Een Multilayer microfluidic platform voor de geleiding van langdurige cel-vrije genexpressie

Summary

Het fabricageproces van een op PDMS gebaseerd, meerlaagse, microfluïdisch apparaat waarmee in vitro transcriptie-en vertalings Reacties (IVTT) gedurende langere perioden kunnen worden uitgevoerd, wordt beschreven. Bovendien wordt een uitgebreid overzicht gegeven van de hardware en software die nodig is voor het automatiseren en onderhouden van deze reacties voor langdurige duur.

Abstract

De beperkingen van de cel-gebaseerde synthetische biologie worden steeds duidelijker als onderzoekers zijn gericht op het ontwikkelen van grotere en complexere synthetische genetische regelgevings circuits. De analyse van synthetische genetische regulerings netwerken in vivo is tijdrovend en lijdt aan een gebrek aan milieucontrole, met exogene synthetische componenten die interactie hebben met hostprocessen, wat resulteert in ongewenst gedrag. Om deze problemen te overwinnen, wordt de celvrije karakterisering van de nieuwe circuits steeds vaker. In vitro transcriptie-en vertaal (IVTT) mengsels maken de regulering van de experimentele omgeving mogelijk en kunnen worden geoptimaliseerd voor elk uniek systeem. De protocollen hier gepresenteerd detail de fabricage van een meerlaagse microfluïdische apparaat dat kan worden gebruikt om te ondersteunen ivtt reacties voor langdurige duur. In tegenstelling tot batch reacties, waarbij de middelen in de loop der tijd uitgeput raken en (per-) producten zich ophopen, maakt het gebruik van microfluïdische apparaten de aanvulling van middelen mogelijk, evenals het verwijderen van reactieproducten. Op deze manier wordt de cellulaire omgeving geëmuleerd door een out-of-evenwichts omgeving te handhaven waarin het dynamische gedrag van gencircuits gedurende langere tijd kan worden onderzocht. Om het meerlaagse microfluïdische apparaat volledig te benutten, zijn hardware en software geïntegreerd om de ivtt-reacties te automatiseren. Door het combineren van IVTT-reacties met het microfluïdische platform dat hier wordt gepresenteerd, wordt het mogelijk om complexe netwerk gedragingen uitgebreid te analyseren, wat ons inzicht in de mechanismen die cellulaire processen reguleren bevorderen.

Introduction

Cellen zijn in staat om te voelen en te reageren op hun omgeving met behulp van complexe dynamische regelgevende netwerken^1,2. Het gebied van synthetische biologie maakt gebruik van onze kennis van de natuurlijk voorkomende componenten die deze netwerken omvatten om biologische systemen te engineeren die de functionaliteit van de cellen^3,4kunnen uitbreiden. Omgekeerd is het ook mogelijk om ons begrip van de natuurlijke netwerken die het leven beheerst te ontwikkelen door het ontwerpen van vereenvoudigde, synthetische analogen van bestaande circuits of door voorwaarts-technische biologische systemen die van nature voorkomende gedragingen vertonen. De de Novo engineering van dergelijke biologische systemen wordt uitgevoerd in een bottom-up mode waar nieuwe genetische circuits of signalerings trajecten op een rationele manier worden ontworpen, met behulp van goed gedefinieerde delen^5,6. Het combineren van het rationele ontwerp van netwerken met het ontwerp van biologisch relevante systemen maakt de diepgaande karakterisering en studie van biologische regelgevingssystemen mogelijk met verschillende niveaus van abstractie⁷.

De pioniers werken van Elowitz en Leibler⁸ en Gardner et al.⁹ demonstreerden als eerste de succesvolle introductie van synthetische genetische netwerken in cellulaire hosts. In het volgende decennium, talrijke onderzoekers zijn blijven voortbouwen op deze eerste successen ondanks de opkomst van verschillende beperkingen met betrekking tot de invoering van synthetische circuits in cellen^{7,10,11 ,12}. Idealiter zou de introductie van synthetische circuits in cellulaire hosts op een modulaire manier moeten plaatsvinden. Helaas, de complexiteit van de cellulaire omgeving maakt dit bijzonder uitdagend, met de functie van vele delen en netwerken zijn zeer contextafhankelijke^12,13,14. Als gevolg hiervan, netwerken vaak ervaren ongewenste interacties met native host componenten die invloed kunnen zijn op de functie van het synthetische circuit. Evenzo kunnen componenten van het exogene netwerk hostprocessen remmen, concurreren voor gedeelde bronnen binnen de host en invloed hebben op de groei kinetiek^15,16,17. Om het gedrag van synthetische netwerken in een in vivo-omgeving rationeel te kunnen ontwerpen en voorspellen, is daarom een uitgebreid model van alle host-en circuitspecifieke dynamiek vereist¹⁸.

Een levensvatbaar alternatief voor het gebruik van cellulaire hosts voor de karakterisering van synthetische netwerken is de toepassing van in vitro transcriptie-en vertaaltechnologieën (IVTT). Optreden als testbed voor synthetische netwerken, worden reacties uitgevoerd in oplossingen die alle componenten omvatten die nodig zijn om genexpressie^19,20,21mogelijk te maken. Op deze manier wordt een biologisch relevante, zij het kunstmatige, omgeving gecreëerd waarbinnen synthetische netwerken kunnen worden getest^{22,23,24,25,26, 27,28}. Een groot voordeel van het gebruik van IVTT-oplossingen is de mogelijkheid om reacties uit te voeren onder door de gebruiker gespecificeerde omstandigheden, waarbij onderzoekers de precieze samenstelling van elke reactie²kunnen afstemmen. Bovendien maakt de cel-vrije aanpak het testen van synthetische netwerken met hoge doorvoer mogelijk, omdat het de noodzaak elimineert om tijdrovende stappen voor het klonen van cellen uit te voeren. Hierdoor wordt de duur van opeenvolgende cycli van ontwerp-build-test aanzienlijk verlaagd^29,30,31,32. De ontwerpcyclus kan verder worden versneld door gebruik te maken van celvrije kloontechnieken zoals de Gibson-assembly om nieuwe netwerken snel te engineeren, en door netwerken te bouwen van lineaire DNA-templates die-in tegenstelling tot de plasmiden die nodig zijn voor in vivo testen- kan worden versterkt via polymerase kettingreacties (PCR)^33,34.

Batch reacties zijn de eenvoudigste methode waarmee IVTT-reacties kunnen worden uitgevoerd, waarbij een enkelvoudig reactie vaartuig vereist is, waarbij alle reactie componenten worden gecombineerd³⁵. Dergelijke reacties zijn voldoende voor eiwit expressie en elementaire circuit testen maar blijken niet voldoende bij het bestuderen van het dynamische gedrag op lange termijn van een netwerk. In de loop van een batch reactie zijn reagentia uitgeput of worden ze afgebroken, wat resulteert in een continue afname van de transcriptie-en vertaal percentages. Bovendien, naarmate de reacties vooruitgang by-producten accumuleren die kunnen interfereren met-of volledig remmen-de juiste werking van het netwerk. Uiteindelijk beperkt het gebruik van batch reactoren het dynamische gedrag dat kan worden waargenomen, waarbij negatieve regulering bijzonder uitdagend is om^5,36te implementeren.

De veelzijdigheid van ivtt-systemen maakt het mogelijk om meerdere alternatieve methoden te gebruiken waarmee langdurige ivtt-reacties kunnen worden uitgevoerd, variërend van continue stroom tot druppel methoden en eenvoudigere dialyse benaderingen^{2,30, 37,38,39,40}. De toepassing van microfluïdische apparaten biedt gebruikers meer controle over hun reacties terwijl het verhogen van de doorvoer en het minimaliseren van de kosten^35,41,42, met elke specifieke aanpak met zijn eigen voordelen. Het gebruik van continue stroom kan gemakkelijk worden geoptimaliseerd voor het verhogen van de expressie opbrengsten het onvermogen om specifieke reactieproducten effectief te verwijderen maakt echter de studie van dynamisch gedrag niet-triviaal³⁹. Terwijl het gebruik van op basis van druppel gebaseerde microfluïdische systemen een high-throughput screening van nieuwe netwerken mogelijk maakt, is de moeilijkheid van het leveren van verse reagentia aan de reactie resulteert in de druppels die lijken op kleine volume batch reacties⁴³. Dialyse-gebaseerde reactoren maken de introductie van verse reagentia mogelijk, evenals het verwijderen van sommige reactieproducten echter, RNA moleculen en grotere eiwitten accumuleren in de reactor, te groot om te diffuus door de membraan poriën. Bovendien zijn grote hoeveelheden reagentia nodig om deze reacties gedurende langere perioden van^30,44te ondersteunen. In 2013, maerkl et al. presenteerde een meerlaagse microfluïdische inrichting speciaal ontworpen voor het uitvoeren van langdurige ivtt-reacties^36,45. Het gebruik van meerlaagse microfluïdische apparaten maakt directe controle over de vloeistofstroom mogelijk, waardoor de omleiding van de stroom en de isolatie van vloeistof in specifieke gebieden van het apparaat^46,47. Deze geïsoleerde gebieden kunnen functioneren als onafhankelijke nanoliter-reactie kamers waarin IVTT-reacties kunnen worden uitgevoerd. In de loop van een enkele IVTT-reactie worden periodieke injecties van verse reagentia in de reactor gebruikt om IVTT-componenten en DNA-templates aan te vullen. Tegelijkertijd wordt een gelijk volume van de oude reactie oplossing verplaatst, wat reactieproducten verwijdert. Op deze manier wordt een out-of-evenwichts omgeving gehandhaafd waar de basale transcriptie-en vertaal percentages in steady-state blijven, waardoor de levensduur van IVTT-reacties wordt voortgezet en er rijke dynamische gedragingen kunnen optreden. Door het toepassen van deze aanpak kunnen onderzoekers de kinetische percentages van de individuele processen die zich voordoen binnen een specifiek circuit onderzoeken, met als hulpmiddel de voorwaartse engineering van nieuwe genetische netwerken. Zo heeft Niederholtmeyer et al. deze benadering geïmplementeerd om verschillende elementen van een genetische ring oscillator te karakteriseren, waarbij de kinetische percentages daarvan worden bepaald³⁶. In verdere studies toonde Yelleswarapu et al. aan dat de kinetische percentages van Sigma factor 28 (σ₂₈), bepaald onder batch omstandigheden, onvoldoende waren om het gedrag van een σ₂₈-gebaseerde oscillator te beschrijven, en dat de toevoeging van gegevens op basis van stroom verbeterde model voorspellingen van het netwerk gedrag²².

