Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Fysiologisch patiënt afgeleide 3D-Spheroids voor anti-neoplastische geneesmiddelen screening om kanker stamcellen te targeten

8.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59696

⸱

5 juli 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, 2Department of Materials Science and Engineering, University of Michigan, 3Rogel Cancer Center, School of Medicine, University of Michigan, 4Macromolecular Science and Engineering, University of Michigan

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft het genereren van door patiënten afgeleide spheroïden en downstreamanalyses, waaronder de kwantificering van proliferatie, cytotoxiciteits testen, Flowcytometrie, immunofluorescentie kleuring en confocale beeldvorming, om de geneesmiddelen te beoordelen potentiële kandidaten als anti-neoplastische Therapeutics. Dit protocol ondersteunt precisie geneeskunde met identificatie van specifieke geneesmiddelen voor elke patiënt en stadium van de ziekte.

Samenvatting

In dit protocol schetsen we de procedure voor het genereren van tumor sferoïden binnen 384-goed hangende druppeltjes om een high-throughput screening van anti-kankertherapieën mogelijk te maken in een fysiologisch representatieve micro-omgeving. We schetsen de vorming van patiënten afgeleide Kanker stamcel sferoïden, evenals, de manipulatie van deze sferoïden voor grondige analyse na medicamenteuze behandeling. Concreet beschrijven we de verzameling van spheroid-morfologie, proliferatie, levensvatbaarheid, geneesmiddeltoxiciteit, celfenotype en lokalisatiegegevens van cellen. Dit protocol richt zich sterk op analysetechnieken die eenvoudig worden geïmplementeerd met het 384-well Hanging drop-platform, waardoor het ideaal is voor een hoge doorvoer van drugs screening. Terwijl we benadrukken het belang van dit model in ovariële kanker studies en kanker stamcelonderzoek, de 384-well platform is vatbaar voor onderzoek van andere soorten kanker en ziekte modellen, uitbreiding van het nut van het platform om vele gebieden. Door de snelheid van gepersonaliseerde geneesmiddelen screening en de kwaliteit van screening resultaten te verbeteren door eenvoudig te implementeren fysiologisch representatieve 3D-culturen, wordt dit platform voorspeld om te helpen bij de ontwikkeling van nieuwe therapieën en patiëntspecifieke behandelstrategieën en hebben zo een brede klinische impact.

Inleiding

Wereldwijde kankergerelateerde sterfte bereikte een tol van 9.800.000 sterfgevallen in 20181, met de nadruk op de noodzaak voor de ontwikkeling van verbeterde Therapeutics. Helaas, de kosten van het ontwikkelen van kanker drugs neemt toe, met de ontwikkeling van een enkele drug kost ongeveer 650.000.000 USD2 wijst op de noodzaak van verbeterde strategieën voor de ontwikkeling van nieuwe anti-kanker drugs. Kanker stamcellen (CSCs), die worden gekenmerkt door verhoogde chemoresistance3, de capaciteit om zichzelf te verlengen, en het vermogen om nieuwe tumoren zaad4 worden verondersteld te zijn verantwoordelijk voor tumor recidief4, metastase5, en chemoresistance4,6, die allemaal bijdragen aan de kwaadaardige capaciteit van de tumor en dus de hoge dood tol. Bij eierstokkanker worden deze cellen verrijkt in de maligne ascites vloeistof in de peritoneale Holte, een aandoening die gepaard gaat met slechte klinische uitkomsten1. Als gevolg van de kwaadaardige capaciteiten van CSCs, is er een duw geweest om nieuwe CSC-targeting te ontwikkelen die in combinatie met traditionele chemotherapieën wordt gebruikt. Er zijn verschillende uitdagingen die gepaard gaan met de ontwikkeling van CSC-targeting op drugs, waaronder: 1) moeilijkheden bij het uitbreiden en onderhouden van CSCs in vitro; 2) schaarste van de patiënt monsters; 3) fysiologische relevantie van het cultuurplatform; en 4) heterogeniteit in geneesmiddel gevoeligheid tussen patiënten. Dit protocol schetst de implementatie van een 3D-cultuurplatform met hoge doorvoer dat elk van deze uitdagingen kan overwinnen. Met name dit systeem zorgt voor een snelle geneesmiddelen screening met behulp van kleine aantallen patiënt-afgeleide ovariële CSCs, en is zeer vatbaar voor downstream analysetechnieken. Hoewel ideaal voor het bestuderen van ovariële kanker en CSCs, is ons platform ook waardevol bij het bestuderen van andere kankers en gedifferentieerde celtypen in complexe 3D-omgevingen.

Complexe 3-dimensionale (3D) modellen zijn essentieel in het bestuderen van de tumor micro Environment (TME), dat is een 3D-niche opgebouwd uit kankercellen, niet-kanker ondersteunende cellen, en extracellulaire matrix (ECM) eiwitten4. Deze 3D-omgeving resulteert in unieke celmorfologie, celceldeling en celmatrix interacties, celdifferentiatie, Celmigratie, celdichtheid en diffusie gradiënten in vergelijking met traditionele 2D-celkweek in vitro4. Al deze factoren culmineren in differentiële drug Response binnen 3D-culturen, exposeren verhoogde drug resistentie en fysiologische relevantie7,8. Vanwege de rol van de 3D-TME in CSC-differentiatie en chemoresistance, is het essentieel om te schermen voor CSC-targeting op drugs in fysiologische micro-omgevingen. Verbetering van de fysiologische relevantie van CSC drug screening platforms heeft het potentieel om patiënt specifieke drug screening te verbeteren, ontwikkeling van geneesmiddelen, formulering van behandelingsstrategieën, en uiteindelijk klinische uitkomsten. Het is net zo belangrijk dat het platform dat wordt gebruikt voor het screenen van geneesmiddelen een hoge doorvoer is en compatibel is met downstream-analysemethoden om kosten, tijd en klinische Vertaal tijd van veelbelovende medicijnen te minimaliseren9.

Op dit moment, het complex TME is het best onderhouden voor drug screening toepassingen door middel van in vivo modellen zoals Murine syngenic tumor modellen, cellijn-afgeleide xenografts, en patiënt-afgeleide xenotransplantaatmodellen is (PDX) modellen12, als ze bieden fysiologisch Voorwaarden. Echter, de lage doorvoer aard van deze modellen, evenals de kosten, tijd en technische vaardigheden sets die ze nodig hebben beperkt hun nut in snelle, hoge doorvoer drug screening toepassingen13. Als alternatieven voor deze in vivo modellen, veel in vitro 3D-modellen met behulp van hydrogels8, cultuur binnen microfluïdische apparaten of ' Organ-on-a-chip ' apparaten10,14, en niet-aanhandige culturen3,8 zijn ook ontwikkeld, vanwege hun lage barrière voor toegang in termen van kosten, tijd en vereiste vaardigheden.

