Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Gecontroleerde corticale impact model van muis hersenletsel met therapeutische transplantatie van menselijk geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide neurale cellen

10.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59561

⸱

10 juli 2019

 ,  , 
1Center for Neuroscience and Regenerative Medicine, Uniformed Services University, 2Department of Anatomy, Physiology, and Genetics, Uniformed Services University, 3Graduate Program in Neuroscience, Uniformed Services University

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol demonstreert methodologieën voor een muismodel van open-schedel traumatisch hersenletsel en transplantatie van gekweekte menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cellen in de wond site. Gedrags-en histologische tests van uitkomsten van deze procedures worden ook in het kort beschreven.

Samenvatting

Traumatisch hersenletsel (TBI) is een leidende oorzaak van morbiditeit en sterfte wereldwijd. Ziekte pathologie als gevolg van TBI vordert van de primaire mechanische belediging tot secundaire letsel processen, met inbegrip van apoptosis en ontsteking. Animal Modeling is waardevol geweest in de zoektocht naar het ontrafelen van letsel mechanismen en het evalueren van potentiële neuroprotectieve therapieën. Dit protocol beschrijft het gecontroleerde corticale impact (CCI) model van focal, open-Head TBI. Specifiek worden parameters voor het produceren van een milde eenzijdige corticale verwonding beschreven. De gedrags gevolgen van CCI worden geanalyseerd met behulp van de kleefband verwijderings test van bilaterale sensorimotorische integratie. Met betrekking tot experimentele therapie voor TBI pathologie, dit protocol illustreert ook een proces voor het verplanten van gekweekte cellen in de hersenen. Neurale celculturen afgeleid van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) werden gekozen voor hun potentieel om superieure functionele restauratie bij humane TBI-patiënten te vertonen. Chronische overleving van hiPSCs in de gastheer muis hersenweefsel wordt gedetecteerd met behulp van een gemodificeerde DAB immunohistochemisch proces.

Inleiding

Traumatisch hersenletsel (TBI) is een algemene term voor de verworven verwonding aan de hersenen als gevolg van ofwel indirecte mechanische krachten (rotatie versnelling/vertraging of contra coup) van slagen naar het hoofd of directe schade van objecten of Blast golven. Er wordt geschat dat TBI de oorzaak is van ruwweg 9% van de wereldwijde sterfgevallen en in een geschatte 50.000.000 jaar1,2wordt waargenomen. Een 2017 rapport van de centra voor ziektebestrijding en preventie geschat dat in 2013, waren er in totaal 2.800.000 ziekenhuis bezoeken en sterfgevallen als gevolg van TBI in de Verenigde Staten3. Veel mildere TBIs gaan elk jaar ongerapporteerd. Ernstige TBI kan leiden tot levenslange verslechtering van de cognitie, motorische functie, en de algehele kwaliteit van leven. De gevolgen van milde TBI, vooral repetitieve sportgerelateerde TBI, zijn pas onlangs gewaardeerd voor hun verraderlijke gezondheidseffecten4,5.

Preklinische modellering is een essentieel onderdeel van het ontwikkelen van nieuwe mechanistische inzichten en mogelijke herstellende therapie voor TBI. Het gecontroleerde corticale impact (CCI) model van TBI is een open-Head model van mechanische contusie letsel aan de cortex. De impact parameters kunnen worden aangepast om CCI letsels te produceren die variëren van mild tot ernstig6. CCI-verwondingen zijn eerder brand in plaats van diffuus, zoals te zien is bij andere gesloten hoofdmodellen van TBI. CCI kan worden uitgevoerd om een eenzijdige verwonding te induceren, zodat de contralaterale cortex kan dienen als een interne comparator. Dit protocol toont de kenmerken van een milde CCI aan een deel van de cortex dat primaire somatosensorische en motorische regio's omvat. Dit corticale gebied werd gekozen voor zijn betrokkenheid bij sensorimotorische gedragingen waarvoor talrijke gedrags tests letsel-geïnduceerde tekorten7kunnen detecteren. Gedrags verbeteringen als gevolg van therapeutische interventies voor TBI kunnen ook worden gedetecteerd.

Een kenmerk van TBI is wijdverspreide neurale disfunctie in de benadeelde regio. Gewonde neuronen ondergaan celdood, en neuronale netwerkconnectiviteit wordt verstoord8,9. TBI verstoort de werving van endogene stamcellen, wat leidt tot verder stroomafwaarts gedrag tekorten10,11.  Transplantatie van neurale stamcellen en stamcel-afgeleide cellen is onderzocht als een mogelijkheid om te herstellen van de functie in de gewonde hersenen. Naast het potentieel om beschadigde neurale circuits te herstellen, kunnen getransplanteerde cellen paracrine-effecten uitoefenen die neuronale overleving en functioneel herstel van TBI12bevorderen. Een verscheidenheid van celtypen zijn preclinically getransplanteerd om hun herstellende potentieel te evalueren in modellen van neurologische aandoeningen13,14,15. De recente popularisatie van geïnduceerde pluripotente stamceltechnologie16 heeft de ontwikkeling van talrijke menselijke stamcellijnen voor experimenteel gebruik vergemakkelijkt. Preklinisch onderzoek met hiPSC-afgeleide cellen is een belangrijke eerste stap om de potentiële therapeutische werkzaamheid van een bepaalde cellijn tegen menselijke ziektes te karakteriseren. Dit laboratorium heeft protocollen ontwikkeld om hiPSCs te differentiëren naar neurale fenotypes17 in het nastreven van transplanteer bare cellen om herstel van traumatisch hersenletsel te helpen.