Het doel van dit manuscript is om een compleet protocol te presenteren voor de fabricage van meerlaagse microfluïdische apparaten die op lange termijn IVTT-reacties kunnen uitvoeren. Daarnaast zal dit manuscript alle hardware en software beschrijven die nodig zijn om langdurige IVTT-reacties uit te voeren. De bediening van het microfluïdische apparaat-noodzakelijk om de stroom van vloeistoffen daarin te regelen-wordt bereikt met behulp van een reeks pneumatische kleppen die rechtstreeks verbinding maken met de microfluïdische apparaten via lengtes van slangen. De pneumatische kleppen worden op hun beurt bediend via een op maat gemaakte virtuele bedieningsinterface. Vloeistofstroom binnen de microfluïdische apparaten wordt bereikt met behulp van continue druk die wordt geleverd door een commercieel beschikbaar druk regulatie systeem. IVTT-reacties worden meestal uitgevoerd tussen 29 °C en 37 °C en een Microscoop-incubator wordt gebruikt om de temperatuur te reguleren tijdens reacties. De functionaliteit van het IVTT-mengsel degradeert echter geleidelijk bij opslag boven 4 °C. Als zodanig zal dit manuscript worden uitgebreid op het off-chip koelsysteem dat wordt gebruikt om het IVTT-mengsel vóór de injectie in het microfluïdische apparaat te koelen. Concluderend, dit manuscript biedt een uitgebreid overzicht van de procedures die nodig zijn om met succes langdurige IVTT-reacties uit te voeren met behulp van een microfluïdische stroom reactor, zodat andere onderzoekers deze technologie kunnen repliceren met relatieve Gemak.

Protocol

1. voorbereiding van de wafer

Opmerking: onze protocollen zijn specifiek voor de 40 XT positive fotoresist en SU8 3050 Negative fotoresist gebruikt tijdens dit onderzoek. Alternatieve photoresists kunnen worden gebruikt, maar de specifieke draaisnelheden, baktemperaturen en baktijden zullen variëren. Het ontwerp van de microfluïdische inrichting geleverd door Niederholtmeyer et al.³⁶ is gekoppeld in de tabel met materialen.

1. Leg twee schone silicium wafers (100 mm diameter, < 1-0-0 > georiënteerd, 525 μm dikte) in een voorverwarmde oven ingesteld op 250 °C en laat de wafers een nacht dehydraat (~ 16 h).
   Opmerking: het is ook mogelijk om de wafers met behulp van HMDS damp afzetting te prime; Dit is echter niet nodig als de wafers voldoende gedehydrateerd zijn.
2. Verwijder één silicium wafer uit de oven en laat het afkoelen tot kamertemperatuur voordat u doorgaat met de spin coating. Breng 3-4 ml van de 40 XT fotoresist aan op het midden van de wafer.
3. Voor het verkrijgen van een functie hoogte van 25 μm het volgende spin protocol toepassen: spin voor 20 s bij 500 rpm (110 rpm/s), Verhoog de spin snelheid tot 3100 rpm (300 rpm/s) en houd hier voor 30 s, en vertraent de wafer tot 0 rpm met een vertraging van 200 rpm/s. met behulp van een Microfiber weefsel voorzichtig verwijderen van elke rand beading die kan hebben plaatsgevonden tijdens de spin coating.
4. Zachte bak met twee aparte kookplaten ingesteld op 70 °C en 120 °C op de volgende manier: laat de wafer op 70 °C zitten gedurende 30 sec. Breng vervolgens de wafer over naar de 120 °C-kookplaat en laat deze hier rusten voor 3,5 minuten voordat u de wafer terugstuurt naar de 70 °C-kookplaat voor nog eens 30 s. Verwijder de wafer van de kookplaat en-Vermijd plotselinge temperatuurschokken-laat het afkoelen tot kamertemperatuur.
5. Plaats de stroomlaag photomask (emulsie side Down) op de fotoresist-film en stel de wafer bloot met een UV-lamp tot een totale blootstelling van 200 MJ/cm² wordt bereikt.
6. Bak na blootstelling met twee kookplaten (70 °C en 105 °C) op de volgende manier: laat de wafer op een Tempe vlak van 70 °C zitten voor 20 sec. voordat de wafer naar de 105 °C-kookplaat wordt overgebracht en deze hier voor 40 s laat staan. Keer ten slotte de wafer terug naar de 70 °C-kookplaat voor nog eens 20 sec. om de bak na de blootstelling te voltooien.
7. Laat de wafer afkoelen tot kamertemperatuur op een stapel microvezel weefsels. Ontwikkel de wafer door deze over te dragen naar een Petri schaaltje gevuld met 726 MIF fotoresist Developer om het ontwikkelingsproces te starten. De ontwikkeling wordt versneld bij het uitvoeren van een tafel shaker en de hele wafer wordt ondergedompeld in de ontwikkelaar.
8. Spoel de wafer met gedemineraliseerd water en gebruik een stereomicroscoop om het wafer oppervlak te controleren op elk fotoresist residu. Als er fotorensist resten te zien zijn, moet u de wafer teruggeven aan de ontwikkelaar.
9. Reflow de positieve fotororsist door de wafer gedurende 25 minuten op een hete plaat op 110 °C te plaatsen. Dit proces zal resulteren in afgeronde functies, evenals het gloeien van eventuele scheuren die kunnen zijn verschenen tijdens het fabricageproces. Ga verder met silanize the wafer zoals beschreven in stap 1,17.
10. Verwijder de tweede silicium wafer uit de oven, zodat deze op kamertemperatuur kan afkoelen voordat u doorgaat met de spin coating. Breng 5 ml SU8 3050 fotoresist aan op het midden van de wafer.
11. Voor het verkrijgen van een functie hoogte van 30 μm het volgende spin protocol toepassen: spin voor 20 s bij 500 rpm (110 rpm/s), Verhoog de spin snelheid tot 4.000 rpm (330 rpm/s) en houd hier voor 42 s, en Vertrag de wafer tot 0 rpm met een vertraging van 200 rpm/s. met behulp van een Microfiber weefsel voorzichtig verwijderen van elke rand beading die kan hebben plaatsgevonden tijdens de spin coating.
12. Zacht bakken met twee aparte kookplaten (65 °C en 95 °C) op de volgende wijze: laat de wafer op 30 sec. bij 65 °C zitten. Breng vervolgens de wafer over naar de 95 °C-kookplaat en laat het hier 14 minuten rusten voordat u de wafer terugstuurt naar de 65 °C-kookplaat voor nog eens 30 s. Verwijder de wafer van de kookplaat en laat deze afkoelen tot kamertemperatuur.
13. Meet de intensiteit van de UV-lamp vóór de blootstelling en gebruik deze om de blootstellingsduur te bepalen die nodig is om een totale blootstellingsdosering van 260 mJ/cm²te bereiken. Plaats de photomask (emulsie side Down) op de fotoresist film en plaats de wafer onder de UV-lichtbron. Stel de wafer bloot met een UV-lamp tot een totale blootstelling van 260 mJ/cm² wordt bereikt.
14. Bak na blootstelling met twee kookplaten (65 °C en 95 °C) op de volgende manier: laat de wafer op 65 °C zitten voor 60 s voordat de wafer naar de 95 °C-kookplaat wordt overgebracht en laat deze hier voor 4,5 min. keer de wafer terug naar de 65 °C kookplaat voor nog eens 30 sec. om de bak na de blootstelling te voltooien.
15. Laat de wafer afkoelen tot kamertemperatuur op een stapel microvezel weefsels. Ontwikkel de wafer door deze over te zetten naar een Petri schaaltje gevuld met mrDev-600 photodeveloper om het ontwikkelingsproces te starten. De ontwikkeling wordt versneld bij het uitvoeren van een tafel shaker en de hele wafer wordt ondergedompeld in de ontwikkelaar.
16. Spoel de wafer met isopropanol en gebruik een stereomicroscoop om het wafer oppervlak te controleren op elk fotoresist residu. Als er fotorensist resten te zien zijn, moet u de wafer teruggeven aan de ontwikkelaar. Eenmaal volledig ontwikkeld, hard bakken de fotoresist door het plaatsen van de wafer op een hete plaat ingesteld op 150 ° c voor 1 h.
17. Silanize beide wafers om de hechting van PDM'S tijdens de Soft-lithografie processen te voorkomen. Pipet 2-3 druppeltjes (per wafer) van het silaan in een kleine glazen injectieflacon om de silanisatie uit te voeren. Plaats deze injectieflacon, samen met de wafers in een exsiccator en trek vacuüm voor 5-10 min. verzegel de exsiccator en laat de wafers onder vacuüm gedurende een periode van 12 – 16 uur.
    Let op: de silaan is giftig en mag niet worden geïnhaleerd. Zorg dat u in een rook afzuigkap werkt en nitril handschoenen draagt bij het hanteren van de silaan. Dit omvat het plaatsen van de vacuümpomp in de damp afzuigkap bij het trekken van vacuüm op de exsiccator.
18. Laat het vacuüm los van de exsiccator en verwijder de gesilaniseerde wafers. Spoel met water en gebruik een stoom van N₂ om de wafers te drogen. De wafers kunnen op dit moment in de opslag worden geplaatst totdat ze nodig zijn.

