydratatie van monsters te laten voordat het fermentatie experiment begint. Zorg ervoor dat de buistemperatuur 37 °C is op het moment van de inoculatie, breng de buisjes dan in de incubator die zich in de anaerobe kamer bevindt.

4. bereiding van het entmateriaal

  1. Anaerobe verdunnings oplossing (ten minste 48 h voor fermentatie-experiment): Los 5 g NaCl, 2 g glucose en 0,3 g cysteïne-HCl op in gedeïoniseerd water en maak een totaal volume tot 1.000 mL. Autoclaaf en bewaar het in de anaerobe kamer ten minste 48 uur voor gebruik.
  2. Fecale entmateriaal preparaat (op de dag van de fermentatie-experiment): Weeg 5 g vers fecaal monster in een conische buis van 50 ml, voeg een anaerobe verdunnings oplossing toe voor een eindvolume van 50 ml (1:10 w/v) en Vortex gedurende 15 min of tot volledig gehomogeniseerd. Filtreer het gehomogeniseerde mengsel door 4 lagen steriele kaasdoek (autoclaved) en gebruik het onmiddellijk voor de inoculatie in de buisjes met media.
    Opmerking: De fecale monsters van een groep van onderwerpen kunnen worden gegroepeerd als het experimentele doel is om het effect van een bepaalde samengestelde/ingrediënt op algehele gezonde versus zieke fecale microbiota in het algemeen te vergelijken.

5. fermentatie en bemonstering

  1. Bereid buizen volgens de paragraaf 4,2 en inoculeren blanco/controle en experimentele buizen met 4 mL verdund en gefilterd fecaal entmateriaal. Incuberen de inocculeerde buisjes bij 37 °C in de anaerobe kamer. Schud de buizen eenmaal per uur door zachtjes om te keren om de vezels en het entmateriaal opnieuw op te schorten.
  2. Verzamel zo vaak als nodig monsters, bijvoorbeeld uur tot 0, 3, 6, 9 en 24 uur tijdens de fermentatie, door een 2 mL aliquot-monster uit te nemen in een buis van 2 mL van de respectieve vergistings buizen.
  3. Meet de pH van de aliquots met behulp van een pH-meter in het laboratorium (door de pH-elektrode rechtstreeks in het monster te plaatsen); Centrifugeer het resterende monster bij 14.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c. Onmiddellijk bevriezen van de supernatant en pellet in vloeibare stikstof, en na snap bevriezing, bewaar de supernatant voor SCFAs analyse en pellet voor microbiome analyse bij-80 °C.

6. korte keten vetzuren (SCFAs) en lactaat kwantificering

Opmerking: De scfas en lactaat in de supernatant van microbiome cultuur kunnen exact worden gemeten volgens de methoden die elders13,14,15,16worden beschreven.

  1. In het kort het ontdooien van de in rubriek 5 verkregen bevroren supernatanten uit controle-en behandelings monsters op ijs en voert alle verdere verwerkingsstappen op ijs uit. Filtreer de supernatant door een membraanfilter van 0,45 μm en gebruik de celvrije monsters om de concentraties van SCFAs en lactaat te meten met behulp van een HPLC-systeem met vader detector bij 210 Nm, uitgerust met een HPX-87H-kolom. Gebruik voor elk monster een injectievolume van 10 μL en gebruik H2, dus4 (0,005 N) om de kolom te elzen met een debiet van 0,6 mL/min bij 35 °c.

7. fecale Microbiome analyse

Opmerking: Voer microbiome analyse volgens de methoden en pijplijn gedetailleerd elders7,13,14,17.