Experimenten in dit protocol gebruiken een unilaterale CCI om TBI te induceren naar de linker somatosensorische en motorische cortex van volwassen muizen. Een milde CCI-blessure resulteert in een langdurig functioneel tekort in de rechter voorpoot dat wordt gebruikt om de effecten van de door hiPSC afgeleide neurale cel-engraftment op functioneel herstel bij te houden. Forepaw sensomotorische testen in dit protocol werd aangepast aan de methodologie van Bouet en collega's18 en werd eerder gedemonstreerd door Fleming en collega's19.  Dit protocol schetst een complete workflow voor het uitvoeren van een experimenteel hersenletsel, therapeutische transplantatie van heup cellen en gedrags-en histologische analyse van experimentele uitkomst maatregelen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimenten beschreven in dit protocol zijn beoordeeld en goedgekeurd door de uniformed Services University dierenverzorging en-gebruik Comité.

1. craniectomie en gecontroleerde corticale impact

  1. Voorbereiding van het gecontroleerde corticale effectapparaat en chirurgische benodigdheden.
    1. Laad een 1 mL slip-Tip spuit met 0,5 mL steriele zoutoplossing voor wond irrigatie. Bevestig een 25 G naald aan de spuit om de irrigatie te regelen.
    2. Bereid een verdunde oplossing van CsA in DMSO tot de uiteindelijke concentratie van 1 mg/mL. Laad een tweede 1 ml slip-Tip spuit met 0,5 ml ciclosporine a (CSA) oplossing voor immunosuppressie. Bevestig een 25 G naald of groter aan de CsA-spuit.
    3. Bevestig de gecontroleerde corticale impact zuiger aan een arm op een stereotaxic frame en stel deze in op een hoek van 15 °. Bevestig een 3 mm botslichaam probe aan de zuiger.
    4. Stel de snelheid van de botsing in op 1,5 m/s en de impact dwelltijd tot 0,1 s om een milde corticale verwonding te produceren.
  2. Een unilaterale craniectomie uitvoeren
    1. Plaats de muis in een anesthesie-inductie kamer aangesloten op een Isofluraan vaporizer met gecomprimeerde zuurstofbron. Induceren van anesthesie met ~ 3% Isofluraan op ~ 0,7 L/min zuurstof. Controleer op de diepte van de anesthesie door het gebrek aan reactie op de teen-pinch.
    2. Scheer de hoofdhuid met behulp van elektrische tondeuses en veeg elke losse vacht weg.
    3. Plaats de muis in een stereotaxic frame met bijgevoegde anestheticum levering neuskegel.
      1. Plaats een verwarmingspad ingesteld op 37 °C op het stereotaxus frame onder de muis om de lichaamstemperatuur onder anesthesie te behouden. Bevestig het hoofd op zijn plaats met oorstangen en een beet stang en oriënteer het hoofd zodanig dat de schedel frontale bot horizontaal is. Onderhoud anesthesie bij ~ 1.5%-2% Isofluraan voor de duur van de operatie.
    4. Om preoperatieve zorg en aseptische chirurgische voorbereiding uit te voeren, breng antibiotische oftalmische zalf aan op de ogen met behulp van een steriel wattenstaafje. Breng een oplossing op basis van jodium op de geschoren hoofdhuid gebied. Verwijder dit met 70% ethanol. Bedek het dier met een fenestrated chirurgische draperen zodat de bovenkant van het hoofd zichtbaar is, maar de ogen bedekt zijn.
    5. Maak een middenlijn incisie (1.5-2 cm) op de hoofdhuid met behulp van een scalpel of een schaar.  Gebruik steriele wattenstaafjes om de wond schoon te maken en de fascia links van de middenlijn bij bregma te wissen.
    6. Gebruik de botslichaam sonde om de craniectomie-plaats te identificeren.
      1. Stel het stereotaxic referentiepunt (X = 0, Y = 0) in op bregma.  Stel de sonde lateraal in op 2 mm links van de middenlijn. Schets een cirkel met een diameter van 5 mm rond de sonde met een chirurgisch veilige marker met fijne punt. Til het botslichaam omhoog en draai het uit de positie.
    7. Gebruik de High-Speed Rotary Micromotor Kit hand tool om een open gat in de schedel met behulp van een ronde-Tip 0,6 mm of 0,8 mm Burr boor op ~ 70%-80% maximale snelheid. Breng licht druk aan op de schedel tijdens het boren langs de omtrek van 5 mm om deze grens te dun.
      1. Breng geen overdruk aan tijdens het boren. Dit kan leiden tot corticale letsels als gevolg van trillingen, compressie of accidentele penetratie. Laat de snelheid van de boor om het werk te doen.
      2. Boor niet te lang op een bepaalde plek om overmatige wrijving verwarming van de schedel te voorkomen. Irrigeren de craniectomie af en toe met steriele zoutoplossing om vuil te verwijderen en de verwarming van het roterende gereedschap te verminderen.
      3. Let op bij het boren over de coronale hecht lijn omdat deze punten kwetsbaar zijn voor bloedingen.
    8. Gebruik een paar fijne pincet om de schedel flap te verwijderen wanneer de craniectomie-omtrek voldoende is uitgedund. Pak de flap medially, en til en trek lateraal met een radiale beweging.
      1. De dura mater niet beschadigen bij het optillen van de klep; Dit kan leiden tot ernstig letsel en hemorrhaging.
  3. Voer een mild gecontroleerd corticale effect letsel uit
    1. Reinig de botslichaam met een steriel alcohol preparatiepad. Beweeg de botslichaam sonde terug in positie over de blootgestelde cortex. Verlaag de sonde tot het oppervlak van de dura mater raakt. Markeer deze positie als Z = 0.
    2. Trek de zuiger uit en beweeg naar Z =-1,0 mm. Ontlaad de zuiger om de cortex te beïnvloeden.
    3. Til de zuiger snel op en beweeg de arm uit de positie. Breng royale hoeveelheden zoutoplossing om de cortex na letsel te irrigeren. Spoel de operatieplaats met zoutoplossing indien nodig en hecht aan de hoofdhuid incisie met behulp van eenvoudige onderbroken stiksels met 5,0 zijde hecht.
  4. Voer postoperatieve zorg uit op de muis
    1. Stoppen met anesthesie. Lever CsA door subcutane injectie in Scruff bij een dosis van 10 mg/kg. Plaats de muis in een schone en voorverwarmde postoperatieve kooi.
    2. Geef paracetamol pijnstiller in het drinkwater bij 1,0 mg/mL.
      Opmerking: zorg voor analgesie volgens de juiste IACUC-standaard operating procedure en in overweging van experimentele uitkomst variabelen (bijv. sedatie, neuro ontsteking).
    3. Zorg voor bevochtigd Chow voedsel in een opgewarmde herstel kooi om te helpen bij rehydratatie en herstel.
  5. Ga verder van sectie 2 naar sectie 4 hierboven bij het uitvoeren van craniectomie-only (Sham) besturingselementen.