2. fabricage van microfluïdische apparaten

Opmerking: het Soft-lithografie proces dat wordt gebruikt voor het fabriceren van PDMS gebaseerde meerlaagse microfluïdische apparaten kan worden onderverdeeld in drie verschillende stappen: 1) de voorbereiding van de PDM'S van zowel de flow-als de controlelagen, 2) de uitlijning en verlijming van de twee PDMS-lagen, 3) de voltooiing van het apparaat.

1. PDMS voorbereiding
   1. Bereid twee PDMS precursor oplossingen door de basis-en Uithardings middelen te combineren in een plastic bekerglas en gebruik een meng stang om de twee componenten tot volledig gemengd te roeren. De controlelaag vereist 20 g basis agent en 1 g Uithardings middel (20:1 ratio). De stroomlaag vereist 40 g van het basis middel en 8 g van het Uithardings middel (5:1 ratio). Degas de oplossingen in een exsiccator.
   2. Plaats de flow Layer wafer in een Petri schaaltje en giet de 5:1 ratio PDMS mengsel over de wafer. Degas de PDMS gedurende 30 minuten om luchtbellen te verwijderen.
   3. Spin Coat de Control Layer wafer (bereid met de negatieve SU8 3050photoresist) met 20:1 ratio PDMS. Giet 5-10 mL van de PDM'S op het midden van de wafer en voer het volgende spin protocol uit (behoud links over PDM'S voor later gebruik): spin bij 500 rpm gedurende 15 sec. (100rpm/s), Verhoog de spin snelheid tot 1450 rpm (300 rpm/s) voor 45 s en vertraagt de wafer tot 0 rpm (200 rpm/s).
   4. Om een homogene PDMS filmdikte te waarborgen, plaatst u de PDMS gecoate wafer op een vlak oppervlakte in een gesloten Petri schaaltje (om stof verontreiniging te voorkomen). Laat de wafer 30 minuten zitten.
   5. Verwijder de stroomlaag uit de exsiccator en plaats de stroom-en regel lagen in een oven (80 °C). Cure beide lagen voor 28-30 min en verwijder wanneer de PDMS is smeedbaar genoeg om te manipuleren, terwijl de resterende enigszins kleverig. Ga onmiddellijk verder met het uitlijnings proces.
2. Uitlijning en hechting
   1. Met behulp van een scalpel, Verwijder elk van de vier apparaten uit de PDMS op de stroomlaag wafer. Bij het verwijderen van de PDMS-laag van de silicium wafer moet u onmiddellijk de functie zijde bedekken met Scotch tape om stofdeeltjes verontreiniging te voorkomen.
   2. Lijn de stroomlaag blokken op de regellaag ruwweg uit met de ogen, waarbij de functie zijde van het apparaat in contact komt met de Control Layer PDMS. Breng vervolgens fijne aanpassingen aan op de positie van elk van de stroomlaag blokken om de kanalen van de stroomlaag uit te lijnen met de Control Layer-kanalen, met behulp van een stereomicroscoop om te helpen bij de visualisatie van de aanpassingen.
   3. Druk toe om luchtzakken tussen de twee PDMS-lagen te verwijderen. Giet de resterende 20:1-ratio PDM'S die eerder zijn opgeslagen rond de uitgelijnde stroomlaag blokken. Plaats 100 g gewichten op elk van de apparaten om te zorgen voor voldoende contact tijdens het lijmproces.
   4. Retourneer de uitgelijnde apparaten (met inbegrip van de gewichten) naar de 80 °C oven en laat ze ten minste 1,5 uur en niet langer dan 6 uur aan de binding.
3. Het apparaat afwerken
   1. Verwijder de wafer uit de oven en pak elk van de afzonderlijke apparaten uit de Control Layer wafer, die de functie zijde van elk apparaat bedekt met Scotch tape.
   2. In iteratief, Punch één gat voor elk van de 9 stroom laag inlaten, 24 Control Layer Channel inlaten, en de single flow Layer Outlet van elk apparaat. Punch het apparaat met de functie zijde naar boven gericht, met behulp van een camera om gaten te garanderen zijn geperforeerd binnen de grenzen van de functie.
   3. Reinig voor elk apparaat een enkele Microscoop glijbaan met isopropanol en aceton en droog de glaasjes onder een stroom van N₂. Plaats vervolgens de Microscoop glaasjes op een hete plaat ingesteld op 150 °C gedurende 15 minuten.
   4. Gebruik zuurstoftoevoer in het plasma om de PDMS-apparaten aan te sluiten op de glazen glijbanen, waarbij een asstroom van 50 W wordt toegepast voor 45 s. Zorg ervoor dat de functie zijde van het apparaat naar boven is gericht bij het verassen. Als u klaar bent, plaatst u de apparaatfunctie zijde omlaag op de glazen schuif, waarbij u druk toepast om gevangen gas tussen de oppervlakken te verwijderen.
   5. Plaats de gekleefde apparaten op een kookplaat ingesteld op 110 °C gedurende 1 uur. gewichten kunnen bovenop de apparaten worden geplaatst om de hechting van het apparaat te verbeteren.

3. hardware instellen

Opmerking: om de controle over de microfluïdische chips te bereiken, moeten tal van hardware worden geïnstalleerd en met elkaar verbonden. Er zijn drie afzonderlijke groepen hardware vereist: 1) pneumatisch regelsysteem voor de controle kanalen, 2) een pneumatische drukregelaar om de stroom van de reactie reagentia binnen het apparaat te regelen, en 3) een koelsysteem om de IVTT-reactie oplossing te koelen voordat injectie in het microfluïdische apparaat. In afbeelding 1vindt u een overzicht van de hardware-instellingen. Opgemerkt moet worden dat de hier verstrekte protocollen proberen zo algemeen mogelijk te zijn, maar er wordt verwezen naar bepaalde specifieke onderdelen die in ons onderzoek worden gebruikt. Alle hardware kan worden vervangen door alternatieven die dezelfde functie kunnen uitvoeren. In dergelijke gevallen kunnen de protocollen hier worden gebruikt om de algemene stappen te beschrijven die nodig zijn om het systeem en de vereisten van elk van de onderdelen in te stellen. Alternatieve hardware setups worden gepresenteerd door Brower et al.⁴⁸ en wit en straten⁴⁹.

