Methodenartikel

Het bestuderen van organelle dynamica in B-cellen tijdens immuun Synapse vorming

8.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59621

⸱

1 juni 2019

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Immune Cell Biology, Department of Cellular and Molecular Biology, Pontificia Universidad Católica de Chile, 2Faculty of Medicine, Pontificia Universidad Católica de Chile, 3Centro de Investigaciones en Biología Celular y Biomedicina, Facultad de Ciencia, Universidad San Sebastián

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hierin beschrijven we twee benaderingen om celpolarisatie gebeurtenissen in B-lymfocyten te karakteriseren tijdens de vorming van een IS. De eerste, omvat de kwantificering van organel recruitment en cytoskelet herschikkingen op het synaptische membraan. De tweede is een biochemische benadering, om veranderingen in de samenstelling van het zwaartepunt te karakteriseren, die polarisatie ondergaat op het immuunsysteem Synapse.

Samenvatting

Herkenning van oppervlaktethering antigenen door de B cell receptor (BCR) activeert de vorming van een immuun Synapse (IS), waar zowel signalering en antigeen opname worden gecoördineerd. Bij de formatie gaat het om dynamische actine-remodellering, begeleid door de gepolariseerde rekrutering van het synaptische membraan van de centrosoom en geassocieerde intracellulaire organellen zoals lysosomen en het Golgi-apparaat. In de eerste stadia van actine-remodellering kunnen B-cellen hun celoppervlak vergroten en de hoeveelheid antigeen-BCR-complexen die in de synaps zijn verzameld maximaliseren. Onder bepaalde omstandigheden, wanneer B-cellen antigenen herkennen die geassocieerd zijn met stijve oppervlakken, is dit proces gekoppeld aan de lokale werving en secretie van lysosomes, die antigeen-extractie kunnen vergemakkelijken. Upingen antigenen zijn geïnternationaliseerd in gespecialiseerde Endo-lysosome compartimenten voor verwerking in peptiden, die worden geladen op grote histocompatibility complex II (MHC-II) moleculen voor verdere presentatie aan T helper cellen. Daarom is het bestuderen van organel dynamiek in verband met de vorming van een is cruciaal om te begrijpen hoe B-cellen worden geactiveerd. In het huidige artikel zullen we zowel beeldvorming als een biochemische techniek bespreken die wordt gebruikt om veranderingen in intracellulaire organel positionering en cytoskelet herschikkingen te bestuderen die geassocieerd zijn met de vorming van een is in B-cellen.

Inleiding

B-lymfocyten zijn een essentieel onderdeel van het adaptieve immuunsysteem dat verantwoordelijk is voor de productie van antilichamen tegen verschillende bedreigingen en binnenvallende pathogenen. De efficiëntie van de productie van antilichamen wordt bepaald door het vermogen van B-cellen om antigenen te verwerven, te verwerken en te presenteren die aangetroffen zijn in een oplosbare of oppervlaktethering vorm1,2. De erkenning van antigenen die aan het oppervlak van een inzend cel zijn gehecht, door de BCR, leidt tot de vorming van een nauwe intercellulaire contact genoemd is3,4. Binnen dit dynamische platform vindt zowel BCR-afhankelijke downstream signalering en internalisatie van antigenen in Endo-lysosome compartimenten plaats. Upingen antigenen worden verwerkt en geassembleerd op MHC-II moleculen en vervolgens gepresenteerd aan T lymfocyten. Productieve B-T-interacties, aangeduid als B-T-celsamenwerking, laten B-lymfocyten de juiste signalen ontvangen, die hun differentiatie in antilichaamproducerende plasmacellen of geheugen cellen8bevorderen.

Er zijn twee mechanismen betrokken bij de extractie van antigeen door B-cellen. De eerste is gebaseerd op de afscheiding van proteasen afkomstig van lysosomen die rekrutering en fusie ondergaan op de synaptische gespleten5,6. De tweede, is afhankelijk van myosin IIA-gemedieerde trekkrachten die de invaginatie van antigeen bevattende membranen die zijn geïnternationaliseerd in een clathrin-gecoate pits7activeert. De methode van antigeen extractie berust op de fysische eigenschappen van het membraan waarin antigenen worden aangetroffen. Niettemin, in beide gevallen, B-cellen ondergaan twee belangrijke remodellering gebeurtenissen: actine cytoskelet reorganisatie en polarisatie van organellen aan de IS. Actin cytoskelet remodellering omvat een initiële verspreiding fase, waarbij actin-afhankelijke uitsteeksels op het synaptische membraan het oppervlak in contact met het antigeen verhogen. Dit wordt gevolgd door een contractie fase, waarbij BCrs in combinatie met antigenen geconcentreerd zijn in het midden van de is door de gecoördineerde werking van moleculaire motoren en actine cytoskelet remodelleren8,9,10, 11. polarisatie van organellen is ook afhankelijk van de verbouwing van actine cytoskelet. Bijvoorbeeld, de centrosoom wordt losgekoppeld van de Nucleus, door lokale depolymerisatie van geassocieerde actin, die het mogelijk maakt de herpositionering van deze organel naar de is5,12. In B-cellen, herpositionering van het zwaartepunt op één celpool (is) begeleidt lysosoom rekrutering naar het synaptische membraan, die bij afscheiding de extractie en/of verwerking van oppervlaktegebonden antigenen6kan vergemakkelijken. Lysosomes aangeworven op de IS zijn verrijkt met MHC-II, die de vorming van peptide-MHC-II complexen in endosomale compartimenten voor te stellen aan T-cellen13gunsten. Bovendien is het Golgi-apparaat ook waargenomen om nauw te worden gerekruteerd aan de IS14, wat suggereert dat Golgi afkomstige blaasjes uit het secretoire traject kunnen worden betrokken bij de extractie en/of verwerking van antigeen.