2. stereotaxic transplantatie van celsuspensie

  1. Begin van de celtransplantatie procedure ongeveer 24 uur na craniectomie.
  2. Bereid de celtransplantatie apparatuur en chirurgische benodigdheden
    1. Vul een 1 mL slip-Tip spuit met steriele zoutoplossing voor wond irrigatie. Bevestig een 25 G naald aan de spuit om de irrigatie te regelen.
    2. Vul een 1 mL slip-Tip spuit met CsA-oplossing voor immunosuppressie. Bevestig een 25 G naald of groter aan de CsA-spuit. Vul de CsA-spuit zo nodig in tussen operaties.
    3. Maak met behulp van standaardmethoden glazen naalden van 1,0 mm OD borosilicaatglas capillaire pipetten.
    4. Gebruik fijne pincet om de naald uiteinden te breken tot ongeveer een diameter van 200 μm. Zorg ervoor dat de cilindrische schacht van de naald niet langer is dan 2,5 cm.
  3. Kalibreer de spuitpomp voor gebruik met een spuit van 10 μL.  Voer een debiet van 0,2 μL/min in om een totaal volume van 2,0 μL te leveren.
  4. Bereid de door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) suspensie.
    1. Voer alle celverwerking uit in een celkweek BSL-2 kap met behulp van standaard steriele behandelingstechnieken.
    2. Bereid celculturen vooraf in volgens de standaardvoorwaarden die voor het celtype zijn gedefinieerd. Zie Lischka et al.17 als voorbeeld.
      Opmerking: experimenten die in deze demonstratie worden getoond, gebruikten verschillende neurale fenotype cellen die zijn afgeleid van hiPSCs.
    3. De cellen zachtjes ontkoppelen in een eencellige suspensie met behulp van een cel loslating oplossing, of andere voorkeur enzymatische of chemische middelen.
    4. Tel cellen in suspensie en Verdun de suspensie vervolgens tot 5 x 104 cellen/μL in een minimaal celkweekmedium (BIJV. DMEM) in een 1,7 ml-test buis met flip-top.
    5. Let op de volgende aantekeningen voor transplantatie:
      1. Houd de cellen in suspensie bij 37 °C gedurende de duur van de procedures.
      2. Plaats de spuit alleen onmiddellijk voorafgaand aan het uitvoeren van de intraparenchymale injectie (stap 4,5 hieronder).
        Opmerking: de zwaartekracht kan ervoor zorgen dat de celsuspensie zich afdoet of vastklampen aan de zijkant van de spuit als deze op zijn zijkant wordt gelegd. Dit leidt tot onregelmatigheden in het aantal geïnjecteerde cellen.
      3. Allot ~ 5 x 105 cellen (10 μL suspensie) per muis bij het uitvoeren van meerdere celtransplantatie procedures in één dag.
  5. Uitvoeren van stereotaxic transplantatie chirurgie
    1. Plaats de muis in een anesthesie-inductie kamer aangesloten op een Isofluraan vaporizer met gecomprimeerde zuurstofbron. Induceren van anesthesie met ~ 3% Isofluraan op ~ 0,7 L/min zuurstof.
    2. Plaats de muis in een stereotaxic frame met bijgevoegde verdovings neuskegel.
      1. Bevestig het hoofd op zijn plaats met oorstangen en een beet stang en oriënteer het hoofd zodanig dat de schedel frontale bot horizontaal is. Onderhoud anesthesie bij ~ 1.5%-2% Isofluraan voor de duur van de operatie.
    3. Preoperatieve zorg en aseptische voorbereiding uitvoeren
      1. Breng hydraterende oftalmische zalf met antibioticum aan op de ogen met een wattenstaafje.