1. Pneumatisch regelsysteem (Zie Figuur 2)
   1. Gebruik het Protocol van de fabrikant om een TCP-verbinding tot stand te brengen tussen de veldbuscontroller en het gebruikers werkstation. Gebruik besturingssoftware (meegeleverd als aanvullende bestanden) om MODBUS-opdrachten samen te stellen die via de TCP-verbinding naar de controller worden verzonden en de magneetventielen in werking stellen.
   2. Breid de veldbuscontroller uit met acht 4-kanaals digitale uitgangsmodules, één voor elke magneetklep die wordt gebruikt. Elke magneetklep presideert een verbindende pin. Sluit de positieve draad aan op een van de vier positieve uitgangen op een van de digitale uitgangsmodules terwijl de negatieve draad wordt aangesloten op een van de grond poorten van de digitale uitgangsmodules.
      Opmerking: om het systeem correct te laten werken, moeten de elektromagneten systematisch worden aangesloten, waarbij de eerste solenoïde wordt aangesloten op de eerste uitgangspoort, de tweede solenoïde naar de tweede uitgangspoort, enzovoort. In ons systeem worden twee ventiel arrays gebruikt met respectievelijk 8 en 22 magneetventielen. Uitgangspoorten 1-8 Maak verbinding met de 8-kleppen array en uitvoerpoorten 9-30 Maak verbinding met de 22-kleppen array.
   3. Verbind beide ventiel arrays met een perslucht bron met behulp van 1/4 "buizen. Gebruik drukregelaars om de druk van de 22-kleppen array in te stellen op 3 bar en de 8-kleppen array tot 1 bar.
2. Regulering van de stromingsdruk (Zie Figuur 3)
   Opmerking: om vloeistoffen door de stroomlaag van het microfluïdische apparaat te kunnen stromen, wordt een in de handel verkrijgbare drukregelaar met 4 poorten gebruikt. De Uitgangsdruk van elke poort wordt geregeld via software die bij de drukregelaar wordt geleverd. Sluit de drukregelaar aan op een computer met behulp van de meegeleverde USB-aansluiting.
   1. Sluit de drukregelaar aan op een perslucht bron en zorg ervoor dat de meegeleverde druk de door de regulator toegestane maximale druk niet overschrijdt.
   2. Sluit een mannelijke Luer aan op 3/32 "Barb connector aan elk van de vier vrouwelijke Luer Lock uitgangspoorten van de drukregelaar. Sluit een lengte van zachte slang (OD: 3 mm, ID: 1 mm, L: 10 cm) aan op de Barb.
   3. Sluit een tweede mannelijke Luer aan op 3/32 "Barb connector aan het open uiteinde van de zachte slang en bevestig deze aan de vloeistof reservoir connector poorten.
   4. Gebruik de meegeleverde software om de gewenste druk van elke uitlaat van de stromings regelaar in te stellen, waarbij de in de reservoirs opgeslagen reagentia onder druk worden gezet om de stroom van de reagentia naar het microfluïdische apparaat te leiden. De aansluiting van de reservoirs op het microfluïdische apparaat zal worden besproken in de paragraaf 4,2.
3. Off-chip koeling instellen (Zie Figuur 4)
   1. Gebruik PVC-buizen (OD: 10 mm, ID: 6 mm) om het waterkoelsysteem aan te sluiten op het koudwaterblok met behulp van compressie fittingen. Vul het vloeistof reservoir van het waterkoelsysteem met een koelmiddel en kantel het apparaat zachtjes om de ingesloten lucht te verdringen, en voeg voortdurend koelvloeistof toe aan het reservoir om ervoor te zorgen dat het vol blijft. Wanneer al het gas uit het systeem wordt verwijderd, vult u het reservoir tot ongeveer 90-95% van het maximale volume.
   2. Coil PTFE-slang (OD: 0,042 ", ID: 0,022") op het koude gezicht van het Peltier-element en bevestig dit met tape. Zorg ervoor dat het ene uiteinde van de PTFE-slang is aangesloten op de reservoirs van het stroomlaag druk regelsysteem (zoals beschreven in punt 4,3). Het andere uiteinde van de PTFE-slang mag niet meer dan 1 cm van het Peltier-oppervlak uitsteten. Plaats een 5 – 10 cm lengte van PEEK tubing (OD: 0,794 mm, ID: 0,127 mm) in het uitstekende uiteinde van de PTFE-slang. De vulling van de slang en de verbinding met het microfluïdische apparaat wordt verder toegelicht in punt 4,3.
   3. Plaats de hete zijde van het Peltier-element op de koude plaat van het Waterblok en breng voldoende thermische verbinding aan op de twee gezichten. Zorg ervoor dat de slang, het Peltier-element en het koelblok te allen tijde direct in contact staan met elkaar.
   4. Sluit het Peltier-element aan op de temperatuurregelaar (via een seriële bus-aansluiting), zodat de spanning die aan de Peltier wordt geleverd, kan worden geregeld. Plaats een thermistor veilig op het Peltier-oppervlak en verbind de uitgang met de temperatuurregelaar. Pas na het inschakelen van de waterkoeler de aan het Peltier geleverde spanning aan tot de temperatuur stabiel is bij 4 °C.
      Opmerking: met deze instelling wordt de Peltier-temperatuur handmatig geregeld door de meegeleverde spanning aan te passen, terwijl de thermistor alleen de temperatuur bewaakt.

4. een experiment voorbereiden

Opmerking: voorafgaand aan het starten van een experiment moet het microfluïdische apparaat worden voorbereid, en de reactie reagentia moeten in de juiste slang worden gestoken voor injectie in het apparaat. In deze sectie wordt besproken: 1) de aansluiting van de besturingskanaal slang op het apparaat, 2) de aansluiting van ongekoelde instroom reagentia op het apparaat, en 3) de aansluiting van gekoelde instroom reagentia op het apparaat.

1. De slang van het besturingskanaal aansluiten
   1. Knip voor elk van de controle kanalen van het microfluïdische apparaat een Slanglengte (OD: 0,06 ", ID: 0,02"). Steek aan de ene kant de SPELD van een 23 G, 1/2 "Luer stub en aan de andere insert een RVS verbindingspen (OD: 0,65 mm, ID: 0,35 mm, L: 8 mm).
   2. Sluit de Luer stub aan op een mannelijke Luer op 3/32 "Barb nylon connector. Steek de Barb van de connector in een lengte van polyurethaan slang (OD: 4 mm, ID: 2,5 mm). Plaats deze polyurethaan slang rechtstreeks in een van de magneetventielen.
   3. Bevestig een 23 G, 1/2 "Luer stub aan een spuit en steek deze in een kort (3-4 cm) stuk slang (OD: 0,06", ID: 0,02 "). Plaats het open uiteinde van deze slang in een reservoir van ultrapuur water en vul de spuit met ultrapuur water.
   4. Het nummer van elk controlekanaal van het microfluïdische apparaat, zoals weergegeven in Figuur 5. Voor elk kanaal (met uitzondering van de controle kanalen 1 tot en met 3, die niet gevuld zijn met water), vindt u de corresponderende slang (aangesloten op de magneetventielen) en plaatst u een metalen pen in het open uiteinde van de slang die op de spuit is bevestigd. Injecteer het water in de slang van het besturingskanaal tot de helft van de lengte is gevuld.
   5. Koppel de slang los van de spuit en steek de RVS connector PIN in het overeenkomstige gat van het microfluïdische apparaat. Herhaal dit voor alle controle kanalen.
   6. Gebruik de bedieningsinterface om alle magneetventielen te openen. Dit zal de vloeistof binnen de slang van het besturingskanaal onder druk zetten, waardoor het in het microfluïdische apparaat wordt gedwongen en alle op membraan gebaseerde kleppen in het apparaat worden gesloten. In Figuur 6wordt een voorbeeld gegeven van open en gesloten membranen binnen het apparaat.
2. Niet-gekoelde reagentia aansluiten op het apparaat
   1. Snijd voor elk van de ongekoelde reagentia een Slanglengte (OD: 0,06 ", ID: 0,02") om de reservoir uitlaat aan te sluiten op de microfluïdische apparaatinlaten.
   2. Neem één uiteinde van de slang en plaats deze in het reservoir, zodat de slang de basis van het reservoir bereikt. De afvoer van de reservoir slang moet zodanig worden aangescherpt dat een luchtdichte afdichting wordt bereikt. Plaats een roestvrijstalen verbindingspen (OD: 0,65 mm, ID: 0,35 mm, L: 8 mm) in het open uiteinde van de slang.
   3. Bevestig een 23 G, 1/2 "Luer stub aan het uiteinde van een kleine (1 mL) spuit. Voeg een korte lengte slang (OD: 0,06 ", ID: 0,02") toe aan de Luer stub. Als u het uiteinde van de slang in de gewenste reagens oplossing plaatst, vult u de spuit met het reagens.
   4. Steek de roestvrijstalen connector PIN in de polyurethaan slang die op de spuit is aangesloten en vul de slang met het reagens. Bij het gebruik van kleine reactievolumes komt het reagens niet in het reservoir en de slang zelf zal fungeren als het reservoir. Koppel de spuit los en steek de connector-PIN in een van de stroomlaag inlaat gaten van het microfluïdische apparaat.
   5. Druk op elk van de reservoirs met behulp van de drukregelaar software om de reagentia in het microfluïdische apparaat te forceren.
3. Het aansluiten van gekoelde vloeistoffen op het microfluïdische apparaat
   1. Zorg ervoor dat de waterkoeler en het Peltier-element zijn ingeschakeld, met de oppervlaktetemperatuur van de Peltier ingesteld op 4 °C. Monteer de koelinstallatie zo dicht mogelijk bij het microfluïdische apparaat, waardoor het ongekoelde volume tussen de Peltier en de inlaat van het apparaat geminimaliseerd wordt.
   2. Sluit het open uiteinde van de PTFE-slang aan op slangen die zijn aangesloten op een van de vloeistofreservoirs (zoals beschreven in punt 4,2) met behulp van een roestvrijstalen connector pin (OD: 0,65 mm, ID: 0,35 mm, L: 8 mm).
   3. Sluit een kleine spuit (1 mL) aan op een Luer stub (23 G, 1/2 ") met een korte lengte slang (OD: 0,06", ID: 0,02 ") die aan het uiteinde is bevestigd. Vul de spuit met het te koelen reagens (hier, de IVTT-reactie oplossing).
   4. Verbind de PEEK slang met de spuit via de BIND slang en breng constante druk aan op de spuit, waardoor het reagens door de PEEK slang en in de PTFE-slang wordt gedwongen. Koppel de PEEK slang uit de spuit en steek deze rechtstreeks in een van de stroom kanaal inlaten van het microfluïdische apparaat. Wanneer druk wordt uitgeoefend via de drukregelaar software wordt het gekoelde reagens in het microfluïdische apparaat gedwongen.