In totaal zijn intracellulaire organel-en cytoskelet-herschikkingen in B-cellen tijdens de synaps vorming de belangrijkste stappen die een efficiënte antigeen verwerving en verwerking vereist voor hun verdere activering mogelijk maken. In dit werk introduceren we gedetailleerde protocollen voor het uitvoeren van Imaging en biochemische analyse in B-cellen om de intracellulaire remodellering van organellen in verband met de vorming van een IS te bestuderen. Deze technieken omvatten: (i) immunofluorescentie en beeldanalyse van B-cellen die worden geactiveerd met antigeen-gecoate kralen en op antigeen gecoate dekstroken, waardoor visualisatie en kwantificering van intracellulaire componenten die zijn gemobiliseerd aan de IS en (II ) isolatie van met zwaartepunt verrijkte fracties in B-cellen door ultracentrifugatie op sucrose-gradiënten, die de identificatie mogelijk maakt van eiwitten die met het centromeer zijn geassocieerd, mogelijk betrokken bij de regulering van de celpolariteit.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Opmerking: de volgende stappen werden uitgevoerd met behulp van IIA 1.6 B cellen.

1. B celactivering met antigeen-gecoate kralen

  1. Bereiding van antigeen-gecoate kralen
    1. Om B-cellen te activeren, gebruikt u NH2-Beads covalent gecoat met antigeen (met AG gecoate kralen), die worden bereid met 50 μL (~ 20 x 106 parels) van 3 μm NH2-kralen met activerende (BCR-ligand +) of niet-activerende (BCR-ligand-) antigenen.
    2. Voor IIA 1.6 B-cellen gebruikt u anti-IgG-F (AB ')2 -fragment als BCR-ligand + en anti-IgM-F (AB ')2 of boviene serumalbumine (BSA) als BCR-ligand-. Om primaire B-cellen of IgM+ B-cellijn te activeren, gebruikt u anti-IgM-F (AB ')2 als BCR-LIGAND + en BSA als BCR-ligand-.
      Opmerking: om de binding van liganden aan de FC-receptor te voorkomen, gebruikt u F (AB ') of F (AB ')2 antilichamen fragmenten in plaats van volledige antilichamen.
    3. Om verder te gaan met de voorbereiding van de met AG gecoate kralen, plaatst u de parels in een laag eiwit bindende micro centrifugebuizen om het herstel van de kralen tijdens de monster manipulatie te maximaliseren. Voeg 1 mL 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) toe om kralen te wassen en centrifugeer bij 16.000 x g gedurende 5 min. aspirate het supernatant.
    4. Hervat de parels met 500 μL van 8% Glutaaraldehyde om de NH2 groepen te activeren en 4 uur te roteren bij kamertemperatuur (RT).
      Let op: de Glutaaraldehyde-stamoplossing mag alleen worden gebruikt in een chemische rook afzuigkap. Volg de instructies op het materiaal veiligheidsinformatieblad (MSDS).
    5. Centrifugeer kralen bij 16.000 x g gedurende 5 minuten, verwijder de Glutaaraldehyde en was de parels drie keer met 1 ml 1x PBS.
      Let op: de Glutaaraldehyde oplossing moet worden weggegooid als gevaarlijk chemisch afval.
    6. Hervat de geactiveerde parels in 100 μL van 1x PBS. Het monster kan worden onderverdeeld in twee microcentrifugebuisjes met een laag eiwitbinding: 50 μL voor de BCR-ligand + en 50 μL voor BCR-ligand-.
    7. Gebruik voor de bereiding van de antigeen oplossing twee 2 mL lage eiwit bindende microcentrifugebuisjes met 100 μg/mL antigeen oplossing in 150 μL PBS: één buis met BCR-ligand + en andere met BCR-ligand-.
    8. Voeg 50 μL geactiveerde kralen oplossing toe aan elke buis met 150 μL antigeen oplossing, Vortex en draai 's nachts bij 4 °C.
    9. Voeg 500 μL van 10 mg/mL BSA toe om de overgebleven reactieve NH2 groepen op de kralen te blokkeren en voor 1 uur te roteren bij 4 °c.
    10. Centrifugeer de parels bij 16.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c en verwijder het supernatant. Was de kralen met koud 1x PBS nog drie keer.
    11. Hervat de geactiveerde parels in 70 μL van 1x PBS.
    12. Om de uiteindelijke concentratie van met AG gecoate kralen te bepalen, Verdun een klein volume kralen in PBS (1:200) en Tel met behulp van een hemocytometer. Vervolgens bewaren bij 4 °C tot het gebruik.
      Opmerking: kralen met een AG-coating mogen niet langer dan 1 maand worden bewaard.
  2. Voorbereiding van poly-L-lysine covers Lips
    1. Voor de B-celactiveringstest met AG-gecoate kralen, bereidt u dekstroken met poly-L-lysine coating (PLL-covers Lips) voor. Gebruik een buis van 50 mL met 40 mL 0,01% m/v van de PLL-oplossing en dompel de afdek stroken met een diameter van 12 mm in de oplossing. 'S nachts draaien op RT.
    2. Was de dekstroken met 1x PBS en laat drogen op een 24-pits deksel bedekt met paraffine folie. Doorgaan met B-celactivering.
  3. B celactivering
    1. Om B-celactivering met kralen te starten, Verdun eerst de IIA 1.6 B-cellijn tot 1,5 x 106 cellen/ml in Klik medium (rpmi-1640 aangevuld met 2 mm L-alanine-L-glutamine + 55 μM Beta-mercaptoethanol + 1 mm pyruvaat + 100 U/ml penicilline + 100 μg/ml streptomycine) + 5% warmtegeïnactiveerd foetaal runderserum [FBS]).
    2. Combineer 100 μL (150.000 cellen) van IIA 1.6 B-cellen met AG-gecoate kralen bij 1:1 ratio in 0,6 mL buizen. Meng zachtjes met een Vortex en zaad op PLL-coverslips. Incuberen voor verschillende tijdspunten in een cel kweek incubator (37 °C/5% CO2). De typische activeringstijd punten zijn 0, 30, 60 en 120 min. Voor tijd 0, plaats de PLL-coverslips in de 24-well plate deksel op ijs. Voeg de cellen-AG-gecoate kraal mengsel en inincuberen voor 5 min op ijs.
      Opmerking: het is belangrijk om te mengen door Vortex in plaats van Pipetteer op en neer, omdat dit het aantal kralen in het monster kan verminderen, vanwege hun accumulatie in de plastic punt van de pipet. Gebruik kralen bekleed met BCR-ligand-als een negatieve controle voor elke assay. We raden aan eerst de langste incubatietijd te activeren en daarna de volgende tijdpunten. Bereken intervallen van de activering voor monsters, zodat ze op hetzelfde moment klaar zijn voor fixatie.
    3. Voeg 100 μL koude 1x PBS toe aan elke Afdeklijst om de activering te stoppen en door te gaan met het immunofluorescentie protocol. Zie Protocol sectie 3.