Hydrogel cultuur platforms zijn voordelig in de fijne controle die wordt geboden over de matrix samenstelling, mechanische eigenschappen en matrixstructuur15; echter, ze kunnen remmen hoge dichtheid celcultuur14. Bovendien kan het oogsten van cellen uit hydrogels de downstreamanalyse compliceren, als gevolg van mogelijk schadelijke effecten van oogstmethoden15. Microfluïdische apparaten, aan de andere kant, zijn Microscale apparaten die het mogelijk maken voor output detectie binnen hetzelfde apparaat en voor celkweek op fysiologisch relevante weegschalen met minimale consumptie van reagentia, verminderde reactietijd, geminimaliseerd afval, en Rapid Diffusion14. Deze kenmerken maken ze veelbelovende platforms voor het onderzoeken van drug toxiciteit, werkzaamheid, en farmacokinetiek. Echter, de uitdagingen van efficiënte, kwantificeerbare, reproduceerbare en gebruiksvriendelijke 3D-celcultuur, evenals, omvangrijke en dure pompsystemen hebben beperkt microfluïdische toepassingen in high-throughput Research10. Efficiënte detectie opstellingen en mogelijk moeilijke implementatie op verschillende terreinen hebben ook de wijdverbreide acceptatie van microfluïdische systemen10belemmerd.

In tegenstelling tot het ontstaan van sferoïden in niet-aanhangende omstandigheden in roterende mixers (nutators), Ultra-Low-bevestigings platen en hangende druppels worden geen door de gebruiker gedefinieerde matrix componenten opgenomen. Deze methodologieën zijn vooral relevant voor het bestuderen van ovariële kanker, aangezien de niet-aanhandende omstandigheden representatief zijn voor de omstandigheden waarin sferoïden binnen de peritoneale holte5groeien. Binnen deze niet-aanhangende kweekmethoden is aangetoond dat nutator en hangende valsspheroids een hogere verdichting, herinrichting en chemoresistance vertonen in vergelijking met sferoïden die in uiterst lage bevestigings platen worden gegenereerd, wat suggereert dat er meer fysiologische relevantie16,17,18,19. Door de toegenomen capaciteit voor screening met hoge doorvoer van kleinere goed groottes en minimale vereiste celaantallen is spheroid-generatie in hangende drop platen een ideaal platform voor geneesmiddelen screening. Hier presenteren we een instelbaar 3D-fysiologisch platform in 384-goed hangende druppel platen, die gemakkelijk te implementeren en zeer vatbaar zijn voor downstream-analyse, waardoor het ideaal is voor een hoge doorvoer van drug screening van eierstokkanker en ovariële CSCs.

Ons 3D-fysiologisch platform biedt alle voordelen van 3D-cultuur, waaronder fysiologische celcelcontacten, diffusie gradiënten, celdichtheden en natuurlijk geproduceerde ECM-eiwitten, die kunnen bijdragen aan realistische geneesmiddel responsen16, 17,18,19. Bovendien kunnen we, door deze sferoïden te genereren met door de patiënt afgeleide CSCS, patiënt specifieke reacties op drugs1 vaststellen met veel technische replicaten tegelijkertijd, om heterogeniteit te overwinnen die kan worden gevonden binnen de tumor van de patiënt voorbeelden20. Bovendien is aangetoond dat 3D-cultuur het onderhoud van de CSC-populaties3,16 verbetert en dus representatief is voor de verrijkte CSC-populaties in de ascites7. Dit gecombineerd met eenvoudige downstream analyse, met inbegrip van flow cytometrie analyse van de levensvatbaarheid en CSC-verhoudingen zorgt voor een optimale evaluatie van CSC targeting drug werkzaamheid. Ten slotte is dit fysiologisch platform compatibel met Imaging op meerdere tijdstippen tijdens het experiment, evaluatie van celdood en proliferatie, celorganisatie en morfologie met immunohistochemie, oplosbare signalering met ELISA op geconditioneerde medium, celfenotypes met Flowcytometrie en genexpressie na PCR.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle patiënt monsters worden verzameld onder een goedgekeurd IRB-Protocol van instan-patienten, waarvan de monsters zijn geïdentificeerd na tumor deballast stoffen en ascites-verzameling.

1. generatie van Spheroids uit kleine Celaantallen in 384-goed hangende drop platen