5. experimenten

Opmerking: voorafgaand aan het uitvoeren van experimenten moeten alle hardware-en slangverbindingen die in de protocollen secties 3 en 4 zijn beschreven, worden voltooid en moeten alle reagentia op het apparaat zijn aangesloten. De experimentele procedure kan vervolgens worden onderverdeeld in vier verschillende delen: 1) het laden van het microfluïdische apparaat, 2) voorbereiding van de Microscoop, 3) de kalibratie van het apparaat, en 4) het uitvoeren van het experiment. De aangepaste virtuele bedieningsinterface (Zie Figuur 7) die in dit onderzoek wordt gebruikt, wordt geleverd als een aanvullende bron via de lijst met materialen)

1. Het microfluïdische apparaat laden
   1. Plaats het microfluïdische apparaat met alle besturings-en stroomlaag slangen die in de Microscoop-fase zijn bevestigd en sluit alle openingen op de incubator. Stel de omgevingstemperatuur van de incubator in op 29 °C. Zorg ervoor dat het koelsysteem is ingeschakeld en is ingesteld op 4 °C voordat het experiment wordt gestart.
   2. Zorg ervoor dat alle stroom-en regel kanalen onder druk staan. Stel de druk van de controle kanalen in op 1-3 bij 1 bar en druk op controle kanalen 9-29 bij 3 bar. Voor de reagentia moet een druk van tussen de 20 en 100 mbar worden aangebracht op de vloeistofreservoirs met behulp van de drukregelaar software.
   3. Verwijder lucht uit het microfluïdische apparaat met behulp van een van de reagentia. Sluit de uitlaat van het apparaat (druk Control Channel 29) en tegelijkertijd depressieve controle kanalen 1-3, en 15-28. Vervolgens selectief indrukken van de controle kanalen van de multiplexer om het geselecteerde reagens te laten stromen in het apparaat. Gebruik de Microscoop om het verwijderen van lucht te controleren.
      Opmerking: in het geval dat reagentia niet correct in het apparaat worden geladen of dat de luchtbellen niet worden verwijderd, kan de druk worden verhoogd tot 350 mbar.
   4. Zorg ervoor dat alle reagentia correct stromen, zonder lucht te introduceren met de Flush -functie in de besturingssoftware. De bewaking van de vloeistofstroom kan worden vereenvoudigd door eerst een de te laden en de verplaatsing ervan door afzonderlijke reagentia te bewaken.
2. Voorbereiding van de Microscoop
   1. Gebruik de Microscoop om alle nuttige punten (een enkel punt binnen elke reactor volstaat) binnen het microfluïdische apparaat te lokaliseren en de coördinaten daarvan op te slaan. Deze punten zullen worden afgebeeld tijdens de kalibratie en experimentele processen.
      Opmerking: tijdens de kalibratie en experimentele procedures die zijn opgenomen in de besturingssoftware, wordt de Microscoop geïnstrueerd om periodiek beelden op de eerder opgeslagen coördinaten vast te leggen. Om dit te bereiken, communiceert de besturingssoftware met de Microscoop-software en informeert deze om nieuwe beelden op te nemen. Deze communicatie is uniek voor elke Microscoop Setup en als zodanig is deze functionaliteit aangepast binnen de meegeleverde software-interface. Voorzien is een dummy uitvoerbaar, die kan worden gewijzigd door de eindgebruiker voor compatibiliteit met hun eigen Microscoop systeem.
3. Het microfluïdische apparaat kalibreren
   1. Bepaal het vloeibare volume dat uit elke reactor wordt verplaatst tijdens een enkele instroom-stap (pomp sequentie geleverd door peristaltisch bediende controle kanalen 15-17, bestaande uit 6 Modbus-commando's die opeenvolgend worden uitgevoerd), door het kalibratieprotocol uit te voeren meegeleverd in het softwarepakket.
   2. Stel de volgende gegevensvelden in binnen de besturingssoftware: elutie buffer kanaal, Fluorophore Channel, aantal verdunnings cycli (standaard is 10 verdunningen), aantal inflow stappen (standaard is 15 stappen), aantal Meng cycli (de standaardwaarde is 4 cycli) en de tijd tussen de Meng cycli (de standaardwaarde is 0 seconden). Start de kalibratie door te drukken op kalibratie-experiment uitvoeren.
      Opmerking: tijdens het kalibratieproces worden alle reactoren gevuld met een de en worden beelden opgenomen. Vervolgens wordt een reeks verdunningen uitgevoerd wanneer een eluens wordt gemeten in de reactoren (op basis van het ingestelde aantal instroom-stappen), waardoor de fluorophore wordt verplaatst. Na grondig mengen worden nieuwe beelden genomen. Dit proces wordt herhaald voor het ingestelde aantal verdunnings cycli.
   3. Na voltooiing van de kalibratie volgt u de stappen die door de besturingssoftware worden weergegeven en voltooit u de analyse van het kalibratie experiment.
      Opmerking: de analyse biedt gebruikers de vernieuwings ratio voor elke reactor op basis van de afname van de fluorescentie die is geregistreerd tijdens elke verdunnings cyclus. Deze waarde geeft de Fractie van het reactorvolume aan die wordt verplaatst door het ingestelde aantal inflow stappen. Op zijn beurt wordt deze waarde gebruikt tijdens experimenten om te bepalen hoeveel instroom stappen nodig zijn om een specifiek reactorvolume te verplaatsen.
4. Het experiment uitvoeren
   1. Stel de vereiste waarden in voor het gewenste experiment binnen de virtuele besturingsinterface. Kritisch is de vernieuwings breuk [%] die bepaalt welk reactorvolume wordt verplaatst per experimentele cyclus en moet worden ingesteld tussen 15 en 40%.
      Opmerking: het specifieke experimentele protocol bepaalt welke velden van de besturingsinterface moeten worden ingesteld voordat het experiment wordt geïnitieerd. Sommige kleine codering zal nodig zijn om de controle-interface aan te passen voor nieuwe experimenten.
   2. Start het experimentele protocol door op de knop experiment uitvoeren in de bedieningsinterface te drukken.
      Opmerking: ongewijzigd, de meegeleverde software initieert een eenvoudige eiwit expressie. Reactoren 1 en 8 worden gebruikt als controles, terwijl reactoren 2-7 huis identieke experimenten. Hier omvat 75% van het reactorvolume IVTT-oplossing, en 25% is ofwel ultrapuur water of een lineaire DNA-oplossing van 2,5 nM. Elke 15 minuten worden verdunningen uitgevoerd, waarbij 30% van het reactorvolume per verdunning wordt verplaatst. Aan het einde van elke verdunnings cyclus worden beelden geregistreerd.

6. gegevensanalyse

Opmerking: er zijn scripts voorzien voor de analyse van de afbeeldingen (Zie aanvullende bestanden of de tabel met materialen), waarbij gebruik wordt maken van het analyse pakket ' bfopen ' , dat vereist is voor de herziening van '. ND2' bestanden (geleverd door onze Microscoop Setup).

1. Voer het Analysis script 'Kalibrationscript. m' uit en selecteer het gewenste bestand '. ND2'. Er wordt een enkel reactor beeld getoond waarmee de juiste beeld intensiteit kan worden bepaald. Gebruik de schuifregelaar om de beeld intensiteit zodanig te optimaliseren dat de randen van het microfluïdische kanaal duidelijk zichtbaar zijn.
2. Er wordt een beeld van de reactor getoond. Selecteer binnen deze afbeelding een gebied binnen het reactor kanaal waarvan de intensiteit van de fluorescentie moet worden bepaald.
   Opmerking: de intensiteit van de fluorescentie van elke reactor, voor elk opgenomen beeld zal worden bepaald met de resultaten weergegeven in een eenvoudige plot, waardoor de visualisatie van de resultaten.

Results

Om de effectiviteit van het meerlaagse microfluïdische platform voor de geleiding van ivtt-experimenten aan te tonen, werd de beschreven Setup gebruikt om het degfp-eiwit uit te drukken. Het experiment werd uitgevoerd in een in de handel verkrijgbare³⁰ ivtt-reactiemengsel-bestaande uit alle benodigde transcriptie-en vertaal componenten-aangevuld met reactie SUBSTRATEN en DNA-templates. Experimenten werden uitgevoerd bij een temperatuur van 29 °C; een temperatuur die optimaal is bevonden voor de IVTT-expressie van eiwitten.

Het microfluïdische apparaat bezit negen unieke inlaten, waarvan er vier tijdens dit experiment werden gebruikt. De eerste bevatte het commercieel verkregen IVTT-reactiemengsel. Het IVTT-reactiemengsel herbergt alle componenten die nodig zijn om eiwitten met succes uit te drukken, maar gezuiverde GamS werd toegevoegd aan het reactiemengsel-bij een eindconcentratie van 1,3 μM-voorafgaand aan het laden in het microfluïdische apparaat. De toevoeging van het GamS-eiwit dient om de afbraak van lineaire DNA-soorten te minimaliseren bij het uitvoeren van de experimenten. Cruciaal is het IVTT-mengsel geïnjecteerd in buisjes van polytetrafluorethyleen (PTFE) op een Peltier-element met een oppervlaktetemperatuur van 4 °C om de oplossing vóór de injectie ervan in het microfluïdische apparaat af te koelen; voorkomen van de afbraak van de reactie oplossing voorafgaand aan het gebruik ervan. Micro-boring polyether ether ketone (PEEK) tubing werd gebruikt voor het aansluiten van de PTFE-slang die het Peltier-element oppervlak met het microfluïdische apparaat verlaat, waardoor het volume van het IVTT-reactiemengsel niet wordt gekoeld. De tweede oplossing ingevoegd in het apparaat bevatte de lineaire DNA-sjablooncode ring voor de deGFP-opgelost in ultrapuur water-bij een concentratie van 10 nM. De derde oplossing, ultrapuur water, diende meerdere doeleinden tijdens de experimentele procedures. In de eerste plaats werd het ultrapuur water gebruikt om ervoor te zorgen dat het verplaatste volume per verdunning gelijk was voor alle reactoren, wat als vervanging van het DNA in de controle reacties optrad. Bovendien werd ultrapuur water ook gebruikt om de de te verdunnen tijdens de kalibratie van het apparaat en om het dode volume van het apparaat te spoelen bij het schakelen tussen reagentia. De uiteindelijke oplossing die in het apparaat is gestoken, was een gezuiverde FITC-dextran-oplossing (25 μM) die nodig was om de initiële kalibratie van het apparaat uit te voeren. De DNA-, water-en de-oplossingen werden geïnjecteerd in slangen (0,02 "-id, 0,06" od) die vervolgens in een van de instroom-kanalen van het microfluïdische apparaat kunnen worden ingebracht, zoals per sectie 4,2 van de protocollen. Als zodanig werden deze oplossingen bij 29 °C opgeslagen voor de gehele experimenten.