2. B celactivatie op dekstroken met antigeen coating

  1. Bereiding van dekstroken met antigeen coating
    1. Bereid vóór activering de antigeen oplossing (1x PBS met 10 μg/mL BCR-ligand + en 0,5 μg/mL rat anti-Mouse CD45R/B220).
      Opmerking: overweeg de voorbereiding van de dekstroken op de dag voor de test. B220 verbetert de hechting van de B-cel, maar de BCR-ligand + is voldoende om de spreidings respons te genereren.
    2. Plaats de 12 mm afdekplaat op een 24-pits deksel bedekt met paraffine folie, voeg 40 μL antigeen oplossing toe aan elke dekslip en incuberen bij 4 °C 's nachts. Sluit de plaat af om verdamping van antigeen oplossing te voorkomen.
    3. Was de dekstroken met 1x PBS en lucht droog.
  2. B celactivering
    1. Om de activering te starten, Verdun IIA 1.6 B cellen tot 1,5 x 106 cellen/ml in Klik medium + 5% FBS.
    2. Voeg 100 μL cellen toe aan een dekslip met antigeen coating (AG-afdek) en activeer voor verschillende tijdspunten in een cel incubator bij 37 °c/5% CO2. De typische activerende tijdpunten zijn 0, 30 en 60 min.
      Opmerking: zoals in sectie 1, raden we aan te beginnen met het langste activerende tijdpunt om alle samples op hetzelfde moment te repareren.
    3. Plaats voor tijd 0 de 24-pits deksel met de AG-coverslip op ijs en voeg de cellen toe. Inbroed voor 5 min op ijs.
    4. Zuig de media zorgvuldig op elke AG-coverslip en voeg vervolgens 100 μL koude 1x PBS toe om de activering te stoppen. Ga verder met het immunofluorescentie protocol. Zie rubriek 3.

3. immunofluorescentie

Opmerking: om Kruisreactiviteit van het secundaire antilichaam met de BCR van IIA 1,6 B-cellen te voorkomen, mag u geen met de muis afgeleide primaire antilichamen gebruiken.