  1. Plaats de hangende druppel plaat in een sonicator gevuld met steriel gedeïoniseerd (di) water en sonificeren gedurende 20 min.
  2. Met een handschoenen, verwijder de plaat van de sonicator en was het met stromend DI-water.
  3. Laat de plaat zitten in een bad van 0,1% Pluronic acid voor 24 h om te voorkomen dat eiwit adsorptie en spheroid hechting aan de putjes.
  4. Verwijder platen met een handschoenen en spoel beide zijden van de plaat grondig af met stromend DI-water.
  5. Tik of schud krachtig de plaat in een bioveiligheidskast om water uit de putten te verwijderen in een steriele omgeving.
  6. Plaats de plaat 30 – 60 min aan beide zijden onder UV-licht om de platen te steriliseren en verontreiniging te minimaliseren.
    Opmerking: De plaat kan ook worden blootgesteld aan ethyleenoxide-gas in een kamer voor sterilisatie.
  7. Vul elke put van een 6-put plaat met 4 – 5 mL steriel geautoclaveerd DI water en sandwich de hangende druppel plaat tussen het deksel en de onderkant van de 6-well plaat. Voeg 800 – 1000 μL steriel DI water rond de rand van de hangende druppel plaat toe om een vochtige, stabiele en steriele omgeving te bieden om het volume dat verloren gaat aan de verdamping te minimaliseren (Figuur 1 a-C).
  8. Voor 2D-gekweekte cellen, aspiraat medium bedekt cellen in hun log fase van groei en wassen met 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) om sporen van foetaal runderserum (FBS) in het groeimedium te verwijderen, omdat het de werking van trypsine belemmert.
  9. Zuig de PBS op en voeg 1,5-2 mL 0,25% trypsine-EDTA toe aan de weefselkweek schotel van 100 mm. Incuberen cellen gedurende 5 min in een incubator ingesteld op 37 °C.
    Opmerking: Cellen kunnen met verschillende snelheden losraken, zodat de platen op een tafel lichtmicroscoop moeten worden gecontroleerd om celloslating na 5 min te waarborgen. pas het Detacherings protocol aan volgens de instructies van de leverancier wanneer u een cellijn gebruikt.
  10. Voeg 6 – 8 mL cellulair medium met FBS of een serum toe aan het gerecht om de trypsine te neutraliseren, verzamel cellen met een serologische Pipet van 10 mL en stort ze in een conische buis van 15 mL.
  11. Tel cellen door 10 μL van de celsuspensie aan elke kant van een hemocytometer te laden en het bijbehorende tellings protocol te volgen.
  12. Voor patiënten afgeleide cellen die zijn verzameld uit primaire of gemetastaseerde vaste tumoren, of die niet zijn 2D gecultiveerde, bereiden enkele celsuspensies in serumvrij medium (SFM) beschreven eerder3.
  13. Proces tumorweefsels zoals eerder beschreven en opslaan van één cel suspensies voor later gebruik in geschikte Vries middel medium21,22.
    1. Voor solide tumorweefsel, gehakt mechanisch met een scheermesje en filter resulterende oplossing door middel van een 40 μm filter voor het isoleren van de gewenste cellen uit een dichtheidsgradiënt21,22.
    2. Voor ascites monsters, concentraat cellen door centrifugeren, lyse rode bloedcellen in ammonium-chloride-kalium (ACK) buffer, wassen in 1x PBS, en dan passeren een 40 μm filter en een 28 G naald 4 maal22.
  14. Voor isolatie van ovariële CSCS, Sorteer cellen met Flow flowcytometrieonderzoeken zoals hieronder in detail beschreven.
  15. Vers geïsoleerde enkelvoudige cellen zijn bevroren voor opslag en ontdooid wanneer dat nodig is voor experimenten.
  16. Om de celsuspensie voor het beplating voor te bereiden, berekent u het gewenste volume van de celoplossing die nodig is voor het beplating: 20 μL per druppel X totaal aantal druppels = totaal oplossings volume nodig.
  17. Verdun de celconcentratie tot de gewenste celconcentratie per 20 μL (d.w.z. 100 cellen in een druppel van 20 μL).
  18. Meng de celsuspensie zachtjes met behulp van een pipet vóór het beplating om homogene verdeling van cellen te garanderen en de uniformiteit tussen druppels te verbeteren.
    Opmerking: Overmenging van de celsuspensie kan leiden tot celdood en vuil in de hangende valsspheroïden.
  19. Plaats de pipetpunt in de put onder een hoek van ongeveer 45 ° en Pipetteer 20 μL van de celoplossing in elke hangende druppel goed.
    Opmerking: Plating patronen kunnen worden aangepast afhankelijk van het aantal benodigde sferoïden. Beplating sspheroids in elke andere put is veiliger wanneer grote hoeveelheden sferoïden niet nodig zijn in een experiment, omdat het onbedoeld samenvoegen van de druppels voorkomt (Figuur 1D, E). Als grote hoeveelheden spheroïden nodig zijn voor een experiment, plaat elke putje een rij grens putten aan alle zijden (Figuur 1f).
  20. Plaats de deksel van de 6-well plaat terug bovenop de hangende druppel plaat en gebruik een rekbare thermoplastische strip die ongevoelig is voor vochtverlies, om de randen te dichten en extra verdamping van druppels te voorkomen. Incuberen in een standaard CO2 bevoficeerde incubator (5% Co2, 37 °c).
  21. Toevoer hangende druppels eens in de 2 – 3 dagen om het celkweekmedium aan te vullen voor noodzakelijke voedingsstoffen door 2 – 3 μL toe te voegen aan elke spheroid die goed bevat.
    Opmerking: Na beeldvorming wordt altijd geadviseerd om de hangende druppels te voeden, omdat de lucht blootstelling tijdens beeldvorming tot verdamping leidt.

2. het toevoegen van celkweek medium aan hangende drop Spheroid platen

  1. Verwijder de thermoplastische strook en het deksel in een bioveiligheidskast en voeg 2 – 3 μL van het geschikte kweekmedium toe aan elke put met een hangende druppel.
    Opmerking: Het toegevoegde volume is afhankelijk van de druppelgrootte en de hoeveelheid tijd tussen de voedingen.
  2. Bedek de plaat na het voeden met de bovenste deksel en breng verse thermoplastische strook aan op de buitenranden voordat u de plaat weer in de incubator plaatst.

3. fase contrast beeldvorming van Spheroid-morfologie

  1. Verwijder de thermoplastische strook van rond de randen van de plaat in een bioveiligheidskast.
  2. Verwijder voorzichtig de 384-goed hangende druppel sferoïden plaat van de bioveiligheid Cabinet met het deksel nog op zijn plaats en plaats het in de Microscoop lade bij een epifluorescerende Microscoop.
  3. Gebruik de optie Live imaging in de imaging-software op 4x, 10x of 20x om de hangende valsspheroids te observeren en gewenste beelden te maken.
  4. Na het opslaan van de beelden, neem de plaat terug naar de bioveiligheid Cabinet en voer cellen zoals hierboven beschreven.
  5. Reseal plaat met een frisse thermoplastische strook en plaats de verzegelde plaat terug in de incubator.

4. kwantificering van proliferatie en levensvatbaarheid binnen Spheroids

  1. Plaat spheroïden in een voldoende aantal putjes om > 10 technische replicaten te verkrijgen voor elk tijdstip (d.w.z. dag 1 en dag 7) dat moet worden onderzocht.
    Opmerking: Putten die worden gebruikt voor deze test worden over het algemeen niet opnieuw gebruikt als gevolg van potentiële verontreinigingen uit de resazurin kleurstof.
  2. Voeg 2 μL gefilterde resazuringebaseerde oplossing toe aan de putten die zijn aangewezen voor proliferatie analyse alsof deze putten worden vervoedering en inbroed voor een vooraf bepaalde incubatieperiode.
    Opmerking: Deze incubatietijd kan variëren afhankelijk van het celtype en het aantal cellen in de spheroid. Het wordt geadviseerd om de vereiste incubatietijd te bepalen die nodig is voorafgaand aan het begin van de proliferatie experimenten door metingen te beginnen na 1 uur incubatie en vervolgens elke 30 minuten opnieuw te meten tot het signaal uitlezingen in de controle putten plateau. Testwaarden kunnen zo vaak als gewenst worden ingenomen. Incubatie is meestal 4 h voor sferoïden gestart met 100 kankercellen.
  3. Schakel eerst de microplaat Reader in, gevolgd door de bijbehorende Plate Reader-software ten minste 15 minuten vóór de eerste lezing, zodat de machine de inwendige temperatuur op 22 °c kan opwarmen en de temperatuur van de metingen kunnen beïnvloeden.
  4. Open een 384-well plate protocol set met 530/25 nm excitatie en 590/35 nm emissie golflengten met optica ingesteld op bodem, Gain ingesteld op 35, leessnelheid ingesteld op normaal, en lees type ingesteld op fluorescentie .
  5. Na de incubatieperiode, open de hangende druppel sandwich in een bioveiligheid Cabinet en breng de 384-put plaat met de deksel nog op zijn plaats aan de plaat lezer.
  6. Plaats de 384-put plaat met het deksel nog op zijn plaats in de plaat lezer lade, die zal worden verlengd zodra de machine wordt opgewarmd en klik op OK om de plaat te lezen.
  7. Breng de goed plaat terug naar de 6-well base en plaats deze in de incubator. Als alle tijdpunten voor de dag zijn gelezen, moet u de plaat opnieuw verzegelen voordat u deze terugplaatst in de incubator.
  8. Sla het experiment op in het pop-upvenster en klik vervolgens op Ja wanneer u wordt gevraagd of u Power exports voorplaat 1 wilt uitvoeren om gegevens van de Plate Reader-software in een spreadsheet voor de organisatie uit te voeren.
  9. Gemiddelde fluorescentie waarden voor elke aandoening en normaliseren door het gemiddelde van de controle voorwaarde te melden fold verandering in de proliferatie in verschillende experimentele omstandigheden.
  10. Bij het vergelijken van dag 1 tot dag 7, normaliseren door te delen door dag 1 gemiddelde fluorescentie te verkrijgen fold verandering in de proliferatie na verloop van tijd.
  11. Bereken foutbalken met behulp van een standaardfout van het gemiddelde en bepaal de statistische significantie tussen experimentele groepen met een geschikte statistische test, zoals de tweezijdige T-toets van de student.

