Hier presenteren we een protocol voor genetisch gemodificeerde CAR-T cellen via een CRISPR/Cas9 systeem.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
CRISPR/Cas9 gebruiken om GM-CSF uit te nemen in CAR-T-cellen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Chimeric antigeen receptor T (CAR-T) celtherapie is een Cutting Edge en potentieel revolutionaire nieuwe behandelingsoptie voor kanker. Echter, er zijn aanzienlijke beperkingen aan haar wijdverbreide gebruik bij de behandeling van kanker. Deze beperkingen omvatten de ontwikkeling van unieke toxiciteiten zoals cytokine release Syndrome (CRS) en neurotoxiciteit (NT) en beperkte expansie, Effector functies, en anti-tumor activiteit in vaste tumoren. Een strategie ter verbetering van de werkzaamheid van CAR-t en/of controle toxiciteiten van CAR-T-cellen is om het genoom van de auto-T-cellen zelf te bewerken tijdens de productie van auto-T-cel. Hier beschrijven we het gebruik van CRISPR/Cas9-genbewerking in CAR-T-cellen via transductie met een lentivirale constructie die een RNA-geleiding bevat naar granulocyt macrofaag kolonie-stimulerende factor (GM-CSF) en Cas9. Als voorbeeld beschrijven we CRISPR/Cas9 gemedieerde Knockout van GM-CSF. We hebben aangetoond dat deze GM-CSFk/o Car-t cellen effectief minder GM-CSF produceren met behoud van kritische T cel functie en resulteren in verbeterde anti-tumor activiteit in vivo in vergelijking met wild type auto-T cellen.
Inleiding
Chimeric antigeen receptor T (CAR-T) celtherapie vertoont een grote belofte in de behandeling van kanker. 1 , 2 twee Car-T-celtherapieën gericht op CD19 (CART19) werden onlangs goedgekeurd in het Verenigd verklaarde en in Europa voor het gebruik in B celmaligniteiten na het aantonen van opvallende resultaten in multicenter klinische proeven. 3 , 4 , 5 barrières voor meer wijdverbreid gebruik van auto-T-cellen zijn beperkte activiteit in vaste tumoren en geassocieerde toxiciteiten, waaronder cytokine release SYNDROOM (....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dit protocol volgt de richtlijnen van de instellings Raad voor institutionele toetsing (IRB) en het Comité voor institutionele bioveiligheid (IBC) van de Mayo Clinic.
1. CART19 celproductie
- T-cel isolatie, stimulatie en ex-vivo cultuur
- Voer alle celkweek werkzaamheden uit in een celcultuurkap met behulp van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen. Oogst perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) van de geïdentificeerde normale donorbloed kegels die tijdens aferese worden verzameld, aangezien deze bekend staan als een levensvatbare bron van PBMCs.13
- Om PBMCs te isoleren, voegt u 15 m....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 1 toont reductie van GM-CSF in GM-CSFk/o CART19 cellen. Om na te gaan of het genoom van de T-cellen werd gewijzigd om GM-CSF te Knockout, werd getij sequencing gebruikt in de GM-CSFk/o CART19 cellen (Figuur 1a). AUTO-T-celoppervlak kleuring verifieert dat de T-cellen de auto-oppervlak receptor in vitro met succes uitdrukken door te geren op levende CD3 + cellen (Figuur 1b.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In dit rapport beschrijven we een methodologie om CRISPR/Cas9-technologie te gebruiken voor het opwekken van secundaire wijzigingen in CAR-T-cellen. Specifiek, dit wordt aangetoond met behulp van lentivirale transductie met een virale vector die gRNA gericht op het gen van belang en Cas9 voor het genereren van GM-CSFk/o CART19 cellen. We hadden eerder aangetoond dat GM-CSF neutralisatie CRS en NT in een xenotransplantaatmodellen is-model uitstraalt. 12 zoals eerder beschreven, maken GM-.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