      2. Lavage de incisieplaats met steriele zoutoplossing om de site schoon te maken en om hechtingen los te maken. Breng 70% ethanol voorzichtig aan met een wattenstaafje om de incisieplaats te steriliseren.
    4. Verwijder hechtingen met behulp van fijne pincet en oogheelkundige schaar. Irrigate chirurgie site en craniectomie met overvloedige steriele zoutoplossing.
      1. Overweeg het dier voor uitsluiting als de cortex diskwalificeren vertoont, waaronder overmatige herniatie, verkleuring, verstoorde vascularisatie of bloeding.
    5. Laad de doseerspuit voor de celtransplantatie
      1. Verplaats celsuspensie van de 37 ° c incubator naar een celkweek bioveiligheidskap. Zwenk of tik zachtjes op de buis om een homogene celsuspensie te garanderen.
      2. Gebruik een micro pipet om de celsuspensie van ~ 7,5 μL in de Hamilton-spuit door het uiteinde van de zuiger te laden.
        1. Houd de spuit in een hoek van ~ 120 ° met het uiteinde van de zuiger naar beneden gericht. Steek de zuiger in en zorg dat u geen luchtbel tussen de suspensie en de zuiger punt introduceert.
      3. Bevestig de pakking aan de pipet naald en bevestig de naald aan de spuit.
      4. Duw de zuiger in om de celsuspensie in de pipet naald te verplaatsen.  Als er weerstand tegen de uitstroom van de suspensie is, gebruik dan fijne pincet om de naaldpunt te breken om de diameter te vergroten.
    6. Bevestig de spuit aan de stereotaxic spuitpomp.  Breng de zuiger naar voren om er zeker van te zijn dat het montage van de spuitpomp goed werkt.
    7. Beweeg de naald in de coördinaten voor de injectie.
      1. Lijn de punt van de naald uit tot bregma. Stel de X-en Y-coördinaten in op 0. Beweeg vervolgens de naaldpunt over de craniectomie tot 2,0 mm laterale en-1,0 mm posterieure naar bregma.  Raak de punt van de naald aan het oppervlak van de dura mater en stel de stereotaxic coördinaat in op Z = 0.
      2. Duw de zuiger om ervoor te zorgen dat de celsuspensie voldoende stroomt voordat de naald in de hersenen wordt gebracht.
      3. Introduceer de naald in de hersenen tot een diepte van Z =-1,4 mm. Deze stereotaxic coördinaten plaatsen de Graft op de grijze materie-witte materie grens van de diepe cortex20.
    8. Start de spuitpomp om de celsuspensie te bezielen. Stel de labwerkbank timer in op 15 minuten en start de timer. Gebruik een lange werkafstand Microscoop om de uitstroom van de celsuspensie te bewaken.
      1. Irrigeren de operatieplaats met steriele zoutoplossing tijdens de injectie om weefsel hydratatie te behouden.
      2. Op 15 min, Trek langzaam de transplantatie naald.  Irrigeren de operatieplaats met zoutoplossing en sluit de incisie met hechtingen.
    9. Postoperatieve zorg uitvoeren
      1. Stoppen met anesthesie. Lever CsA door subcutane injectie in Scruff bij een dosis van 10 mg/kg. Plaats de muis in een schone en voorverwarmde postoperatieve kooi.
      2. Geef paracetamol pijnstiller in het drinkwater bij 1,0 mg/mL.
        Opmerking: zorg voor analgesie volgens het juiste IACUC standaard operating Protocol (SOP) en in overweging van experimentele uitkomst variabelen.
      3. Verstrek bevochtigde Chow voedsel herstel kooi om te helpen bij rehydratatie en herstel.
  6. Doorgaan met dagelijkse CsA-injecties op 10 mg/kg gedurende de overlevingsduur van de muis.