  1. Kort, extract genomische DNA van ongeveer 200 mg fecale slurry pellets met behulp van een fecale DNA-extractie Kit13.
  2. Versterk het hypervariabele gebied van het bacteriële 16s rRNA-gen met behulp van de met primers volgens de methode die elders wordt beschreven13, met behulp van de primer sequenties zoals beschreven in het Earth microbiome project protocol18.
  3. Reinig de resulterende amplicons met magnetische zuiverings kralen en kwantificeer door Picogreen of een gelijkwaardige methode. Zwembad de gezuiverde PCR-producten in gelijke Molaire concentratie en volgorde op een sequencer13.
  4. Verwerk de resulterende sequenties voor de-multiplexing, Quality filtering en clustering, taxonomische toewijzing en rarefactie, en downstream analyses door gebruik te maken van de kwantitatieve inzichten in microbiële ecologie (QIIME) software volgens de methoden die worden beschreven door Caporaso et al.19.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol wordt gebruikt om het effect van een specifiek prebioticum (d.w.z. inuline op de microbiota-samenstelling en metabolische activiteiten in termen van veranderingen in de fecale pH en de concentratie van lactaat en SCFAs in de uitwerpselen van gezonde menselijke proefpersonen over verschillende tijdspunten na behandeling met inuline). De fecale pH, de fecale niveaus van lactaat en SCFAs (Figuur 1) en de microbiota-samenstelling (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De in vitro fecale slurry fermentatie model hier gepresenteerd is een eenvoudige single-batch model om de effecten van verschillende substraten en microbiële stammen (bijvoorbeeld prebiotica en probiotica) op de samenstelling van menselijke fecale microbiota evenals haar metabole activiteiten in termen van fecale pH en SCFAs niveaus. De hierin gepresenteerde resultaten tonen aan dat de inoculatie van inuline de fecale pH vermindert en de niveaus van SCFAs en lactaat in inuline behandelde fecale specimen aanzienlijk verho...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs geven dankbaar steun aan de financiering van het centrum voor diabetes, obesitas en metabolisme en het klinisch en translationeel wetenschapscentrum, de Wake Forest School of Medicine, het ministerie van defensie financiering (subsidie nummer: W81XWH-18-1-0118), de Kermit Glenn Phillips II stoel in cardiovasculaire geneeskunde; de National Institutes of Health gefinancierd Claude D. Pepper oudere Amerikanen Center (gefinancierd door P30AG12232); R01AG18915; R01DK114224 en het klinisch en translationeel wetenschapscentrum (Clinical Research Unit, gefinancierd door UL1TR001420), wordt ook gelukkig erkend. We bedanken ook de vrijwilligers voor het verstrekken van fecale monsters, en onze andere Lab leden voor hun technische helpt tijdens dit experiment.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Ammonium Bicarbonate (NH4HCO3)Sigma-Aldrich217255
Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 TGIC2388Toxisch
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2•2H2O)Sigma-AldrichC3306Iriterend
Cobaltous Chloride Hexahydrate (CoCl2•6H2O)Sigma-Aldrich255599
Cupric Chloride Dihydrate (CuCl2•2H2O)Acros organics2063450000Toxisch, Irriterend
Cysteine-HClSigma-AldrichC121800
D-biotinSigma-AldrichB4501
D-Pantothenic acidAlfa AesarA16609
Disodium Ethylenediaminetetraacetate Dihydrate (Na2EDTA)Biorad1610729
DL-α-methylbutyrateSigma-AldrichW271918
Ferrous Sulfate Heptahydrate (FeSO4•7H2O)Sigma-AldrichF8263Toxisch
Folic acidAlfa AesarJ62937
GlucoseSigma-AldrichG8270
HeminSigma-AldrichH9039
HepesAlfa AesarA14777
IsobutyrateAlfa AesarL04038
IsovalerateAlfa AesarA18642
Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2•6H2O)Sigma-AldrichM8266
Manganese Chloride Tetrahydrate (MnCl2•4H2O)Sigma-Aldrich221279
Niacin (Nicotinic acid)Sigma-AldrichN4126
Nickel(Ii) Chloride Hexahydrate (NiCl2•6H2O)Alfa AesarA14366Toxisch
N-valerateSigma-Aldrich240370
P-aminobenzoic acidMP China102569Toxisch, Irriterend
Phosphoric Acid (H3PO4)Sigma-AldrichP5811
Potassium Dihydrogen Phosphate (KH2PO4)Sigma-AldrichP5504
Potassium Hydrogen Phosphate (K2HPO4)Sigma-Aldrich1551128
PyridoxineAlfa AesarA12041
ResazurinSigma-AldrichR7017
RiboflavinAlfa AesarA11764
Sodium carbonate (Na2CO3)Sigma-Aldrich1613757
Sodium chloride (NaCl)Fisher BioReagents7647-14-5
Sodium hydroxide (NaOH)Fisher ChemicalsS320
Sodium Molybdate Dihydrate (Na2MoO4•2H2O)Acros organics206375000
Thiamine Hydrochloride (Thiamin-HCl)Acros organics148991000
TrypticaseBD Biosciences211921
Vitamin B12Sigma-AldrichV2876
Yeast extractSigma-Aldrich70161
Zinc Sulfate Heptahydrate (ZnSO4•7H2O)Sigma-AldrichZ0251
0.22 µm membrane filter
AMPure magnetic purification beadsAgencourt
Anaerobic chamber with incubatoreForma anaerobic system, Thermo Scientific, USA
Bottle filterCorning
Cheesecloth
Illumina MiSeq sequencerMiseq reagent kit v3
pH meter
Qiagen PowerFecal kitQiagen
Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) software
Qubit-3 fluorimeterInVitrogen
VortexThermoscientific
Waters-2695 Alliance HPLC systemWaters Corporation