De aansturing van de controle kanalen van het microfluïdische apparaat wordt bereikt via aangepaste besturingssoftware waarbij elk van de controle kanalen individueel bediend kan worden. De uitvoering van langdurige IVTT-reacties kan niet worden bereikt via dit handmatige proces en vereist het gebruik van geautomatiseerde protocollen die zijn opgenomen in de besturingssoftware. Bij de voorbereiding van een microfluïdisch apparaat voor experimenten kunnen soortgelijke geautomatiseerde protocollen worden gebruikt om een aantal nuttige processen uit te voeren: het afspoelen van het dode volume van het apparaat met een nieuw reagens, het mengen van de reagentia in de ring reactor en het laden van een nieuw reagens in de reactor terwijl een gelijk volume van de huidige oplossing wordt verplaatst. Daarnaast zijn er twee complexe processen beschikbaar: de geleiding van een kalibratie van het apparaat en de uitvoering van een verlengde cel-vrije eiwit expressie. Alle bovengenoemde processen kunnen eenvoudig worden uitgevoerd vanuit de Hoofdinterface, naast de mogelijkheid om meerdere parameters te configureren om specifieke proces instellingen te variëren, zoals het instroom-kanaal, het instroom volume en de Meng duur.

Als gevolg van schommelingen in de druk en onvolkomenheden tijdens de fabricage van microfluïdische apparaten, kan het volume van de ontheemde vloeistof tijdens een enkele injectie cyclus variëren tussen apparaten. Als zodanig werd voorafgaand aan het uitvoeren van IVTT-experimenten het volume van de ontheemde reactor per injectie cyclus (vernieuwings breuk) bepaald. Deze kalibratie vereist het vullen van alle acht reactoren met een fluorescerende referentieoplossing. In dit geval werd een gezuiverde FITC-dextran-oplossing (25 μM) gebruikt. Vervolgens worden de reactoren 10 keer verdund met ultrapuur water. Door de afname van de fluorescentie per verdunnings cyclus voor elke reactor te meten, werd het volume van de ontheemde vloeistof tijdens één enkele injectie cyclus bepaald. Binnen de besturingssoftware werd deze waarde (de vernieuwings ratio) geregistreerd voor gebruik tijdens het ivtt-experiment. Cruciaal, om rekening te kunnen maken met variaties in de stroomsnelheid over het apparaat, evenals discrepanties in de afzonderlijke reactor volumes, wordt de vernieuwings verhouding bepaald en opgeslagen voor elke afzonderlijke reactor. De volgorde van vullen en verdunen van de reactoren werd automatisch uitgevoerd met behulp van het kalibratie programma uitvoeren dat deel uitmaakt van de besturingssoftware. De resultaten van het kalibratie-experiment worden weergegeven in Figuur 8.

Het meest complexe voorgeprogrammeerde proces voert een langdurig IVTT-experiment uit, zodat gebruikers het experiment kunnen starten en vervolgens zonder toezicht tot de voltooiing van de procedure worden uitgevoerd. Tijdens het experiment werden reactoren 1 en 5 gebruikt als blanco's, waarbij alleen water werd toegevoegd aan de reactoren tijdens verdunningen. Reactoren 2 en 6 werden gebruikt als negatieve controles en bevatte alleen de IVTT-reactie oplossing en ultrapuur water. De overgebleven reactoren (3, 4, 7 en 8) bevatte de IVTT-reactie oplossingen en 2,5 nM lineaire DNA-codering voor het deGFP-gen. De initialisering van de reactoren wordt bereikt door alle reactoren (met uitzondering van 1 en 5) volledig te vullen met de IVTT-reactie oplossing, voordat 25% van het reactorvolume werd verplaatst met ultrapuur water. Hierna werd de periodieke injectie van reagentia in de reactoren geïnitieerd. Het experiment werd zodanig uitgevoerd dat er elke 14,7 minuten nieuwe reagentia in de reactoren werden geïnjecteerd, waarbij 30% van het reactorvolume tijdens elke verdunnings cyclus werd verplaatst. De samenstelling van elke injectie was zodanig dat 75% van de geïnjecteerde vloeistof een verse IVTT-oplossing bevatte, terwijl de resterende 25% uit DNA-of ultrapuur water bestond. Na elke injectie van nieuwe reagentia werden de reactoren continu gemengd, waarna een fluorescentie beeld van elke reactor werd opgenomen met behulp van de Microscoop. De reactie werd vervolgens toegestaan om continu te lopen voor 68 cycli, resulterend in een experimentele duur van 16,5 h. De resultaten van dit experiment worden gegeven in Figuur 9.

Bij het uitvoeren van langdurige IVTT-experimenten zijn er twee hoofdoorzaken voor het falen van een reactie; de introductie van lucht in het microfluïdische apparaat of de afbraak van de IVTT-reactie oplossing. Het optreden van lucht binnen het microfluïdische apparaat is meestal het directe gevolg van kleine luchtbellen bestaande in de instroom-oplossingen, die vervolgens worden geïnjecteerd in het microfluïdische apparaat. Bij binnenkomst in het apparaat remt de aanwezigheid van lucht de juiste vloeistofstroom, waarbij de reacties niet langer periodiek worden vernieuwd, wat leidt tot de vorming van batch reacties binnen de reactor ringen. In sommige gevallen wordt de lucht langzaam van het apparaat verwijderd door het herhaaldelijk spoelen van reagentia, waarna de reactie naar verwachting voortduurt (zoals weergegeven in Figuur 9). In andere gevallen blijft de lucht gevangen en kan alleen worden verwijderd door het experiment te onderbreken en vervolgens continue (hoge) druk toe te passen op de stroomlaag van het microfluïdische apparaat, analoog aan het vulproces zoals beschreven in punt 5,1 van de protocollen. Tijdens onze experimenten wordt het cellysaat opgeslagen in PTFE-slang op een Peltier-element gekoeld tot 4 °C. Beide maatregelen helpen bij het beperken van de afbraak van de IVTT-reactie oplossing in de loop van de tijd, met de inerte PTFE-slang die zorgt voor een beperkte interactie tussen de slang en de reactie oplossing en de koude temperaturen die de functionele (bio) moleculaire componenten vereist voor het uitvoeren van ivtt. Moet afbraak van de reactie oplossing optreden-als gevolg van onvoldoende koeling of ongewenste interacties tussen de reactie oplossing en de opslagomgeving-dan zal dit zichzelf experimenteel vertonen als een geleidelijke vermindering van eiwit expressie in de loop van de tijd. Eenmaal gedegradeerd, kan de IVTT-reactie oplossing niet worden hersteld en moet een nieuw experiment worden voorbereid.