3. zelfklevende tape verwijderings test van sensorimotorische integratie

  1. Knip de elektrische tape in strips van 3 mm x 5 mm met behulp van een klein scheermesje voordat je de gedrags test uitvoert. Gebruik een glad glazen oppervlak voor het snijden van de zelfklevende strips.
    Opmerking: gebruik gele en rode tape, omdat muizen moeite hebben om onderscheid te maken tussen deze kleuren21.
    1. Kies een kleine spiegel die goed in de doorzichtige plastic doos past.
      1. Bevestig de spiegel op zijn plaats op een ruwweg 45 ° hoek met modelleer klei of plakband om het gedrag van dieren van onderaf te bekijken.
    2. Plaats de doos en spiegelmontage op een bank in een rustige speciale gedrags testkamer.  Regel de cilinder op de plastic doos boven de spiegel.
    3. Regel de handling doek, pincet en zelfklevende strips op de Bank naast de gedrags test doos.
    4. Reinig de doos en cilinder met 70% ethanol en papieren handdoeken.  Laat oppervlakken grondig drogen.
    5. Breng de muizen in de gedrags testkamer. Laat de muizen ten minste 30 minuten vóór het testen van het gedrag aan de testruimte acclimeren.
    6. Verwijder de watertoevoer van de kooien om het urineren te minimaliseren tijdens het testen, wat de efficiënte test prestaties kan verstoren.
  2. Voer de lijm verwijderings test uit
    Opmerking: deze gedrags test wordt het best uitgevoerd door twee tot drie onderzoekers: één om de stopwatches te bedienen, en één of twee om de muizen te behandelen en het gedrag te observeren.
    1. Gebruik elke pincet om één kleefstrook van elke kleur te schillen.
      1. Kiezen welke strip kleur overeenkomt met welke forepaw en consistent blijven gedurende de hele proef.
    2. Gebruik de handling doek om een muis te rebelasten door de Scruff van de nek en terug zodat de muis de voorpoten van zijn lichaam en hoofd houdt.
    3. Gebruik pincet om een Kleefstrip op het plantaire-oppervlak van elk voorpoot te plaatsen. Gebruik delicate en consistente vingerdruk om de stroken aan de poten vast te zetten.
    4. Plaats de muis snel in de plastic cilinder. Start de twee stopwatches wanneer de muis alle vier de poten op de plastic doos heeft.
    5. Gebruik de twee stopwatches om op te nemen van de latentie voor de volgende vier gebeurtenissen: linker paw kennisgeving, linker poot verwijderen, rechterpoot kennisgeving, rechterpoot verwijderen.
      1. Noteer een opzeggings gebeurtenis wanneer het dier een eenduidige herkenning van de kleefstrook maakt door het poot of de strook te schudden of te stoppen.
      2. Neem een gebeurtenis verwijderen wanneer het dier effectief verwijdert de strook van de voorpoot plantaire oppervlak.
        Opmerking: de gebeurtenis Remove wordt niet gediskwalificeerd door strip readherence of als de strook zich vastklom aan het laterale oppervlak van de voorpoot.
      3. Stop de timer op 120 s als de bijbehorende strook niet is verwijderd.
      4. Noteer de verstreken tijden voor de vier gebeurtenissen op het gegevensblad.
    6. Een tweede proefversie uitvoeren op elke muis
      1. Laat een minimum van 5 minuten verstrijken tussen de proeven voor een individuele muis om stress te verminderen, wat kan interfereren met efficiënte prestaties op de test.
      2. Reinig het apparaat met papieren handdoeken tussen het testen van muizen om afval te verwijderen bij het testen van meerdere muizen uit één kooi.
        1. Reinig het apparaat grondig met 70% ethanol en papieren handdoeken bij het testen van muizen uit meerdere kooien.
      3. De volgorde van de plaatsing van de kleur-paw voor de tweede proefversie van de sessie omkeren om elk effect van de kleur te randomiseren.
    7. Bereken de gemiddelde latentie van elke gebeurtenis tussen twee proeven per dagelijkse sessie voor elk dier.
  3. Reinig het apparaat en gebruik de doek grondig met water, vervang de watertoevoer van de kooi en breng de muizen terug naar hun vasthoud faciliteit.
  4. Herhaal stap 3.1-3.2 over de opeenvolgende experimentele tijdspunten voor een proef ontwerp met herhaalde maatregelen.
    Opmerking: Herhaal de stappen 3.2.1-3.2.5.3 dagelijks gedurende 5 dagen voorafgaand aan een gegevensverzameling om de dieren aan de taak te acclimeren. Baseline Data Acquisition voorafgaand aan de operatie wordt aanbevolen.