  1. Verwijder de 1x PBS en ga verder met de fixatie van elke coverslip.
    Opmerking: als u wilt bepalen welk fixatie medium moet worden gebruikt, controleert u het gegevensblad antilichaam/kleurstof. Bijvoorbeeld, voor actine labeling door phalloidin gebruik Paraformaldehyde (PFA) fixatie medium, en voor het centrosoom labeling door pericentrin gebruik methanol fixatie.
    1. Voeg 50 μL 1x PBS toe, aangevuld met 4% PFA en inincuberen gedurende 10 minuten bij RT.
      Let op: formaldehyde is giftig. Lees de MSDS voordat u met deze chemische stof werkt. PFA-oplossingen moeten alleen worden gemaakt onder een chemische rook afzuigkap die handschoenen en veiligheidsbril draagt. De PFA-oplossing moet worden weggegooid als gevaarlijk chemisch afval.
    2. U ook 50 μL koude methanol toevoegen en gedurende 20 minuten inbroed.
  2. Was drie keer met 1x PBS.
    Opmerking: Dekstroken kunnen op dit punt worden bewaard bij 4 °C gedurende maximaal drie dagen in 1x PBS.
  3. Verwijder 1x PBS en voeg op elke Afdeklijst 50 μL blokkerende buffer (2% BSA + 0,3 M glycine in 1x PBS) toe. Incuberen bij RT gedurende 10 min.
  4. Zuig voorzichtig op en voeg 50 μL permeabilization buffer (PB) toe (0,2% BSA + 0,05% saponine in 1x PBS). Incuberen bij RT gedurende 20 min.
  5. Bereid de antilichamen of kleurstoffen in PB (gebruik 30 μL per dekslip) en inincuberen bij RT voor 1 uur of 's nachts bij 4 °C. Raadpleeg de tabel met materialen voor meer informatie.
    1. Om het microtubulus organiserend centrum (mtoc) of centrosoom te labelen, gebruikt u de volgende antilichamen: anti-γ-tubulin (1:500), anti-Cep55 (1:500), anti-α-tubulin (1:500), anti-pericentrin (1:1000).
      Opmerking: voor centrosoom labeling B cellen kunnen worden getransffecteerd met een centrin-GFP expressie plasmide.
    2. Gebruik voor het labelen van Golgi-apparaten anti-Rab6a (1:500).
      Opmerking: er kunnen ook andere antilichamen of kleurstoffen worden gebruikt.
    3. Voor het labelen van lysosomes, gebruik anti-Lamp1 (1:200).
      Opmerking: anti-H2-DM en anti-MHC-II kunnen ook worden gebruikt om de antigeen verwerkings compartimenten15,16te labelen.
    4. Voor het labelen van endoplasmisch reticulum gebruik anti-Sec61a (1:500).
    5. Voor actine cytoskelet moet het volgende worden overwogen: gepolymeriseerde actine kan worden visualiseerd door phalloidine geconjugeerd aan fluorescerende kleurstoffen.
      Opmerking: B-cellen met een LifeAct-GFP/RFP-expressie plasmide kunnen ook worden gebruikt om actin te labelen.
  6. Was de afdek stroken drie keer met PBS.
  7. Verdun het secundaire antilichaam of de kleurstoffen in PBS (gebruik 30 μL per dekslip) en incuberen 1 uur bij RT.
    Opmerking: Vermijd blootstelling van de monsters aan direct licht om de kwaliteit van het fluorescentie signaal te behouden.
  8. Was de afdek stroken drie keer met PBS.
  9. Verwijder de PBS-oplossing uit de afdek stroken.
  10. Voeg 4 μL montage reagens toe aan een Microscoop glijbaan. Monteer de Afdekstrook op de dia met de celzijde naar beneden gericht. Laat de glaasjes 30 minuten drogen bij 37 °C of 's nachts bij RT.
    Opmerking: overweeg het gebruik van een "anti-Fade" montage reagens (Zie de tabel met materialen).
  11. Verkrijg fluorescentie beelden op een confocale of epifluorescentie Microscoop met een 60 x of 100x olie immersie doelstelling. Voor elke overname rekening houden met de verzonden licht of helderveld om gemakkelijk te identificeren B-cellen interactie met kralen.
    Opmerking: Maak driedimensionale (3D) afbeeldingen, die de hele cel bedekken met behulp van z-stacks. We raden aan om 0,5 μm dikke stapels te nemen, maar dit hangt af van de Microscoop.

4. beeldanalyse

Opmerking: de volgende algoritmen worden beschreven voor ImageJ-software. Dit kan echter worden uitgevoerd met behulp van een equivalente software. Houd er ook rekening mee dat voor alle intensiteit metingen fluorescentie we de geïntegreerde fluorescentie dichtheid ("RawIntDen" in ImageJ) gebruiken, omdat deze parameter de totale hoeveelheid fluorescentie in elke pixel van het beeld beschouwt, rekening houdend met het gebied.