5. evaluatie van Geneesmiddeltoxiciteit in spheroïden

  1. Drug Administration
    1. Lever op elk moment na de vorming van spheroid het geneesmiddel dat verdund is tot de gewenste concentratie, zodanig dat een dosis van 2 μL 10x de gewenste uiteindelijke geneesmiddelconcentratie bevat.
      Opmerking: Hierbij wordt uitgegaan van een verdamping van 2 μL van de druppel, zodat het eindvolume na medicamenteuze behandeling 20 μL is. Bijvoorbeeld, een dosis van 50 μM cisplatine zal een bereide oplossing van 500 μM hebben. Als druppels meer dan 20 μL bevatten, moet de concentratie van het geneesmiddel en/of het toegevoegde volume dienovereenkomstig worden aangepast.
    2. Behandel controlemonsters met 2 μL celkweekmedium.
      Opmerking: Cisplatine wordt oplosbaar in water. Daarom zijn de controles 2 μL celkweekmedium; echter, als het medicijn voertuig een ander oplosmiddel is (bijv. DMSO), dan moeten de besturingselementen celkweekmedium zijn met een gelijke concentratie van DMSO zoals gebruikt in de medicamenteuze behandeling.
    3. Blijven controleren van de drug behandeld en de controle-sferoïden gedurende de incubatieperiode van de drug met fase microscopie een visuele record van het effect van drug toxiciteit, alsmede met resazurin kleurstof zoals hierboven beschreven om te controleren cellulaire levensvatbaarheid.
      Opmerking: Typisch, de drugs worden toegevoegd na 5 – 7 dagen in de hangende druppels en toxiciteit gemeten na 48 –-72 HS maar dit kan worden gevarieerd afhankelijk van het experiment. Geneesmiddelen kunnen worden toegevoegd zodra stabiele sferoïden zijn gevormd, meestal tussen 1 – 4 dagen.
  2. Kwantificering van geneesmiddeltoxiciteit door celtelling
    1. Verzamel op het eindpunt van de medicamenteuze behandeling 10 sferioïden van controle-en met geneesmiddelen behandelde putten met behulp van een 1.000 μL pipet en stort elke set sferoïden in zijn eigen micro centrifugebuis.
    2. Breek de sferoïden in afzonderlijke cellen door herhaalde pipetteren.
      Opmerking: Om potentiële celbeschadiging te verminderen als gevolg van herhaald pipetteren, kan enzymatische spijsvertering met een enzym zoals trypsine worden uitgevoerd om het genereren van enkelvoudige celoplossingen te faciliteren voorafgaand aan pipetteren23. Minimalisering van celdood als gevolg van pipetteren is afhankelijk van het celtype en moet dienovereenkomstig worden geoptimaliseerd. Als u bezorgd bent over de dood als gevolg van uitsplitsing, raadpleeg dan de analyse met resazurin Dye en de cytotoxiciteits test voor alternatieve methoden waarvoor geen spheroid-aggregatie nodig is.
    3. Centrifugeer de buisjes gedurende 5 minuten bij 400 x g om cellen op de bodem van micro centrifugebuizen te verzamelen en het supernatant te aspireren.
    4. Voeg 20 μL verse media of 1x PBS toe aan elke buis en meng goed.
    5. Voeg Trypaan blauw toe met een verhouding van 2 μL Trypaan blauwe vlek tot 20 μL celsuspensie.
    6. Plaats 10 μL cellen en Trypan blauwe suspensie in elke kamer van de hemocytometer en Tel cellen onder een lichte Microscoop, met blauw gekleurd cellen die dode cellen en ongekleurde cellen vertegenwoordigen die levende cellen representeren.
      1. De Live cel% = (aantal levende cellen ÷ totaal aantal cellen) x 100.

6. spheroid-karakterisering met histologische technieken

Opmerking: Er zijn twee mal opties 3D gedrukt in een biocompatibel polymeer te repliceren spheroid array mallen gemaakt door Ivanov et al.24: 1) 20 put schimmel die kan houden 28 μl per put en 2) 63 goed schimmel die 9 μL per put kan houden (figuur 2D).