4. diaminobenzidine (DAB) immunohistochemische analyse van transplantaat overleving en letsel pathologie

  1. Euthaniseer de dieren en voer een transcardial perfusie.
    1. Bereid oplossingen van 0,1 M fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en 4% Paraformaldehyde (PFA) in PBS. Balanceer de pH van beide oplossingen tot 7,4.
    2. Zet de twee oplossingen op ijs in een rook afzuigkap. Plaats een peristaltische pomp in de dampkap en voer de pomp uit om de slang met PBS te vullen. Stel de pompdebiet in op ~ 7 ml/min.  Sluit een 25 G-naald aan op de uitstroom buis van de pomp.
    3. Plaats een drainage bakje met een zachte ondergrond in de capuchon. Til het ene uiteinde van de lade in een lichte hoek zodat perfusie vloeistoffen naar het onderste uiteinde vloeien.
    4. Plaats een muis in een anesthesie-inductie kamer. Vul de kamer met 4% Isofluraan met behulp van gecomprimeerd 100% zuurstof voertuig gas.
    5. Verplaats de verdoving muis van de kamer naar een anesthesie neuskegel. Verlaag de Isofluraan tot 2%.
    6. Voer een Thoracotomie uit om het hart bloot te leggen. Stop de anesthesie, omdat de Thoracotomie euthanasie veroorzaakt.
    7. Plaats de perfusie pomp uitstroom naald voorzichtig in de linker ventrikel langs de lange as van het hart. Niet doorboren het hart septum, als dit zal leiden tot slechte perfusie.
    8. Gebruik een kleine schaar om het juiste Atrium te knippen en zet de peristaltische pomp onmiddellijk aan.
    9. Ga door met de PBS-stroom totdat de vloeistof die het rechter Atrium verlaat, vrij van bloed stroomt.
      1. Zet de pomp uit. Verplaats de inlaatbuis van de pomp naar de container van PFA. Start de pomp opnieuw. Ga door met het gebruik van PFA totdat het dier voldoende stijf is of totdat er een volume van 20 mL doorheen is gepompt.
      2. Zet de pomp uit. Verwijder de uitstroom naald uit het hart. Beweeg de inlaatbuis van de PFA naar de PBS en spoel de PFA grondig uit van de slang.
  2. Verwijder de hersenen van de schedel door zorgvuldige dissectie. Plaats de hersenen in een kleine container gevuld met 4% Paraformaldehyde, en laat de hersenen na-Fix 's nachts bij 4 ° c.
  3. Op de dag na na fixatie, vervang de P door PBS en 0,1% natrium azide. Bewaar de hersenen in deze oplossing tot voorbereiding op histologische snijden.
  4. Verzamel 40-50 μm secties van formaldehyde-vast hersenweefsel via een ijskoude microtoom of kamertemperatuur vibratome.
  5. Voor behandeling van weefsels in 0,3% waterstofperoxide in water te inactiveren endogene peroxiasen, die niet-specifieke kleuring kan produceren.
  6. Voer geen antigeen-opvraging uit met citroenzuur buffer (10 mM Natriumcitraat, 0,05% Polysorbaat-20, pH 6,0) bij 60 °C gedurende 30 minuten.
  7. Voer antilichamen labelen volgens standaardmethoden.  Zie Lundell et al.' s verslag22 van dit laboratorium voor meer details.
    1. Gebruik een muis IgG neutralisatie-Kit (Zie tabel met materialen) om Kruisreactiviteit met endogene antilichamen te verminderen. Incuberen de weefsels in de IgG-neutralisatie buffer gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur (RT) volgens de aanwijzingen van de fabrikant.
    2. Gebruik een muis anti-humaan nucleair antigen primair antilichaam (hNA; 1:500 verdunning) bij het transplanteren van menselijke iPSC-afgeleide cellen om de getransplanteerde cellen te lokaliseren. Incuberen weefsels met het primaire antilichaam bij 4 °C gedurende 48-72 uur met zachte opwinding.
    3. Na het wegspoelen van de primaire antilichaam oplossing, incuberen weefsels met HRP-geconjugeerd anti-muis secundair antilichaam bij 1:250 verdunning voor 2 uur bij RT.
    4. Voer de DAB chromogeen-reactie uit met standaardmethoden om immunolabeling te onthullen. Laat de DAB-reactie gedurende 5 tot 10 minuten bij RT worden ontwikkeld.
  8. Bevestig gekleurde weefsels aan dia's en breng afdek stroken aan met behulp van standaardmethoden.
  9. Kwantificeer nummers van gelabelde cellen met behulp van onbevooroordeelde stereologie zoals eerder beschreven23,24. Voer een analyse uit met 20 μm optische secties en een tussen sectie interval van drie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Craniectomie chirurgie vergemakkelijkt experimenteel hersenletsel en therapeutische celtransplantatie: het gecontroleerde corticale effect model van hersenletsel en daaropvolgende transplantatie therapie vereisen zorgvuldige verwijdering van de bovenliggende schedel. De craniectomie kan worden uitgevoerd op elk dorsale oppervlak van de schedel om manipulaties toe te staan aan het hersengebied van belang. Het diagram in Figuur 1 toont een craniectomie-Schematische afbeelding ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Mild CCI als modelsysteem voor het testen van experimentele regeneratieve therapie
Het CCI-model is een waardevol hulpmiddel voor het onderzoeken van mechanismen van weefsel disfunctie na mechanisch letsel aan de cortex. De instelbaarheid van de blessure parameters is een aantrekkelijk kenmerk van dit model. Het veranderen van de Z-diepte van de impact, de snelheid of de verblijfstijd kan de ernst van het letsel verhogen of verlagen zoals gewenst door de onderzoeker10,