  1. Analyse van de distributie van organellen in B-cellen geactiveerd met AG-gecoate kralen
    Opmerking: om de polarisatie van celcomponenten te kwantificeren, definiëren we een willekeurige waarde als een maat voor de nabijheid van de IS. De index varieert tussen-1 (anti-gepolariseerd) en 1 (volledig gepolariseerd, object op de kraal), zoals eerder werd gepresenteerd door Reversat et al.12.
    1. Schat de polariteit index voor het centrosoom-en Golgi-apparaat (Figuur 1b).
      Opmerking: dit algoritme kan worden gebruikt voor organellen die zijn beperkt tot één punt.
      1. Definieer eerst de kraal-en celgebieden die u wilt analyseren met behulp van de selectie van het gereedschap cirkel om de grenzen van beide te beperken, en sla ze vervolgens op als interessegebieden (ROI). Zie Figuur 1, Figuur 2, Figuur 3en Figuur 4.
      2. Bepaal de Cell Center (CC) en de Bead Center (BC) door het uitvoeren van analyseren | Meet respectievelijk op cel-en kraal gebieden. X-en Y-waarden die zijn verkregen uit het resultaten venster bepalen de centrum coördinaten.
      3. Bepaal handmatig het middelpunt van het centrosoom-of Golgi-apparaat (organelle) met behulp van de tool selecteren in imagej en Analyseer | Maatregel. X-en Y-waarden die zijn verkregen uit het resultaten venster bepalen de coördinaten.
      4. Teken vervolgens een hoek van CC naar organelle (a) en CC naar BC (b) met behulp van de tool hoek selecteren en Analyseer uitvoeren | Maatregel. De hoek waarde in het resultaten venster toont de hoek (α) tussen vectoren (a en b).
      5. Bereken de polariteit index met behulp van de volgende formule:
        figure-protocol-1
    2. Bereken de polariteit index voor lysosomen (Figuur 1f).
      Opmerking: we gebruiken dit algoritme om de polariteit van organellen te analyseren die een meer verspreide verdeling vertonen, zoals lysosomes.
      1. Definieer de kraal-en celgebieden die u wilt analyseren met behulp van de selectie van het gereedschap cirkel om de grenzen van beide te beperken en sla ze op als ROI. Zodra de kraal-en celgebieden bepaald zijn, stelt u het fluorescentie kanaal in en projecteer je het beeld in één z-stack (afbeelding | Stapels | Z-project [Sum slices]) en voer vervolgens analyseren | Meet en extraheer de Mass Center (MC)-coördinaten (MX en my) uit de resultaten Vensters.
      2. Pas hetzelfde algoritme genoemd vóór het wijzigen van organelle voor MC. Zo wordt de hoek (α) gedefinieerd door CC-MC (a) en CC-BC (b).
      3. Bereken de polariteit met de volgende formule:
        figure-protocol-2
    3. Bereken lysosoom Recruitment in het synaptische gebied (Figuur 2b).
      Opmerking: dit algoritme wordt gebruikt om een organel naast de is te kwantificeren.
      1. Zodra de kraal-en celgebieden zijn bepaald, bepaalt u de hoek van de vector tussen de CC en BC en draait u de afbeelding om een hoek van 0 ° te bereiken.
      2. Stel het fluorescerende kanaal in en projecteer de afbeelding in één z-stack (afbeelding | Stapels | Z-project [Sum slices]), Elimineer alle fluorescentie die buiten het cel-en kraal gebied valt (run Edit | Clear buiten in imagej).
      3. Teken met de selectie van het gereedschap Rechthoek een rechthoek naast de kraal en meet het synaptische gebied fluorescentie (SAF). Deze rechthoek is een kwart van de celbreedte.
      4. De hele afbeelding selecteren en analyseren uitvoeren | Meten om de hele cel fluorescentie (WCF) te verkrijgen.
      5. Bereken het organel fluorescentie percentage naast het is met behulp van de volgende formule:
        figure-protocol-3
    4. Kwantificeren werving van cellulaire componenten aan de centrosome.
      Opmerking: dit algoritme, aangepast van obino et al.5, wordt gebruikt om de verrijking van organellen in het centrosoom gebied te kwantificeren. In het kort beschouwen we het centrosoom gebied als het domein waarin de zwaartepunt geassocieerde organel fluorescentie constant of boven 70% in de fluorescentie/RADIUS plot blijft. Het is essentieel om deze parameter bij rust omstandigheden in te stellen, omdat deze RADIUS bij activering kan veranderen.