Figuur 1. De hardware-instellingen die nodig zijn om continue IVTT-reacties uit te voeren. A) Schematische voorstelling van de hardware-instelling. B) foto van de opstelling die in dit manuscript wordt gebruikt. De implementatie van een meerlaagse microfluïdisch apparaat voor continue ivtt-reacties vereist een uitgebreide hardwareconfiguratie voor het reguleren van de stromingsdruk, het bedienen van controle kanalen, hitte-en koele reacties en reagentia, opslag vloeistoffen en het beeld van het apparaat tijdens Experimenten. Experimenten worden uitgevoerd bij een temperatuur van 30 °C, die wordt bereikt door de Microscoop in een incubator te plaatsen die op deze temperatuur is ingesteld. Om verslechtering van de IVTT-reactie oplossing te voorkomen, wordt deze opgeslagen in PTFE-slang die over het koude gezicht van een Peltier-element is gerold. De temperatuur van het Peltier-element is ingesteld op 4 °C, met een waterkoeler en Waterblok dat wordt gebruikt om deze temperatuur te behouden. Reagentia die niet moeten worden gekoeld, worden opgeslagen in vloeistofreservoirs buiten de Microscoop-incubator. Bij deze reservoirs wordt een constante druk uitgeoefend door een computergestuurde drukregelaar. Op deze manier worden de vloeistoffen geforceerd door de Uitlaatslang van de reservoirs, die rechtstreeks verbinding maken met de instroom-kanalen van het microfluïdische apparaat. Elk van de controle kanalen van het microfluïdische apparaat is aangesloten op een pneumatische klep. De gehele ventiel-array staat onder constante druk. Het openen van de klep, zorgt voor druk van de vloeistof binnen de slang die de pneumatische klep verbindt met het controlekanaal van het microfluïdische apparaat, waardoor de PDMS-membranen die in het microfluïdische apparaat worden aangetroffen, worden geopend en gesloten. De pneumatische kleppen worden geopend en gesloten via een gebruikersinterface die een veldbuscontroller (niet getoond) commando's om specifieke pneumatische kleppen te openen en te sluiten. Figuur aangepast van Yelleswarapu et al.²². Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2. Overzicht van de pneumatische klep installatie-en besturingskanaal aansluiting. Een 8-kleppen array wordt getoond met drie regel kanaalaansluitingen op kleppen 1, 2 en 3. Perslucht kan worden geleverd aan de ventiel array via 1/4 "buizen. Voor de bediening van de controle kanalen worden twee drukken gebruikt: 1 bar voor de onderste druk regelkanalen (1, 2 en 3) en 3 bar voor de hogere druk regelkanalen (9 tot en met 30, hier niet weergegeven). De slang kan worden gevuld met ultrapuur water en ingebracht in een van de bedienings kanaal inlaten met behulp van een RVS connector pin. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3. Overzicht van de commerciële flow Pressure regulator en het reservoir systeem. Een in de handel verkrijgbare drukregelaar wordt gebruikt om vloeistoffen in de stroomlaag van het meerlaagse microfluïdische apparaat te injecteren. Het aansluiten van de drukregelaar op een computer zorgt voor modulatie van de druk die wordt gebruikt om de vloeistof injecties uit te voeren. Reagentia kunnen worden opgeslagen in een vloeistof reservoir, dat rechtstreeks is aangesloten op de drukregelaar. Door de toepassing van de druk op het reservoir wordt de vloeistof uit het reservoir via de Uitlaatslang geforceert. Deze uitlaatslang kan direct worden aangesloten op een van de vloeistof inlaten van het microfluïdische apparaat met behulp van een roestvrijstalen connector pin. In het geval dat het reagensvolume het vloeistof reservoir niet kan bereiken, fungeert de Uitlaatslang als reservoir voor het reagens. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4. Overzicht van het koelsysteem dat wordt gebruikt om reactie reagentia te koelen. (Links) geïsoleerde koeling Setup en (rechts) koeling Setup geplaatst in de Microscoop en aangesloten op het microfluïdische apparaat. Een Peltier-element wordt gebruikt om de IVTT-reactie oplossing voorafgaand aan de injectie in het microfluïdische apparaat af te koelen. Het reagens wordt opgeslagen in een PTFE-slang die over de koude zijde van het Peltier-element is gewikkeld. Een lengte van PEEK tubing wordt gebruikt voor het overbrengen van de gekoelde vloeistof naar het microfluïdische apparaat, met de kleine inwendige diameter (0,005 ") minimaliseren van het reagensvolume niet meer wordt gekoeld. Naast de spiraalvormige PTFE-slang wordt een thermistor geplaatst, waardoor real-time temperatuurbewaking op het oppervlak van het Peltier-element mogelijk is. De spanning op het Peltier wordt zodanig ingesteld dat de oppervlaktetemperatuur van het Peltier tussen 0 °C en 4 °C blijft. Om overtollige warmte geproduceerd door het Peltier-element te verwijderen, wordt de Hot-Face van het Peltier tegen een watergekoeld blok geplaatst, met de toevoeging van een siliconen gratis heatsink-vet, wat zorgt voor een optimale warmteoverdracht tussen de twee gezichten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5. Overzicht van het microfluïdische apparaatontwerp. De microfluidische stromings reactor voor continue IVTT-reacties bestaat uit acht reactor ringen, elk met een volume van 10,7 nl. Negen inlaten zorgen voor de instroom van negen unieke reactie oplossingen in het apparaat. 24 controle kanalen regelen de stroom van vloeistoffen binnen het apparaat. Controle kanalen 9 tot en met 14 vormen een multiplexer. Deze controle kanalen moeten te allen tijde onder druk worden gezet om de vloeistofstroom in het apparaat te remmen. Door de druk van twee controle kanalen tegelijk kan de instroom van één enkel reagens worden toegestaan. Controle kanalen 15, 16 en 17 worden gebruikt om de reagentia op een gecontroleerde manier in het apparaat te pompen. Bedien kanalen 18 tot en met 25 elke regel de inlaat van een van de acht reactoren die in het apparaat worden aangetroffen. Controlekanaal 26 kan het spoel kanaal sluiten, waardoor vloeistof in de reactoren wordt gedwongen. Control Channel 27 helpt bij het homogeen vullen van de reactoren. Controle kanalen 28 en 29 regelen de ring reactor uitgangen en de enige apparaatuitlaat respectievelijk. Tot slot worden de kanalen 1, 2 en 3 gebruikt om de vloeistof binnen de ring reactoren peristaltisch te pompen, wat resulteert in het mengen van de reagentia. Het ontwerp van dit microfluïdische apparaat en de figuur zijn beide aangepast van Neiderholtmeyer et al.²⁹. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 6. Membraan-gebaseerde klep binnen het microfluïdische apparaat. A) stroom kanaal binnen het microfluïdische apparaat. Op de achtergrond zijn twee controle kanalen te zien. Deze kanalen worden niet onder druk gezet en als zodanig zijn de kleppen open (vloeistof kan stromen). B) de twee controle kanalen die de stroomlaag kanalen kruisen, zijn onder druk gezet, het sluiten van de kleppen (d.w.z. de vloeistofstroom wordt belemmerd). Bij het onder druk zetten van de controle kanalen wordt het dunne PDMS-membraan dat de stroom-en regellaagkanalen scheidt naar boven gekeerd (de regellaag ligt onder de stroomlaag) die het stroomlaag kanaal sluit. De afronding van het stroomlaag kanaal is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat het afgebogen membraan het stroom kanaal volledig sluit. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 7. Gebruikersinterface gebruikt om microfluïdische apparaat te bedienen. Gedurende dit onderzoek is een aangepaste bedieningsinterface gebruikt om de stroom van vloeistoffen binnen de microfluïdische apparaten te regelen. De interface stelt gebruikers in staat om elk van de controle kanalen individueel te bedienen (genummerd 1-3 en 9-29), of om ingewikkelde protocollen uit te voeren die resulteren in het spoelen en laden van reagentia, de kalibratie van het microfluïdische apparaat en de uitvoering van Experimenten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 8. Resultaten van een kalibratie-experiment. Tijdens een kalibratie experiment worden de reactoren gevuld met een de (25 μM FITC-dextran) waarna de intensiteit van de fluorescentie wordt geregistreerd. Vervolgens volgt een reeks verdunningen, waarbij een vast aantal instroom-stappen (15) wordt gebruikt om ultrapuur water in de reactoren te injecteren. Na elke verdunning worden de reagentia gemengd en wordt de fluorescentie gemeten. De afname van de intensiteit van de fluorescentie per verdunning onthult het volume van de verplaatste reactor ring voor het ingestelde aantal instroom stappen; een waarde die de vernieuwings ratiowordt genoemd. a) de gemiddelde intensiteit en de standaarddeviatie van alle acht reactoren wordt in rood weergegeven, waarbij de individuele intensiteits sporen in grijs worden weergegeven. B) de gemiddelde vernieuwings ratio en de standaarddeviatie worden voor elke verdunningsstap in het rood weergegeven. De individuele vernieuwings verhoudingen van elke reactor worden grijs weergegeven. Het kan worden gezien dat zeven van de acht reactoren zeer vergelijkbaar gedrag vertonen, maar één reactor vertoont schommelingen in de vernieuwings ratio na de zevende verdunnings cyclus. Dit benadrukt de noodzaak van unieke vernieuwings verhoudingen voor elk van de reactoren, in tegenstelling tot het gebruik van een gemiddelde vernieuwings ratio voor de injectie van reagentia in de reactoren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 9. Resultaten van een IVTT-experiment dat het deGFP-eiwit uitdrukt. Een verlengde IVTT-reactie werd zo geïnitieerd dat 30% van het reactorvolume elke 14,6 minuten wordt verplaatst. De reactie werd gedurende meer dan 16 uur uitgevoerd alvorens te worden beëindigd. Twee reactoren van het microfluïdisch apparaat werden gebruikt als blanco's, waarbij alleen ultrapuur water door de reactoren vloog tijdens het experiment (reactoren 1 en 5). Alle andere reactoren bestonden uit 75% IVTT-reactie oplossing en 25% van beide ultrapuur water (reactoren 2 en 6) of 2,5 nM lineaire DNA-templates die coderen voor de uitdrukking van deGFP (reactoren 3, 4, 7 en 8). In alle vier de reactoren waar DNA werd toegevoegd, is er een duidelijke deGFP-uitdrukking. Drie van de vier reactoren bieden een vergelijkbare intensiteit van de fluorescentie, waarbij één reactor een lager fluorescentie signaal vertoont. Dit kan worden veroorzaakt door een dispariteit in flow, wat resulteert in minder DNA in de reactor, of als gevolg van variaties in de reactor afmetingen. Na 14 uur wordt een plotselinge toename gezien in het signaal van de reactoren die DNA bevatten. Dit wordt veroorzaakt door een luchtbel die de stroomlaag van het microfluïdische apparaat binnenkomt, vermoedelijk afkomstig van een van de instroom-oplossingen. Het overvullen van lucht in het microfluïdische apparaat beperkt de stroom van vloeistoffen door de kanalen aanzienlijk, waarbij geen nieuwe reagentia kunnen worden toegevoegd aan of verwijderd uit de reactoren totdat de lucht is gepasseerd. Na hervatting van de stroming keert het experiment terug naar de vorige intensiteit van de fluorescentie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Aanvullende bestanden. Klik hier om deze bestanden te downloaden. 

Discussion

Er is een PDMS-gebaseerd meerlaagse microfluïdisch apparaat gepresenteerd, en de mogelijkheid om ivtt-reacties gedurende langere tijd te ondersteunen is aangetoond. Hoewel zeer geschikt voor dit specifieke voorbeeld, kan deze technologie denkbaar worden gebruikt voor tal van andere toepassingen. De extra controle over vloeistofstroom-gecombineerd met de mogelijkheid om continu reactie reagentia aan te vullen terwijl (by) producten worden verwijderd-is ideaal voor continue synthese reacties, het onderzoek naar verschillende dynamische gedragingen en de gelijktijdige de geleiding van meerdere variaties van een enkele reactie.