  1. Steriliseren histologie schimmel en de grens door ze af te vegen met 70% ethanol en bevestig de rand stevig rond de mal en leg de mal rechtop. Beide mallen passen ongeveer 3 mL vloeistof (3,203 mL voor de 20 spheroid-array en 3,196 mL voor de 63 spheroid-array).
  2. Verlaag de spheroid-array met 10.000 cSt si-olie met behulp van een puntig wattenstaafje om het verwijderen van de preparaat-gel-gegoten in de daaropvolgende stappen te vergemakkelijken.
  3. Opwarmen preparaat gel tot vloeibaar gemaakt via magnetron voor 10 – 20 s met de dop losgemaakt.
  4. Voeg tussen 2,6 en 2,8 mL gesmolten verwerkinggel in de mal tot ongeveer het niveau met de bovenkant van de rand.
  5. In een paar minuten, eenmaal gestomgd, verwijder de verwerking gel gegoten door het scheiden van de rand van de mal en vervolgens inverteren van de array schimmel.
  6. Plaats een pincet tussen de mal en de rand om ze zorgvuldig te scheiden en gebruik vervolgens een celscraper om de cast uit de mal te laten verdwijnen als deze niet meteen loskomt.
  7. Oogst de sferoïden van de hangende druppel plaat door de inhoud van een enkele put op een 100 of 150 mm Cell petrischaaltje met een pipet van 1.000 μL te pipetteren en de spheroid visueel te isoleren.
  8. Pipet 5 μL van de put-inhoud inclusief de geïdentificeerde spheroid in een van de matrix putten, totdat de array is gevuld.
  9. Wacht 3 min om ervoor te zorgen dat sferoïden zich op de bodem van de array bevinden voordat het zachtjes pipetteren van gesmolten verwerkingsgel in elk van de putjes voorzichtig is om de sferoïden niet te storen.
  10. Voeg extra processing gel toe om de bovenkant van de array op peil te brengen en eenmaal gekoeld, plaats de gestalde spheroid-array in een gelabelde cassette voor verwerking.
  11. Submerge gelabelde cassette in 4% formaline 's nachts om de sferoïden bij 4 °c op te lossen en vervolgens in 70% ethanol bij 4 °c op te slaan totdat het klaar is voor verwerking.
  12. Proces met standaard 1 h paraffine programma en sluit vervolgens de spheroid-arrays zo in dat de verwerkte arrays rechtop staan met de bodem van de putjes die het dichtst bij het blok gezicht liggen.
  13. Zorg ervoor dat de arrays zijn ingebed zo plat mogelijk, met het onderste gezicht flush met de onderkant van het blok en plaats blokken op ijs.
  14. Laad het blok op de microtoom en stel het blok zo in dat het blad parallel is met het geladen blok vlak.
  15. Gesneden array (samplediepte = 15 μm) tot de onderkant van de array putten zijn bereikt, zodat de ronde putten zichtbaar zijn op gesneden samples.
  16. Schakel over naar een 5 μm samplediepte en blijf linten snijden en verzamelen. Controleer onder de Microscoop elke paar sneetjes om te bepalen of de spheroid-diepte is bereikt. Zodra sferoïden zijn bereikt, verzamelt u elke volgende dia totdat de sferoïden niet meer zichtbaar zijn.
  17. Beits elke dia met standaard H & E-protocol.

7. levende dode Cytotoxiciteits test

  1. Voeg aan elke hangende druppel de levende celkleur stof, calcein-AM toe aan de uiteindelijke concentratie van 2 μM, en de dode celkleur stof, ethidiumbromide homodimer-1 tot de uiteindelijke concentratie van 4 μM, in gedachten houden dat het druppel volume 20 μL is.
    Opmerking: Probeer volumes tot een minimum te beperken en voeg meestal 2 μL van de kleurstoffen samen.
  2. Plaats de platen terug in een incubator die ingeklemd is in een 6-put-plaat met een deksel en incueren de sferoïden voor 45 min bij 37 °c.
    Opmerking: Afhankelijk van de grootte van spheroids varieert deze incubatietijd aanzienlijk. Bijvoorbeeld, sferoïden onder 400 μm vereisen doorgaans slechts 30 – 45 minuten incubatietijd, terwijl grotere sferoïden dichter bij 800 μm tot 90 min incubatietijd nodig hebben. Incubatie tijden moeten worden geoptimaliseerd voor het experiment van een individu.
  3. Voor latere beeldvorming, oogst sferoïden met een 1.000 μL pipet in een bioveiligheidskast en stort elke spheroid op voorgereinigde glazen Microscoop glaasjes.
  4. Beeld sferoïden door het glas, op een omgekeerde confocale Microscoop.
    Opmerking: Afhankelijk van de nabijheid van de confocale Microscoop tot het lab waarin sferoïden worden geoogst, kunnen de sferoïden ofwel worden afgebeeld in de oorspronkelijke druppel medium geplaatst op de glijbaan of omhuld in 2% agarose als er meer stabiliteit nodig is voor spheroid-transport.
  5. Gebruik de multidimensionale acquisitie modus in de Microscoop software, zoek de spheroid met behulp van dic-verlichting bij 10x vergroting en scan vervolgens het z-vlak om de hoogten te identificeren die de spheroid omvat.
  6. Klik op z-serie en stel de boven-en ondergrens van de z-scan iets hoger dan de bovenkant van de spheroid en iets lager dan de onderkant van de spheroid.
  7. Prikkel de spheroïden met 488 nm voor calcein-AM (levende cellen; groen) en 561 nm voor ethidiumbromide homodimer-1 (dode cellen; rood) met de door de software aanbevolen stapgrootte, maximale Gain en minimale belichting voor elke kleur.
  8. Klik op verwerven om een samengestelde z-stack-afbeelding van levende en dode cellen binnen de spheroid te verkrijgen.
  9. Kwantificeer Live/Dead-verhoudingen met behulp van beeldverwerkingssoftware om een percentage van de pixel intensiteit te kwantificeren van het kanaal dat overeenkomt met levende cellen versus het percentage van de pixel intensiteit van het kanaal dat overeenkomt met dode cellen uit de samengestelde z-projectie beelden.
    Opmerking: Als gevolg van de beperkingen in het kwantificeren van een 3D-structuur met een 2D-projectie, een alternatieve methode om levend versus dode fluorescentie te kwantiseren, binnen de hangende druppel platen is het gebruik van een plaat lezer volgens het protocol dat is meegeleverd met de calcein-AM en ethidiumbromide homodimer-1 Kit.

8. immunofluorescentie

  1. Verwarm een laag smeltend 2% agarose-oplossing, dus de oplossing is visceus en net boven het smeltpunt en de plaats op een Microscoop glijbaan om een zacht bed van agarose te creëren
  2. Oogst sferoïden door de daling van 20 μL PBS door de druppel op het zachte bed van 2% agarose.
    Opmerking: Dit moet snel gebeuren zodat agarose niet stollen voordat sferoïden zijn ingebed.
  3. Zodra de agarose afkoelt en gels met de geoogste spheroid binnen (minder dan 5 min), voeg dan 4% neutrale gebufferde formaline toe om de spheroids te fixeren. Voeg afwisselend ijskoude methanol toe en fixeer de agarose-ingesloten sferioïden bij-20 °C gedurende 30 minuten.
  4. Was 3x voor 5 min elk met 1x PBS en gooi de PBS na elke wasbeurt af.
  5. Blok voor 1 uur bij RT met 10% serum (d.w.z. paarden serum) en 0,15% zeepoplossing (Triton X-100) in 1x PBS.
  6. Was 3x voor 5 min elk met 1x PBS en gooi de PBS na elke wasbeurt af.
  7. Beits-spheroïden met gewenst fluorescerende antilichaam bij aanbevolen of vooraf bepaalde antilichaam verdunning (d.w.z. fluorescerend gelabeld phalloidine bij een 1:100-verdunning), die gedurende ten minste 90 min bij kamertemperatuur wordt ingebroed, bedekt met licht.
    Opmerking: De protocollen zullen variëren afhankelijk van antilichamen en doel-en antilichaam verdunning moeten afhankelijk van het experiment mogelijk worden geoptimaliseerd.
  8. Visualiseer fluorescentieerde sferoïden met de omgekeerde confocale Microscoop met behulp van methoden die in de vorige sectie zijn beschreven voor beeldvormings-sferoïden.
  9. Samengestelde z-stack beelden tonen de 3D-morfologie in de spheroids.