      1. Zodra de kraal-en celgebieden zijn bepaald, definieert u de lokalisatie van het zwaartepunt met behulp van de gereedschap punten selecteren (Figuur 3b).
      2. Bepaal eerst het maximale gebied rond het zwaartepunt dat mogelijk is om te kwantificeren, door een 3 μm-RADIUS cirkel rond het zwaartepunt te tekenen.
      3. Gebruik het ImageJ-plugin Radiaal profiel, dat de fluorescentie in concentrische cirkels meet en een fluorescentie/RADIUS-plot weergeeft.
      4. Bepaal de maximale straal waarbinnen ten minste 70% van de intensiteit van de fluorescentie wordt gehandhaafd.
      5. Bereken de fluorescentie dichtheids ratio met behulp van de volgende formule:
        figure-protocol-4=figure-protocol-5
        Opmerking: de fluorescentie dichtheids ratio duidt op de concentratie van een organel bij het zwaartepunt in vergelijking met de verdeling ervan in de hele cel.
  2. Analyse van de verspreiding van cellen en distributie van organellen in B-cellen geactiveerd op AG-coverslips
    1. Bereken de organel verdeling aan de IS (figuur 4b).
      Opmerking: dit algoritme maakt de kwantificering van de XY-verdeling van organellen en hun concentratie in het midden van de IS mogelijk. We definiëren een verhouding van de fluorescentie dichtheid tussen het centrale en het totale synaptische gebied. De verkregen waarden kunnen variëren van negatief tot positief, wat duidt op respectievelijk een perifere of een centrale verdeling van de organel.
      1. Bepaal het segment waarin de cel in contact staat met de omslag.
        Notes: om de celgrenzen te scheiden, kan men het plasma membraan of actine die is verrijkt in de periferie van de IS labelen.
      2. Het type van het segment wijzigen in 8-bits en vervolgens binarize (proces | Binaire | Maak binair) en verbind het dichtstbijzijnde buitenstaander-punten proces | Binaire | Overzicht. De grenzen van het celgebied (CA) afbakeningen met behulp van de selectie veelhoek gereedschap .
        Opmerking: deze stap is handig om het contrast van de celgrenzen te vergroten en het gemakkelijker te identificeren. Ook is het op dit moment mogelijk om de plug-in voor het analyseren van deeltjes van imagej toe te passen om de CA automatisch te bepalen. Andere cellen in hetzelfde veld kunnen echter de resultaten verstoren.
      3. Neem CA -parameters (hoogte en breedte) en begrenzen een centraal afgerond gebied, dat van de begrenzingen wordt gescheiden door een kwart van de hoogte-en breedtewaarden, beschouw dit gebied als het cel Center gebied (CCA).
      4. Bereken de fluorescentie dichtheids verdeling in het midden van de IS met behulp van de volgende formule:
        figure-protocol-6
    2. Meet organel verdeling in Z-vlakken (figuur 4c).
      Opmerking: deze analyse bepaalt de algemene verdeling van organel fluorescentie over Z-vlakken van B-cellen die worden geactiveerd op AG-coverslips, waarbij het percentage fluorescentie per Z-fractie wordt weergegeven.
      1. Om de fluorescentie verdeling in Z te kwantificeren, Bepaal eerst het vlak van de IS waar de cel in contact is met de AG-coverslip en vervolgens het vlak dat overeenkomt met de bovengrens van de cel.
      2. Teken een lijn over het celcentrum.
      3. De afbeelding opnieuw in Z (afbeelding | Stapels | Om een xz-afbeelding te verkrijgen.
      4. Meet de hoogte en verdeel de XZ-afbeelding in 10 opeenvolgende rechthoeken van dezelfde hoogte (Z-Fractie) vanaf de onderkant (IS interface) naar de bovenkant (bovenzijde van de cel) en kwantificeer het fluorescentie signaal in elk van deze cellen.
      5. Normaliseer de intensiteit van de fluorescentie van elke Z-fractie door de som van de totale fluorescentie van de 10 fracties.
      6. Plot het percentage van de intensiteit van de fluorescentie per Z-Fractie van de cel.