Ondanks het relatief eenvoudige fabricageproces van op PDMS gebaseerde apparaten, vereist het gebruik daarvan een uitgebreide hardware-installatie. Bestaande uit ventiel arrays, drukregelaars, druk pompen, incubators en koelunits, de overgang van fabricage naar gebruik is niet elementair en vereist een aanzienlijke initiële investering. Bovendien vereist de mogelijkheid om consistent te zetten en succesvol experimenten uit te voeren met deze apparaten een aanzienlijke tijdsinvestering; een punt dat dit manuscript beoogt aan te pakken. Echter, eenmaal op zijn plaats, de hele Setup kan worden gewijzigd voor een scala van doeleinden. Bovendien bevat de hardware-setup tal van modulaire elementen, die elk kunnen worden uitgebreid zodat complexere microfluïdische apparaatontwerpen kunnen worden gebruikt. Bovendien maakt het modulaire ontwerp het mogelijk om hardwarecomponenten te vervangen door soortgelijke functionerende alternatieven, zodat gebruikers niet beperkt zijn tot de specifieke instellingen die hier worden beschreven^48,49.

Variabiliteit tussen afzonderlijke apparaten en in de externe omstandigheden (zoals drukschommelingen) kan leiden tot onnauwkeurigheden bij het uitvoeren van experimenten met deze apparaten. Om dit probleem aan te pakken, moet voorafgaand aan elk experiment een kalibratie van het systeem worden uitgevoerd, waarbij voor elk van de reactoren een unieke vernieuwings ratio wordt geboden. Terwijl de kalibratie de variaties van het apparaat-naar-apparaat en experiment-naar-experiment adresseert, is het een tijdrovend proces en niet foutloos. Vloeistoffen met verschillende viscositeiten zullen niet met dezelfde snelheid stromen bij blootstelling aan identieke druk, en als zodanig kan de kalibratie met meerdere reagentia geen identieke vernieuwings verhoudingenopleveren. Dit effect wordt verzwakt door het gebruik van drie controle kanalen om de reagentia peristaltisch te pompen in het microfluïdische apparaat, in tegenstelling tot het reguleren van de stroom door de meegeleverde druk alleen te variëren. Als laatste redmiddel in gevallen waarin de ongelijkheid in viscositeit zeer groot is, kan voor elk afzonderlijk reagens een unieke vernieuwings ratio worden geïmplementeerd door meerdere kalibratie-experimenten uit te voeren.

Het gebruik van een peristaltische pomp om reagentia te injecteren in het microfluïdische apparaat verzwakt de effecten van het gebruik van oplossingen met verschillende viscositeiten, maar creëert ook een secundair probleem. Het gebruik van discrete stappen om vloeistoffen in het microfluïdische apparaat te pompen, betekent dat de resolutie van injecties in één enkele reactor wordt beperkt door het volume dat wordt geïnjecteerd bij het uitvoeren van een enkele pomp cyclus. Binnen ons onderzoek is deze waarde, bepaald tijdens de kalibratie, ongeveer gelijk aan 1%, wat aangeeft dat een enkele pomp cyclus ongeveer 1% van het reactorvolume (ongeveer 0,1 nL) verplaatst. Als zodanig vereist het verplaatsen van 30% van het reactorvolume de uitvoering van 30 pomp cycli, waarbij 23 pomp cycli van de IVTT-reactie oplossing worden toegevoegd en er slechts 7 pomp cycli van DNA of ultrapuur water worden toegevoegd. Hoewel voldoende voor ons onderzoek, kunnen alternatieve experimentele protocollen problemen ondervinden bij het proberen om grotere aantallen unieke reagentia toe te voegen, een lagere vernieuwings fractiete gebruiken of kleinere volumes van één reagens aan een reactor toe te voegen. In dergelijke gevallen kan het ontwerp van het microfluïdische apparaat worden aangepast om reactoren met een groter volume te leveren. Een voorbeeld van dergelijke wordt gerapporteerd in Niederholtmeyer et al.³⁶.

Cruciaal is dat het apparaat dat in dit manuscript wordt geschetst, reacties kan behouden voor langdurige duur, wat resulteert in een steady-state transcriptie en vertaal snelheid. Door het periodiek injecteren van nieuwe reagentia in de reactoren-en het verwijderen van reactie (by) producten-de reacties zijn aanhoudende en complexe dynamische gedragingen kunnen worden bewaakt. Op deze manier is er een platform gecreëerd dat-tot op zekere hoogte-de cellulaire omgeving nabootst. Bovendien maakt dit platform het mogelijk om de systeemdynamiek te verkennen, door de periode tussen injecties en de specifieke samenstelling van de injecties aan te passen. Als gevolg hiervan zijn deze meerlaagse microfluïdische apparaten een krachtig hulpmiddel voor de karakterisering en optimalisering van nieuwe synthetische netwerken die complex dynamisch gedrag vertonen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Acetone	VWR	20063.365
AZ 40 XT	Merck KGaA (Darmstadt, Germany)	-	Positive Photoresist
AZ 726 MIF Developer	Merck KGaA (Darmstadt, Germany)	-	Developer Positive Photoresist
Isopropanol	Merck KGaA (Darmstadt, Germany)	109634
Microscope slides	VWR	ECN 631-1550
mr Dev 600	Microresist Technology GmbH (Berlin, Germany)	-	Developer Negative Photoresist
Silicon Free Heat Sink Grease	Circuit Works	CW7270	Thermal Compound
Silicon wafers	Silicon Materials	-	<1-0-0> orientation, 100 mm diameter, 525 µm thickness
SU-8 3050	Microchem Corp. (Newton, MA)	-	Negative Photoresist
Sylgard 184 Elastomer Kit (PDMS)	The Dow Chemical Company	01317318
trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane	Sigma-Aldrich	448931-10G
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
4 channel digital input/output module	WAGO Kontakttechnik GmbH	750-504	8x
Camera lens	The Imaging Source	-
Compression fitting	Koolance, Inc.	FIT-V06X10	Fitting for tubing with 6mm ID and 10mm OD. 4x
Controller end module	WAGO Kontakttechnik GmbH	750-600
Device connecting tubing	Saint-Gobain Performance Plastics	AAD04103	0.02" ID, 0.06" OD, Tygon Tubing (ND-100-80)
Device connector pins	Unimed SA (Lausanne, Switserland)	200.010-A	AISI 304 tubing, 0.35mm ID, 0.65mm OD, 8mm L
Ethernet Controller	WAGO Kontakttechnik GmbH	750-881
Female bus connector	Encitech	DTCK15-DBS-K	15 pole female bus connector
Fluid reservoirs	Fluigent	Fluiwell-4C
Fluigent pressure system	Fluigent	MFCS-EZ	0 - 345 mbar
Hg short arc lamp	Advanced Radiation Corporation	-	350W
Hot plate	Torrey Pines Scientific	HP61
Inverted microscope	Nikon Instruments	Eclipse Ti-E
LabVIEW Software	de Greef Lab, Eindhoven University of Technology	https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software
Liquid coolant	Koolance, Inc.	LIQ-705CL-B
Luer stubs	Instech Laboratories, Inc.	LS23
Male Luer to barb connectors	Cole Parmer	45505-32	3/32" ID
Matlab Software	de Greef Lab, Eindhoven University of Technology	https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software
Microcamera	The Imaging Source	DMK 42AUC03
Microscope camera	Hamamatsu Photonics	OrcaFlash4.0 V2 (C11440-22CU)
Orbital shaker	Cole Parmer	EW-513000-05
Oven	Thermo Scientific	Heraeus T6P 50045757
Oxygen plasma asher	Quorum Technologies	K1050X
PDMS puncher	SYNEO	Accu-Pucnh MP10
PEEK tubing	Trajan	1301005001-5F	0.005" ID, 1/32" OD, Red
Peltier element	European Thermodynamics	APH-127-10-25-S
Peltier temperature controller	Warner Instruments	CL-100
Photomask	CAD/Art Services, Inc.	-
Photomask Design	Maerkl Lab, EPFL	https://zenodo.org/record/886937#.XBzpA8-2nOQ
Pneumatic valve array	FESTO	-	1x 22 valve array and 1x 8 valve array, Normally closed valves.
Power adapter	Koolance, Inc.	ADT-EX004S	110/220V AC Power Adapter
PTFE tubing	Cole Parmer	06417-21	#24 AWG Thin Wall PTFE
Punching pin	SYNEO	CR0320245N21R4	OD: 0.032" (0.8128 mm), ID: 0.024" (0.6090 mm)
PVC Tubing	Koolance, Inc.	HOS-06CL	6 mm ID, 10 mm OD
Single edge blades	GEM Scientific	-
Soft tubing	Fluigent	-	Supplied with fluid reservoirs. (1 mm ID, 3mm OD)
Spin coater	Laurell Technologies Corporation	WS-650MZ-23NPPB
Stereo microscope	Olympus Corporation	SZ61
Thermistor cable	Warner Instruments	TA-29	Cable with bead thermistor
UV exposure system	ABM, USA	-	Near UV Exposure System, 350W
Vacuum pump	Vacuumbrand GmbH	MD1C
Water cooled cold plate block	Koolance, Inc.	PLT-UN40F
Water cooler	Koolance, Inc.	EX2-755
Weighing scales	Sartorius	M-prove