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door een subsidie van het centrum voor Neurowetenschappen en regeneratieve geneeskunde (CNRM, Grant Number G170244014). We waarderen de hulp van Mahima Dewan en Clara Selbrede in pilotstudies voor het verwijderen van lijm. Kryslaine Radomski voerde voorlopige hersenletsel en celtransplantatie operaties uit. Amanda Fu en Laura Tucker van de USU CNRM Preklinische studies kern laboratorium verstrekt waardevol advies over dier chirurgie en gedrag testen, respectievelijk.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 ml syringesBecton Dickinson (BD) 309659
1.7 ml flip top test tubesDenvilleC2170
10 microliter syringeHamilton7635-01
25G Precision Glide syringe needlesBecton Dickinson (BD) 305122
70% ethanolProduct of choice; varies by region
acetaminophen oral suspensionTylenol (Children's)Verdunn tot 1 mg/ml in water
anesthetic vaporizerVetland521-11-22
animal handling clothKoop bij de winkel
BetadinePurdue ProductsNDC-67618-151-32
compressed oxygenProduct of choice; varies by region
cyclosporine ASigma-Aldrich30024-100mg
DAB staining kitVector LaboratoriesSK-4100
dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD8418-500ml
DMEMInvitrogen (ThermoFisher)A14430-01
donkey anti-mouse IgG antibody, HRP conjugatedJackson ImmunoResearch715-035-151
electrical tape3M CorporationKoop bij de winkel
fine tweezersFine Science Tools11254-20
forcepsFine Science Tools91106-12
glass capillary pipettes, 1 mm OD, 0.58 mm IDWorld Precision Instruments1B100F-3
High Speed Rotary Micromotor KitForedom Electric Co. K.1070 - K.107018
Ideal Micro Drill Burr Set Of 5Cell Point Scientific 60-1000
Impact One Stereotaxic Impactor for CCI Leica Biosystems39463920
isofluraneBaxterNDC-10019-360-60
lab bench timersFisher Scientific14-649-17
Micropipette pullerMicroData Instruments, Inc.PMP-102Elke puller is voldoende
Microscope cover slipsFisherbrand12-545-E
Microscope slide mounting mediumProduct of choice
mirrorKoop bij de winkel
mouse anti-human nuclear antigen antibodyMilliporeMAB1281
Mouse on Mouse blocking kitVector LaboratoriesBMK-2202
needle holder hemostatFine Science Tools12002-12
ophthalmic ointmentFalcon PharmaceuticalsNDC-61314-631-36
ophthalmic spring scissorsFine Science Tools15018-10
plastic boxKoop bij de winkel
plastic cylinderKoop bij de winkel
QSI motorized syringe pumpStoelting53311
Removable needle compression fittingHamilton55750-01
small rodent stereotaxic frameStoelting51925
small scissorsFine Science Tools14060-09
StemPro AccutaseInvitrogen (ThermoFisher)A1110501
Sterile alcohol prep padsFisherbrand06-669-62
sterile cotton swabs/Kendall Q-tipsTyco Healthcare540500
Sterile salineHospiraNDC-0409-1966-07
Stopwatches (2)Fisher Scientific06-662-56
Superfrost Plus Gold microscope slidesFisherbrand15-188-48
sutures - 5.0 silk with curved needleOasisMV-682