SSK is een uitvinder van octrooien op het gebied van auto T-Cell therapie die zijn gelicentieerd aan Novartis (onder een overeenkomst tussen Mayo Clinic, University of Pennsylvania, en Novartis). Deze studies werden deels gefinancierd door een subsidie van Humanigen (SSK). RMS, MJC, RS en SSK zijn uitvinders van octrooien die verband houden met dit werk. Het laboratorium (SSK) ontvangt financiering van Tolero, Humanigen, kite, Lentigen, MorphoSys en actinium.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door subsidies van K12CA090628 (SSK), het National Comprehensive Cancer Network (SSK), het Mayo Clinic Center for geïndividualiseerde geneeskunde (SSK), de Predolin Foundation (SSK), de Mayo Clinic Office of translation to practice (SSK), en de Mayo Clinic Medical Scientist training programma Robert L. Howell arts-wetenschapper beurs (RMS).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0037-42 | |
| CD3 Monoclonal Antibody (UCHT1), APC, eBioscience | Invitrogen | 17-0038-42 | |
| Choice Taq Blue Mastermix | Denville Scientific | C775Y51 | |
| CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 | Gibco | 40203D | |
| CytoFLEX System B4-R2-V2 | Beckman Coulter | C10343 | flow cytometer |
| dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
| Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator) | Applied Biosystems | A13346 | |
| Easy 50 EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18002 | |
| EasySep Human T Cell Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17951 | negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer |
| Fetal bovine serum | Millipore Sigma | F8067 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD107a | BD Pharmingen | 555800 | |
| Fixation Medium (Medium A) | Invitrogen | GAS001S100 | |
| GenCRISPR gRNA Construct: Name: CSF2 CRISPR guide RNA 1; Species: Human, Vector: pLentiCRISPR v2; Resistance: Ampicillin; Copy number: High; Plasmid preparation: Standard delivery: 4 μg (Free of charge) | GenScript | N/A | custom order |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21235 | |
| https://tide.nki.nl. | Desktop Genetics | ||
| Human AB Serum; Male Donors; type AB; US | Corning | 35-060-CI | |
| IFN gamma Monoclonal Antibody (4S.B3), APC-eFluor 780, eBioscience | Invitrogen | 47-7319-42 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000075 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen | L34966 | |
| Lymphoprep | STEMCELL Technologies | 07851 | |
| Monensin Solution, 1000X | BioLegend | 420701 | |
| Mouse Anti-Human CD28 Clone CD28.2 | BD Pharmingen | 559770 | |
| Mouse Anti-Human CD49d Clone 9F10 | BD Pharmingen | 561892 | |
| Mouse Anti-Human MIP-1β PE-Cy7 | BD Pharmingen | 560687 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| NALM6, clone G5 | ATCC | CRL-3273 | acute lymphoblastic leukemia cell line |
| Nuclease Free Water | Promega | P119C | |
| Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.22uM, sterile | Genesee Scientific | 25-227 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with CN Membrane 0.45uM | Thermo Scientific Nalgene | 450-0045 | |
| Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X), Liquid | Gibco | 31985-070 | |
| PE-CF594 Mouse Anti-Human IL-2 | BD Horizon | 562384 | |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X), Liquid | Gibco | 10378-016 | |
| Permeabilization Medium (Medium B) | Invitrogen | GAS002S100 | |
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K182001 | |
| Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals, Inc. | 0210055210 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| Rat Anti-Human GM-CSF BV421 | BD Horizon | 562930 | |
| RoboSep-S | STEMCELL Technologies | 21000 | Fully Automated Cell Separator |
| SepMate-50 (IVD) | STEMCELL Technologies | 85450 | |
| Sodium Azide, 5% (w/v) | Ricca Chemical | 7144.8-16 | |
| X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Lonza | 04-418Q |
Referenties
- Kenderian, S. S., Ruella, M., Gill, S., Kalos, M. Chimeric antigen receptor T-cell therapy to target hematologic malignancies. Cancer Research. 74 (22), 6383-6389 (2014).
- Lim, W. A., June, C. H. The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer. Cell. 168
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