9. verzameling en analyse van Kanker stamcel populaties met Flowcytometrie

  1. Voorbereiding van sferoïden voor Flowcytometrie analyse
    1. Verzamel sferoïden van elke put in de hangende druppel platen met een pipet van 1.000 μL en stort ze in een centrifugebuis van 15 ml voor uitsplitsing met herhaalde pipetteren.
    2. Graaf levensvatbare cellen op een hemocytometer met behulp van Trypan Blue om het celnummer en de concentratie te bepalen zoals hierboven beschreven.
    3. Aliquot celsuspensie in vijf micro centrifugebuizen, zodanig dat elk een minimum van 50.000 cellen bevat.
    4. Centrifugeer alle buisjes bij 400 x g gedurende 5 minuten in een micro centrifuge.
    5. Aspireren de supernatant van elke buis en respenderen pellets in 100 μL buffer.
    6. Label buizen "onbevlekt", "DAPI", "APC-ISO", "DEAB", en "ALDH/CD133", respectievelijk.
    7. Voeg 0,5 μL APC-Isotype-antilichaam toe aan de APC-ISO-buis en 1 μL CD133-antilichaam aan de ALDH/CD133-buis, zoals bepaald door seriële verdunning en aanbeveling van de fabrikant.
    8. Voeg 5 μL DEAB-reagens en 0,5 μL ALDH toe aan de DEAB-buis en 1 μL ALDH aan de ALDH/CD133-buis.
    9. Vortex alle buisjes gedurende ongeveer 2 sec. en incuberen bij 37 °C gedurende 45 min.
    10. Vortex alle buisjes opnieuw en Centrifugeer gedurende 5 minuten op 400 x g in een micro centrifuge.
    11. Label FACS buizen "onbevlekt", "DAPI", "APC-ISO", "DEAB", en "ALDH/CD133" en vul een geïsoleerde schuim container opzij te zetten.
    12. Aspirate supernatant en hervat de "Onbevlekte" controle in 400 μL FACS buffer (1x PBS met 2% FBS) en alle andere buizen in 400 μL FACS DAPI buffer (FACS buffer met 300 μM 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole).
    13. Plaats de buisjes in de container met ijs tot ze op een flow cytometer worden geanalyseerd.
      Opmerking: Om te sorteren voor eierstokkanker stamcellen, verzamel alle cellen die de cytometer maatregelen om ALDH + en CD133 + met Gates ingesteld op te nemen 0,5% niet-specifieke APC-signaal en 0,15% niet-specifieke ALDH + signaal. Ten minste 10.000 cellen moeten worden geanalyseerd op betrouwbare resultaten. Meer informatie is te vinden in recente publicaties3,17.
  2. Analyse van ALDH +/CD133 + populaties in FlowJo
    1. Dubbelklik op het Flowjo -pictogram om het programma te openen en sleep. FCS-bestanden die zijn verkregen van flowcytometry-software naar de werkruimte.
    2. Dubbelklik op het niet-bevlekt bestand en stel de y-as in op de zijspreidings hoogte (SSC-h) en de x-as om de spreidings hoogte te doorsturen (FSC-h).
    3. Klik op de T -knop naast elke as om de schaal en transformatie aan te passen om de scheiding tussen verschillende celpopulaties te maximaliseren.
    4. Klik op de knop veelhoek gating en teken een veelhoek poort rond de celpopulatie en label de populatie ' cellen '.
    5. Dubbelklik op de cellen populatie in de werkruimte om alleen de cellen in de populatie ' cellen ' te bekijken en klik vervolgens op de FSC-as om het askanaal te veranderen in FSC-breedte en klik vervolgens op de SSC-as en verander het askanaal naar de FSC-H.
    6. Kies de rechthoek Gate gereedschap en teken een rechthoek rond de meest dichtbevolkte populatie van cellen over de gehele y-as om mogelijke dubbeltjes aan de rechterkant van het venster uit te sluiten en deze poort ' enkele cellen ' te labelen.
    7. Klik met de rechtermuisknop en kopieer de cellen en de geneste enkele cellen Gate en plak ze onder elk voorbeeld in de werkruimte.
    8. Dubbelklik op de enkele cellen Gate genest onder het DAPI-voorbeeld in de werkruimte om de eencellige populatie uit die voorbeeld buis te bekijken en klik op de FSC-as en verander het askanaal naar het DAPI-gebied kanaal.
    9. Klik op de SSC-as en wijzig het askanaal in histogram.
      Let op: de levende cellen zullen naar links zijn als ze DAPI uitsluiten, terwijl dode cellen in de DAPI zullen worden weergegeven en rechts van de grafiek verschijnen.
    10. Klik op de T -knop naast de DAPI -as en klik op as aanpassen om de schaal aan te passen om de scheiding tussen DAPI-positieve en DAPI-negatieve pieken te maximaliseren.
      Opmerking: Een venster zal verschijnen met schaalopties. Vaak, het instellen van het schaal veld op biex en het aanpassen van de extra negatieve decennia en breedte basis zal de grootste scheiding opleveren.
    11. Klik op toepassen in het pop-upvenster om schalingswijzigingen toe te passen, kies de knop bereik poort en verdeel deze over de negatieve piek van de DAPI, overeenkomend met de populatie van de levende cellen.
    12. Label deze poort ' Live Cells ' en klik met de rechtermuisknop om de ' Live Cells ' poort te kopiëren om deze te plakken onder de ' single Cells ' Gate onder de ' APC-ISO ', ' DEAB ', en ' ALDH/CD133 ' tubes om hetzelfde deel van de levende cellen in elke sample Tube te selecteren.
    13. Dubbelklik vervolgens op de populatie van levende cellen die is genest onder het APC-ISO-voorbeeldbestand en schakel de x-as over naar het Aldh-gebied kanaal en de y-as naar het APC-gebied kanaal.
    14. Nogmaals, pas de asschaal aan door op de T -knop te klikken en de as van elke as aan te passen , zodat de gebeurtenissen in de linkerbenedenhoek van het plot worden gelokaliseerd en selecteer de optie Quad Gate en klik op het plot venster om een Kwadrant poort te vestigen .
    15. Pas het snijpunt van de poort zodanig aan dat ongeveer 0,5% van de populatie in de linkerbovenhoek van het plot venster of het ' APC positive ' Kwadrant ligt.
      Opmerking: Deze 0,5% vertegenwoordigt de niet-specifieke kleuring van het APC-Isotype.
    16. Klik met de rechtermuisknop op elk kwadrant label afzonderlijk in de werkruimte en wijzig deze op de juiste manier. Besturingselement of opdracht klikt u op elk kwadrant poort label in de werkruimte en kopieer deze.
      Opmerking: ' Q1 ' staat voor CD133 + cellen; ' Q2 ' staat voor CD133 + en ALDH + ' cellen; ' Q3 ' staat voor ALDH + cellen; en ' Q4 ' staat voor CD133-en ALDH-cellen.
    17. Plak de Kwadrant poorten op de populatie van levende cellen die is genest onder het ' deab ' bestand. Pas de verticale lijn zodanig aan dat ongeveer 0,15% van de celpopulatie binnen het ' ALDH + ' Kwadrant ligt, waarbij de horizontale lijn niet wordt verplaatst.
      Opmerking: Deze 0,15% vertegenwoordigt een niet-specifiek ALDH-signaal.
      1. Om ervoor te zorgen dat de horizontale lijn niet van positie verandert, kopieert u de nieuwe Kwadrant poorten onder het Deab -bestand en plakt u deze op de Live cellen onder het APC ISO-bestand. Selecteer Ja wanneer u wordt gevraagd de bestaande Kwadrant poort te vervangen.