5. isolatie van centrosome-verrijkte fractie uit rust en geactiveerde B-cellen

Opmerking: Houd alle oplossingen bij 4 °C tijdens het experiment om eiwit degradatie te voorkomen. Dit protocol is aangepast aan eerdere werkzaamheden17,18.

  1. Activeer 2 x 107 B-cellen met met AG gecoate kralen in 2 ml Klik medium + 2% warmte-GEÏNACTIVEERD FBS (verhouding 1:1). Overweeg niet-geactiveerde B-cellen als rust B-cellen.
  2. Voeg cytochalasin D (2 μM) en nocodazol (0,2 μM) toe en inincuberen gedurende 1 uur bij 37 °C.
    Let op: deze geneesmiddelen worden gebruikt om het zwaartepunt voorzichtig los te maken van de Nucleus, door respectievelijk depolymerizing actine cytoskelet en microtubuli, om nucleaire besmetting te voorkomen.
  3. Was elk monster met 5 mL koude 1x TBS (50 mM tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl) en vervolgens met 1 mL 0,1 x TBS aangevuld met 8% sucrose.
  4. Respendeer de cellen met 150 μL centrosoom lysisbuffer (1 mm Hepes, pH 7,2, 0,5% NP-40, 0,5 mm MgCl2, 0,1% Beta-mercaptoethanol, 1 mm fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) of een proteaseremmer cocktail) en Pipetteer op en neer tot de viscositeit vermindert, wat aangeeft dat cel lysis in het monster wordt geïdentificeerd. Steek het monster in een buis van 1,5 mL.
  5. Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c om de organellen van de Nucleus te scheiden.
  6. Herstel het supernatant zorgvuldig en plaats het bovenop een tube van 1,5 mL met 300 μL gradiënt buffer (GB) (10 mM buizen pH 7,2, 0,1% Triton X-100, 0,1% Beta-mercaptoethanol) met 60% sucrose.
  7. Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °c om de nucleotiderende in de 60% sucrose-fractie te concentreren.
  8. Bereid ondertussen een discontinu gradiënt in 2 mL ultracentrifuge buizen door het omleggen van 450 μL GB + 70% sucrose met 270 μL GB + 50% sucrose en vervolgens 270 μL GB + 40% sucrose.
  9. Na de eerste centrifugeren (zwaartepunt-geconcentreerde Fractie), gooi de bovenste fractie (minder dichte portie) totdat de interface te bereiken en Vortex het resterende monster in de buis. Vervolgens overlay bovenop de onderbroken gradiënt eerder voorbereid met de centrosoom verrijkt monster.
    Opmerking: Zorg ervoor dat u het verloop niet verstoort, alle Pipetteer procedures moeten zorgvuldig worden uitgevoerd.
  10. Centrifugeer bij 40.000 x g gedurende 1 uur bij 4 °c met minimale acceleratie en met de centrifuge-rem op uit, om te voorkomen dat het verloop wordt verstoord.
  11. Verzamel 12 fracties van 100 μL in afzonderlijke buisjes beginnend vanaf de bovenkant.
  12. Identificeer de centrosoom verrijkte fracties door immunoblot met behulp van γ-tubulin als de centrosoom marker.
    Opmerking: we vinden meestal centrosome verrijkte extracten tussen fracties 6 en 8.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het huidige artikel laat zien hoe B-cellen kunnen worden geactiveerd met behulp van geïmmobiliseerd antigeen op kralen of dekstroken om de vorming van een IS te induceren. We geven informatie over het identificeren en kwantificeren van de polarisatie van verschillende organellen door immunofluorescentie en het karakteriseren van eiwitten die dynamische veranderingen ondergaan in hun associatie met het zwaartepunt, wat polariseert in de IS, met behulp van een biochemische benadering.

<...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

We beschrijven een uitgebreide methode om te bestuderen hoe B-lymfocyten hun intracellulaire architectuur opnieuw organiseren om de vorming van een IS te bevorderen. Deze studie omvat het gebruik van beeldvormingstechnieken om de intracellulaire verdeling van organellen te kwantificeren, zoals centrosome, Golgi-apparatuur en lysosomen tijdens de activering van B-cellen, en hoe ze polariseren naar de is. Daarnaast beschrijven we een biochemische benadering om veranderingen in de centrosoom samenstelling na B-celactivering...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

M.-I.Y. wordt ondersteund door een onderzoekssubsidie van FONDECYT #1180900. J.I., D.F. en J.L. werden gesteund door beurzen van de Comisión Nacional de Ciencia y Tecnología. We danken David Osorio van Pontificia Universidad Católica de Chile voor de video-opname en-bewerking.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
IIA1.6 (A20 variant) mouse B-lymphoma cellsATCCTIB-208Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface without FcγIIR
100% methanolFisher ScientificA412-4
10-mm diameter cover glasses thickness No. 1 circularMarienfield-Superior111500
2-mercaptoethanolThermo Fisher Scientific21985023
Alexa 488 fluor- donkey ant-rabbit IgG LifeTech A212061:500 verdunning aanbevolen maar moet worden geoptimaliseerd
Alexa Fluor 546 goat anti-Rabbit  IgGThermo Fisher Scientific A-110711:500 verdunning aanbevolen maar moet worden geoptimaliseerd
Alexa Fluor 647-conjugated phalloidinThermo Fisher Scientific A212381:500 verdunning aanbevolen maar moet worden geoptimaliseerd
Amaxa Nucleofection kit VLonzaVCA-1003Volg de aanwijzingen van de fabrikant voor het mengen van de transfectiereagentia met het DNA
Amaxa Nucleofector model 2bLonzaAAB-1001Programma L-013 gebruikt
Amino- DynabeadsThermoFisher14307D
Anti-pericentrin Abcamab4448 1:200 verdunning aanbevolen maar moet worden geoptimaliseerd
Anti-rab6Abcamab959541:200 verdunning aanbevolen maar moet worden geoptimaliseerd
Anti-sec61Abcamab155751:200 verdunning aanbevolen maar moet worden geoptimaliseerd
BSA Winkler BM-0150
CaCl2WinklerCA-0520
Culture plate T25BD353014
Fiji SoftwareFiji col.
Fluoromount GElectron Microscopy Science17984-25
GlutamineThermo Fisher Scientific35050061
GlutaraldehydeSigma G7651 
GlycineWinkler BM-0820
Goat-anti-mouse IgG antibodyJackson ImmunoResearch315-005-003IIA1.6 positieve ligand
Goat-anti-mouse IgM antibodyThermo Fisher Scientific31186IIA1.6 negatieve ligand
HyClone Fetal bovine serumThermo Fisher ScientificSH30071.03Inactief maken door verhitting bij 56 oC gedurende 30 min
KClWinklerPO-1260
Leica SP8 TCS microscopeLeica
NaClWinklerSO-1455
Nikon Eclipse Ti-E epifluorescence microscope Nikon
ParafilmMP1150-2
ParaformaldehydeMerck30525-89-4Verdun tot 4% met PBS in een veiligheidskast, gebruik op het moment
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122Vloeibaar
Polybead Amino Microspheres 3.00μmPolyscience17145-5
Poly-L-LysineSigmaP8920Verdun met steriel water
Rabbit anti- alpha tubulin antibodyAbcamab61601:1000 verdunning aanbevolen maar moet worden geoptimaliseerd
Rabbit anti mouse lamp1 antibodyCell signaling32431:200 verdunning aanbevolen maar moet worden geoptimaliseerd
Rabbit anti-cep55 Abcamab1704141:500 verdunning aanbevolen maar moet worden geoptimaliseerd
Rabbit Anti-gamma Tubulin antibody Abcamab16504 1:1000 voor Western Blot
RPMI-1640Biological Industries01-104-1A
Saponin Merck558255
Sodium pyruvateThermo Fisher Scientific11360070
SucroseWinkler SA-1390 
Triton X-100 Merck9036-19-5
Tube 50 mlCorning353043