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shreiner, A. B., Kao, J. Y., Young, V. B. The gut microbiome in health and in disease. Current Opinion in Gastroenterology. 31 (1), 69-75 (2015).
  2. Xu, Z., Knight, R. Dietary effects on human gut microbiome diversity. British Journal of Nutrition. 113, 1-5 (2015).
  3. Jiang, C., Li, G., Huang, P., Liu, Z., Zhao, B. The gut microbiota and Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimers Disease. 58 (1), 1-15 (2017).
  4. Clemente, J. C., Ursell, L. K., Parfrey, L. W., Knight, R. The impact of the gut microbiota on human health: an integrative view. The Journal Cell. 148 (6), 1258-1270 (2012).
  5. Yadav, H., Jain, S., Marotta, F. Probiotics mediated modulation of gut flora might be biotherapeutical approach obesity and type 2 diabetes. Metabolomics : Open Access. 1 (3), 1-3 (2011).
  6. Ahmadi, S., et al. Dietary Polysaccharides in the Amelioration of Gut Microbiome Dysbiosis and Metabolic Diseases. Obesity and Control Theries: Open Access. 4 (3), (2017).
  7. Nagpal, R., et al. Obesity-Linked Gut Microbiome Dysbiosis Associated with Derangements in Gut Permeability and Intestinal Cellular Homeostasis Independent of Diet. Journal of Diabetes Research. , 1-9 (2018).
  8. Paul, B., et al. Influences of diet and the gut microbiome on epigenetic modulation in cancer and other diseases. Journal of Clinical Epigenetics. 7 (1), 112(2015).
  9. O’mahony, S., Clarke, G., Borre, Y., Dinan, T., Cryan, J. Serotonin tryptophan metabolism and the brain-gut-microbiome axis. Journal of Behavioural Brain Research. 277, 32-48 (2015).
  10. Sharon, G., et al. Specialized metabolites from the microbiome in health and disease. Journal of Cell Metabolism. 20 (5), 719-730 (2014).
  11. Faber, T. A., Bauer, L. L., Price, N. P., Hopkins, A. C., Fahey, G. C. In vitro digestion and fermentation characteristics of temulose molasses, a coproduct of fiberboard production, and select temulose fractions using canine fecal inoculum. Journal of Agricultural Food Chemistry. 59 (5), 1847-1853 (2011).
  12. Bourquin, L. D., Titgemeyer, E. C., Fahey, G. C. Vegetable fiber fermentation by human fecal bacteria: cell wall polysaccharide disappearance and short-chain fatty acid production during in vitro fermentation and water-holding capacity of unfermented residues. Journal of Nutrition. 123 (5), 860-869 (1993).
  13. Nagpal, R., et al. Human-origin probiotic cocktail increases short-chain fatty acid production via modulation of mice and human gut microbiome. Scientific Reports. 8 (1), 12649(2018).
  14. Nagpal, R., et al. Comparative microbiome signatures and short-chain fatty acids in mouse, rat, non-human primate and human feces. Frontiers in Microbiology. 9, 2897(2018).
  15. Thangamani, S., Guinan, J., Wang, S., Yadav, H. Antibiotic-induced decreases in the levels of microbial-derived short-chain fatty acids promote gastrointestinal colonization of Candida albicans. bioRxiv. , 428474(2018).
  16. Ahmadi, S., et al. Prebiotics from acorn and sago prevent high-fat diet-induced insulin resistance via microbiome-gut-brain axis modulation. The Journal of Nutritional Biochemistry. , (2019).
  17. Nagpal, R., et al. Gut Microbiome Composition in Non-human Primates Consuming a Western or Mediterranean Diet. Frontiers in Nutrition. 5, 28(2018).
  18. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME Journal. 6 (8), 1621-1624 (2012).
  19. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
  20. Garcia-Villalba, R., et al. Alternative method for gas chromatography-mass spectrometry analysis of short-chain fatty acids in faecal samples. Journal of Seperation Science. 35 (15), 1906-1913 (2012).
  21. Lee, C. H., et al. Frozen vs Fresh Fecal Microbiota Transplantation and Clinical Resolution of Diarrhea in Patients With Recurrent Clostridium difficile Infection: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 315 (2), 142-149 (2016).
  22. Chen, M. -H., et al. In vitro fermentation of xylooligosaccharides produced from Miscanthus× giganteus by human fecal microbiota. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64 (1), 262-267 (2015).
  23. Cook, S., Sellin, J. Short chain fatty acids in health and disease. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 12 (6), 499-507 (1998).
  24. Rastelli, M., Knauf, C., Cani, P. D. Gut microbes and health: a focus on the mechanisms linking microbes, obesity, and related disorders. Obesity. 26 (5), 792-800 (2018).
  25. Zou, J., et al. Fiber-mediated nourishment of gut microbiota protects against diet-induced obesity by restoring IL-22-mediated colonic health. Cell Host & Microbe. 23 (1), e44 41-53 (2018).
  26. Dinan, T. G., Cryan, J. F. Gut–brain axis in 2016: Brain–gut–microbiota axis—mood, metabolism and behaviour. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (2), 69(2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Kweek van fecale microbiotamodulatoren van het darmmicrobioomanaerobe kamerconditiesanalyse van kortketenvetzurenanalyse van de samenstelling van het microbioombereiding van fecaal inoculumeffecten van inuline prebioticaaseptisch techniekprotocolmeting van de fecale pH

Gerelateerde artikelen