      2. Controleer in de werkruimte dat het ' CD133 + ' percentage nog steeds ongeveer 0,5 is onder het bestand ' APC-ISO '.
    18. Kopieer en plak de Kwadrant-Gates in de populatie ' Live Cells ' van het bestand ' ALDH/CD133 '.
      Opmerking: Het percentage van de levensvatbare celpopulatie aanwezig in het kwadrant rechtsboven is het percentage ALDH + en CD133 + dubbele positieve CSCs in het monster.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Spheroids gevormd met cellijnen of door de patiënt afgeleide CSCs kunnen worden gevormd met een reeks kleine celaantallen binnen hangende druppeltjes (Figuur 2a). Spheroids vormen betrouwbaar met slechts 10 cellen per put, waardoor zeldzame patiënt monsters kunnen worden beschermd. Cellen binnen deze sferoïden zijn omgeven door andere cellen in 3 dimensies zoals ze zouden zijn in vivo, waardoor fysiologisch celcelcontacten en diffusie percentages. Tumor cellen binnen de spheroïden proliferer...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het 384-well Hanging drop Plate-platform voor 3D-spheroid-formatie is een eenvoudig te implementeren tool voor elke celbiologie of Kankerbiologie Labs. Dit fysiologisch platform maakt de studie van cellijnen, evenals, primaire patiënt monsters binnen fysiologisch relevante 3D-culturen mogelijk, terwijl het een hoge doorvoer van drugs screening toestaat. Het platform zorgt er ook voor dat de cultuuromstandigheden sterk instelbaar zijn, waardoor een strakke controle over de dichtheden, celcocultuurverhoudingen, extracellul...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk wordt voornamelijk ondersteund door de DOD OCRP Early loopbaan onderzoeker Award W81XWH-13-1-0134 (GM), DOD pilot Award W81XWH-16-1-0426 (GM), DOD onderzoeker geïnitieerd Award W81XWH-17-OCRP-IIRA (GM), Rivkin Center voor ovariële kanker en Michigan ovariële kanker Alliantie. Het onderzoek dat in deze uitgave werd gerapporteerd, werd gesteund door het National Cancer Institute van de National Institutes of Health onder het awardnummer P30CA046592. CMN wordt ondersteund door de National Science Foundation Graduate Research Fellowship onder Grant No. 1256260. MEB wordt ondersteund door het departement onderwijs Graduate Assistance in gebieden van National Need (GAANN) Fellowship.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.25% trypsin-EDTAGibcoILT25200056
10 mL serologische pipetFisher Scientific13-678-11E
10,000 cSt Si olieMillipore Sigma63148-62-9Wordt gebruikt om de spheroid array mal te coaten om het verwijderen van weefselverwerkingsgels, zoals Histogel, uit de mal te vergemakkelijken.
100 mm weefselkweekschaalThermo Scientific130182
15 mL conische buisCelltreatFL4021
1x DMEM voor Serum Vrij MediumGibco11965-092
1x F12 voor Serum Vrij MediumGibco11765-054
1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)GibcoILT10010023
4’,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI)Thermo FisherD1306
40 µm filterFisher Scientific22363547
6-well plateFisher Scientific353046
AccutaseInnovative Cell Technologies Inc.1449Een mild enzym voor celdetachering, samengesteld uit proteolytische en collagenolytische enzymen.
ACK Lysing BufferThermo ScientificA1049201
alamarBlueInvitrogenDAL1025Resazurin kleurstof gebruikt om de levensvatbaarheid en proliferatie van cellen te meten op basis van hun vermogen om resazurin te reduceren tot resorufine, die sterk fluorescerend is.
ALDEFLUOR assay kitStem Cell Tech1700Kit om stam- en voorlopercellen te identificeren die hoge niveaus van aldehyde dehydrogenase uitdrukken, een indicator van kanker stamcellen. De kit bestaat uit ALDEFLUOR Reagens, DEAB, Zoutzuur, Dimethylsulphoxide, en ALDEFLUOR Assay Buffer.
ALDEFLUOR Diethylaminobenzaldehyde (DEAB)Stem Cell Tech1705Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) is een remmer van ALDH iso-enzymen, gebruikt om niet-specifieke ALDH kleuring te bepalen.
Andor iXon x3 CCD CameraOxford Instruments-
Antibiotica en AntimycoticaGibco15240-062
APC-isotype IgG2bMiltenyi biotec130-092-217Isotype controle om niet-specifieke kleuring van IgG2b antilichamen te kwantificeren.
B27 SupplementGibco17504044
basic Fibroblast Growth FactorStem Cell Technologies78003.1
BD Lo-Dose U-100 Insulin InjectiespuitenFisher Scientific14-826-79
BioTek Synergy HT Microplate ReaderBioTek7091000
CD133-APCMiltenyi biotec130-113-184Fluorescente antilichaam gericht op CD133, een kanker stamcel marker.
cellSens Dimension SoftwareOlympus
CisplatinSigma-AldrichP4394Platinum-gebaseerde chemotherapie-middel dat functioneert als een alkylerend middel dat DNA verstoort.
DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenylindole, Dihydrochloride)InvitrogenD1306
Epidermale GroeifactorGibcoPHG0311
EVOS XL Core Cell Imaging SystemLife TechnologiesAME3300
Fetal Bovine Serum - premium (FBS)Atlanta BiologicalsS11150
Ficoll 400Sigma-AldrichF4375
HemacytometerHausser Scientific1490
HistogelThermo ScientificHG-4000-012Weefselverwerkingsgel die kan penetreren en het specimen in de gel kan houden terwijl het verkleuringen rond het specimen tijdens het kleuren voorkomt.
Human Adipose-Derived Mesenchymal StamcellenLonzaPT-5006
Human Microvascular EndotheelcellenLonzaCC2543
Insulin-Transferrine-Selenium SupplementGibco51500-056
Live/Dead levensvatbaarheidskitInvitrogenL3224Kit voor de detectie op basis van fluorescentie van levende (calcein-AM) en dode cellen (Ethidium Homodimer-1).
MEM Niet-essentiële AminozurenGibco11140-050
MetaMorph 7.8 SoftwareMolecular Devices-
Olympus IX81 Omgekeerde Confocale MicroscoopOlympus-
Olympus IX83 Research Omgekeerde MicroscoopOlympus
Parafilm MThomas Scientific7315D35Thermoplastische polymere strips die dienen om druppelevaporatie in zwevende druppel platen te beperken terwijl ze gasuitwisseling toestaan.
Perfecta 3D 384 Well Hangende Druppel Platen3D BiomatrixHDP1384-8Beschikbaar via Sigma-Aldrich
phalloidin AlexaFluor488InvitrogenA12379Phalloidin is een peptide om F-actin in gefixeerde cellen fluorescent te labelen.
ProJet 3500 HD Max3D Systems-3D printer
Steriele DI waterFisher Scientific353046
Trypan BlauwGibco15250061Azo kleurstof gebruikt om onderscheid te maken tussen levende en dode cellen op basis van zijn vermogen om door de beschadigde membraan van dode cellen te passeren, maar niet door de intacte membraan van levende cellen.
VisiJet M3 Crystal3D Systems-Een biocompatibel polymeer materiaal voor 3D printen.
Yokogawa CSU-X1 Confocale Scanner UnitYokogawa-