Referenties

  1. Maas, A. I. R., et al. Traumatic brain injury: integrated approaches to improve prevention, clinical care, and research. The Lancet Neurology. 16, 987-1048 (2017).
  2. Murray, C. J., et al. Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. The Lancet. 380, 2197-2223 (2012).
  3. Taylor, C. A., Bell, J. M., Breiding, M. J., Xu, L. Traumatic Brain Injury-Related Emergency Department Visits, Hospitalizations, and Deaths - United States, 2007 and 2013. Morbidity and mortality weekly report: Surveillance summaries. 66, 1-16 (2017).
  4. Fehily, B., Fitzgerald, M. Repeated Mild Traumatic Brain Injury: Potential Mechanisms of Damage. Cell Transplantation. 26, 1131-1155 (2017).
  5. Kulbe, J. R., Hall, E. D. Chronic traumatic encephalopathy-integration of canonical traumatic brain injury secondary injury mechanisms with tau pathology. Progress in Neurobiology. 158, 15-44 (2017).
  6. Romine, J., Gao, X., Chen, J. Controlled cortical impact model for traumatic brain injury. Journal of Visualized Experiments. , e51781(2014).
  7. Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
  8. Mishra, A. M., et al. Decreased resting functional connectivity after traumatic brain injury in the rat. PloS ONE. 9, 95280(2014).
  9. Sours, C., et al. Default mode network interference in mild traumatic brain injury - a pilot resting state study. Brain Research. 1537, 201-215 (2013).
  10. Radomski, K. L., Zhou, Q., Yi, K. J., Doughty, M. L. Cortical contusion injury disrupts olfactory bulb neurogenesis in adult mice. BMC Neuroscience. 14, 142(2013).
  11. Wang, X., Gao, X., Michalski, S., Zhao, S., Chen, J. Traumatic Brain Injury Severity Affects Neurogenesis in Adult Mouse Hippocampus. Journal of Neurotrauma. 33, 721-733 (2016).
  12. Aertker, B. M., Bedi, S., Cox, C. S. Strategies for CNS repair following TBI. Experimental Neurology. 275 (3), 411-426 (2016).
  13. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548, 592-596 (2017).
  14. Kondo, T., et al. Focal transplantation of human iPSC-derived glial-rich neural progenitors improves lifespan of ALS mice. Stem Cell Reports. 3, 242-249 (2014).
  15. Tong, L. M., et al. Inhibitory interneuron progenitor transplantation restores normal learning and memory in ApoE4 knock-in mice without or with Abeta accumulation. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34, 9506-9515 (2014).
  16. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  17. Lischka, F. W., et al. Neonatal mouse cortical but not isogenic human astrocyte feeder layers enhance the functional maturation of induced pluripotent stem cell-derived neurons in culture. Glia. 66, 725-748 (2018).
  18. Bouet, V., et al. The adhesive removal test: a sensitive method to assess sensorimotor deficits in mice. Nature Protocols. 4, 1560-1564 (2009).
  19. Fleming, S. M., Ekhator, O. R., Ghisays, V. Assessment of sensorimotor function in mouse models of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments. , e50303(2013).
  20. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Compact 2nd edn. , Elsevier Academic Press. (2004).
  21. Jacobs, G. H., Williams, G. A., Cahill, H., Nathans, J. Emergence of novel color vision in mice engineered to express a human cone photopigment. Science. 315, 1723-1725 (2007).
  22. Lundell, T. G., Zhou, Q., Doughty, M. L. Neurogenin1 expression in cell lineages of the cerebellar cortex in embryonic and postnatal mice. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 238, 3310-3325 (2009).
  23. Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature. 386, 493-495 (1997).
  24. Piltti, K. M., et al. Transplantation dose alters the dynamics of human neural stem cell engraftment, proliferation and migration after spinal cord injury. Stem Cell Research. 15, 341-353 (2015).
  25. Yu, S., et al. Severity of controlled cortical impact traumatic brain injury in rats and mice dictates degree of behavioral deficits. Brain Research. 1287, 157-163 (2009).
  26. Kabadi, S. V., Hilton, G. D., Stoica, B. A., Zapple, D. N., Faden, A. I. Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats. Nature Protocols. 5, 1552-1563 (2010).
  27. Namjoshi, D. R., et al. Defining the biomechanical and biological threshold of murine mild traumatic brain injury using CHIMERA (Closed Head Impact Model of Engineered Rotational Acceleration). Experimental Neurology. 292, 80-91 (2017).
  28. Shetty, A. K., Mishra, V., Kodali, M., Hattiangady, B. Blood brain barrier dysfunction and delayed neurological deficits in mild traumatic brain injury induced by blast shock waves. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 232(2014).
  29. Petraglia, A. L., Dashnaw, M. L., Turner, R. C., Bailes, J. E. Models of mild traumatic brain injury: translation of physiological and anatomic injury. Neurosurgery. 75, Suppl 4 34-49 (2014).
  30. Siebold, L., Obenaus, A., Goyal, R. Criteria to define mild, moderate, and severe traumatic brain injury in the mouse controlled cortical impact model. Experimental Neurology. 310, 48-57 (2018).
  31. Tucker, L. B., Fu, A. H., McCabe, J. T. Performance of Male and Female C57BL/6J Mice on Motor and Cognitive Tasks Commonly Used in Pre-Clinical Traumatic Brain Injury Research. Journal of Neurotrauma. 33, 880-894 (2016).
  32. Rose, S. C., Fischer, A. N., Heyer, G. L. How long is too long? The lack of consensus regarding the post-concussion syndrome diagnosis. Brain Injury. 29, 798-803 (2015).
  33. Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nature Methods. 7, 825-826 (2010).
  34. Li, X., et al. Chronic behavioral testing after focal ischemia in the mouse: functional recovery and the effects of gender. Experimental Neurology. 187, 94-104 (2004).
  35. Andersen, A. B., Finger, S., Andersen, C. S., Hoagland, N. Sensorimotor cortical lesion effects and treatment with nimodipine. Physiology & Behavior. 47, 1045-1052 (1990).
  36. Al-Ali, H., et al. The mTOR Substrate S6 Kinase 1 (S6K1) Is a Negative Regulator of Axon Regeneration and a Potential Drug Target for Central Nervous System Injury. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 37, 7079-7095 (2017).
  37. Pleasant, J. M., et al. Rate of neurodegeneration in the mouse controlled cortical impact model is influenced by impactor tip shape: implications for mechanistic and therapeutic studies. Journal of Neurotrauma. 28, 2245-2262 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Traumatisch hersenletselhumane ge nduceerde pluripotente stamcellenneurale celtransplantatiestereotactische chirurgieadhesive tape removal testimmunohistochemische analysecraniectomieprocedurebiosafety bij celkweekpostoperatieve zorg
Gecontroleerde corticale impact model van muis hersenletsel met therapeutische transplantatie van menselijk geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide neurale cellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.