Referenties

  1. Carrasco, Y. R., Batista, F. D. B. Cells Acquire Particulate Antigen in a Macrophage-Rich Area at the Boundary between the Follicle and the Subcapsular Sinus of the Lymph Node. Immunity. 27 (1), 160-171 (2007).
  2. Batista, F. D., Harwood, N. E. The who, how and where of antigen presentation to B cells. Nature Reviews Immunology. 9 (1), 15-27 (2009).
  3. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science (New York, N.Y.). 285 (5425), 221-227 (1999).
  4. Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. B cells acquire antigen from target cells after synapse formation. Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).
  5. Obino, D., et al. Actin nucleation at the centrosome controls lymphocyte polarity. Nature Communications. 7, (2016).
  6. Yuseff, M. I., et al. Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation. Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).
  7. Spillane, K. M., Tolar, P. Mechanics of antigen extraction in the B cell synapse. Molecular Immunology. 101, 319-328 (2018).
  8. Schnyder, T., et al. B Cell Receptor-Mediated Antigen Gathering Requires Ubiquitin Ligase Cbl and Adaptors Grb2 and Dok-3 to Recruit Dynein to the Signaling Microcluster. Immunity. , (2011).
  9. Wang, J. C., et al. The Rap1 – cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse. Journal of Cell Science. , 1094-1109 (2017).
  10. Fleire, S. J., Goldman, J. P., Carrasco, Y. R., Weber, M., Bray, D., Batista, F. D. B cell ligand discrimination through a spreading and contraction response. Science. 312 (5774), 738-741 (2006).
  11. Vascotto, F., et al. The actin-based motor protein myosin II regulates MHC class II trafficking and BCR-driven antigen presentation. Journal of Cell Biology. 176 (7), 1007-1019 (2007).
  12. Reversat, A., et al. Polarity protein Par3 controls B-cell receptor dynamics and antigen extraction at the immune synapse. Molecular biology of the cell. 26 (7), 1273-1285 (2015).
  13. Lankar, D., et al. Dynamics of Major Histocompatibility Complex Class II Compartments during B Cell Receptor–mediated Cell Activation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (4), 461-472 (2002).
  14. Duchez, S., et al. Reciprocal Polarization of T and B Cells at the Immunological Synapse. The Journal of Immunology. 187 (9), 4571-4580 (2011).
  15. Pérez-Montesinos, G., et al. Dynamic changes in the intracellular association of selected rab small GTPases with MHC class II and DM during dendritic cell maturation. Frontiers in Immunology. 8 (MAR), 1-15 (2017).
  16. Le Roux, D., Lankar, D., Yuseff, M. I., Vascotto, F., Yokozeki, T., Faure-Andre´, G., Mougneau, E., Glaichenhaus, N., Manoury, B., Bonnerot, C., Lennon-Dume´nil, A. M. Syk-dependent Actin Dynamics Regulate Endocytic Trafficking and Processing of Antigens Internalized through the B-Cell Receptor. Molecular biology of the cell. 18 (September), 3451-3462 (2007).
  17. Reber, S. Chapter 8 Isolation of Centrosomes from Cultured Cells. Methods in Molecular Biology. 777 (2), 107-116 (2011).
  18. Gogendeau, D., Guichard, P., Tassin, A. M. Purification of centrosomes from mammalian cell lines. Methods in Cell Biology. 129, Elsevier (2015).
  19. Obino, D., et al. Vamp-7–dependent secretion at the immune synapse regulates antigen extraction and presentation in B-lymphocytes. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 890-897 (2017).
  20. Harwood, N. E., Batista, F. D. Early Events in B Cell Activation BCR: B cell receptor. Annual Review of Immunology. , (2010).
  21. Yuseff, M. I., Lennon-Duménil, A. M. B cells use conserved polarity cues to regulate their antigen processing and presentation functions. Frontiers in Immunology. 6, 1-7 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

B celactivatiecentrosoomrekruteringlysosoomsecretieactine remodelleringimmunofluorescentiekleuringconfocale microscopieWestern blot analysesucrosegradi ntcentrifugatie

Gerelateerde artikelen