Referenties

  1. All cancers Source: Globocan. , Globocan. http://gco.iarc.fr/today/data/factsheets/cancers/39-All-cancers-fact-sheet.pdf (2018).
  2. Prasad, V., Mailankody, S. Research and Development Spending to Bring a Single Cancer Drug to Market and Revenues After Approval. JAMA Internal Medicine. 177, 1569-1575 (2017).
  3. Raghavan, S., et al. Personalized Medicine Based Approach to Model Patterns of Chemoresistance and Tumor Recurrence Using Ovarian Cancer Stem Cell Spheroids. Clinical Cancer Research. 23 (22), 6934-6945 (2017).
  4. Jordan, C. T., Guzman, M. L., Noble, M. Cancer Stem Cells. New England Journal of Medicine. 355, 1253-1261 (2006).
  5. Ishiguro, T., et al. Establishment and Characterization of an In Vitro Model of Ovarian Cancer Stem-like Cells with an Enhanced Proliferative Capacity. Cancer Research. 76, 150-160 (2016).
  6. Páez, D., et al. Cancer Dormancy: A Model of Early Dissemination and Late Cancer Recurrence. Clinical Cancer Research. 18, 645-653 (2012).
  7. Ahmed, N., Stenvers, K. L. Getting to Know Ovarian Cancer Ascites: Opportunities for Targeted Therapy-Based Translational Research. Frontiers in Oncology. 3, (2013).
  8. Pradhan, S., Clary, J. M., Seliktar, D., Lipke, E. A. A three-dimensional spheroidal cancer model based on PEG-fibrinogen hydrogel microspheres. Biomaterials. 115, 141-154 (2017).
  9. Varna, M., Bertheau, P., Legrès, L. Tumor Microenvironment in Human Tumor Xenografted Mouse Models. Journal of Analytical Oncology. 3, 159-166 (2014).
  10. Huang, S. B., et al. An integrated microfluidic cell culture system for high-throughput perfusion three-dimensional cell culture-based assays: Effect of cell culture model on the results of chemosensitivity assays. Lab on a Chip. 13, 1133-1143 (2013).
  11. Zang, R., Li, D., Tang, I. C., Wang, J., Yang, S. T. Cell-Based Assays in High-Throughput Screening for Drug Discovery. International Journal of Biotechnology for Wellness Industries. , (2012).
  12. Murphy, B., et al. Evaluation of alternative in vivo drug screening methodology: a single mouse analysis. Cancer Research. 76, 5798-5809 (2016).
  13. Hidalgo, M., et al. Patient-derived Xenograft models: An emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).
  14. Damiati, S., Kompella, U. B., Damiati, S. A., Kodzius, R. Microfluidic devices for drug delivery systems and drug screening. Genes. 9, (2018).
  15. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A Practical Guide to Hydrogels for Cell Culture. Nature Methods. 14, 69-81 (2016).
  16. Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Control Release. , (2012).
  17. Mehta, P., Novak, C., Raghavan, S., Ward, M., Mehta, G. Self-Renewal and CSCs In Vitro Enrichment: Growth as Floating Spheres. Cancer Stem Cells: Methods and Protocols. Papaccio, G., Desiderio, V. , Springer. New York. 61-75 (2018).
  18. Raghavan, S., et al. Formation of stable small cell number three-dimensional ovarian cancer spheroids using hanging drop arrays for preclinical drug sensitivity assays. Gynecologic Oncology. 138, 181-189 (2015).
  19. Raghavan, S., et al. Comparative analysis of tumor spheroid generation techniques for differential in vitro drug toxicity. Oncotarget. 7, 16948-16961 (2016).
  20. Kim, S., et al. Evaluating Tumor Evolution via Genomic Profiling of Individual Tumor Spheroids in a Malignant Ascites. Scientific Reports. 8, 1-11 (2018).
  21. Silva, I. A., et al. Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival. Cancer Research. 71, 3991-4001 (2011).
  22. Pulaski, H. L., et al. Identifying alemtuzumab as an anti-myeloid cell antiangiogenic therapy for the treatment of ovarian cancer. Journal of Translational Medicine. 7, 49(2009).
  23. Jager, L. D., et al. Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells. Advances in Medical Sciences. 61, 78-84 (2016).
  24. Ivanov, D. P., Grabowska, A. M. Spheroid arrays for high-throughput single-cell analysis of spatial patterns and biomarker expression in 3D. Scientific Reports. 7, 41160(2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Patiëntafgeleide sferoïden3D-celkweekhanging drop-platformhigh-throughput screeningflowcytometrie-analyseresazurine-viabiliteitsassayconfocale microscopie-imagingsingle-cell RNA-sequencingeierstokkanker-model
Fysiologisch patiënt afgeleide 3D-Spheroids voor anti-neoplastische geneesmiddelen screening om kanker stamcellen te targeten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.