Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

In vivo genetisch scherm naar voren om nieuwe neuroprotectieve genen in Drosophila melanogaster te identificeren

9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59720

⸱

11 juli 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Alabama, 2Department of Genetics, University of Wisconsin-Madison

In dit artikel

Samenvatting

We presenteren een protocol met een voorwaartse genetische benadering van het scherm voor mutanten die neurodegeneratie in Drosophila melanogastertentoonstellen. Het bevat een klim test, histologie analyse, genmapping en DNA-sequencing om uiteindelijk nieuwe genen te identificeren die verband houden met het neuroprotectie proces.

Samenvatting

Er is veel te begrijpen over het ontstaan en de progressie van neurodegeneratieve ziekten, met inbegrip van de onderliggende genen die verantwoordelijk zijn. De voorwaartse genetische screening met behulp van chemische mutagene agentia is een nuttige strategie voor het in kaart brengen van Mutante fenotypes op genen bij Drosophila en andere model organismen die geagglomerde cellulaire trajecten met mensen delen. Als het gemuleerde gen van belang niet dodelijk is in vroege ontwikkelingsstadia van vliegen, kan een klim test worden uitgevoerd om te schermen voor fenotypische indicatoren van verminderde hersen werking, zoals lage klim snelheden. Vervolgens kan secundaire histologische analyse van hersenweefsel worden uitgevoerd om de neuroprotectieve functie van het gen te controleren door het scoren van neurodegeneratie fenotypes. Genmapping strategieën omvatten Meiotische en deficiëntie mapping die afhankelijk zijn van deze zelfde testen kunnen worden gevolgd door DNA-sequencing om mogelijke nucleotide veranderingen in het gen van belang te identificeren.

Inleiding

Neuronen zijn voor het grootste deel post-mitotische en niet in staat om1,2te verdelen. Bij de meeste dieren bestaan neuroprotectieve mechanismen om deze cellen gedurende de levensduur van het organisme te behouden, vooral op oudere leeftijd wanneer neuronen het meest kwetsbaar zijn voor beschadiging. Genen die aan deze mechanismen ten grondslag liggen, kunnen worden geïdentificeerd bij mutanten die neurodegeneratie vertonen, een fenotypische indicator voor het verlies van neuroprotectie, met behulp van een forward genetisch protocol. Voorwaartse genetische schermen die gebruik maken van chemische mutagene agentia, zoals ethyl methanesulfonaat (EMS) of N-ethyl-N-nitrosoureumderivaat (ENU), zijn met name nuttig vanwege de willekeurige puntmutaties die zij induceren, resulterend in een inherent onbevooroordeelde benadering die licht heeft werpen op talrijke genfuncties in eukaryotische model organismen3,4,5 (in tegenstelling, Röntgen mutagenese creëert DNA-onderbrekingen en kan resulteren in herschikking in plaats van puntmutaties6).

De gewone fruitvlieg Drosophila melanogaster is een ideaal onderwerp voor deze schermen vanwege de hoge kwaliteit, goed geannoleerde genoom sequentie, zijn lange geschiedenis als modelorganisme met sterk ontwikkelde genetische hulpmiddelen, en het meest aanzienlijk, zijn gedeelde evolutionaire geschiedenis met mensen7,8. Een beperkende factor in de toepasselijkheid van dit protocol is vroege letaliteit veroorzaakt door de gemuleerde genen, die zou voorkomen dat testen op oudere leeftijd9. Voor niet-dodelijke mutaties is een klim test, die gebruik maakt van negatieve geotaxi's, echter een eenvoudige, maar uitgebreide methode om verminderde motorische werking10te kwantificeren. Om voldoende motorische reactiviteit te vertonen, zijn vliegen afhankelijk van neurale functies om de richting te bepalen, de positie ervan te voelen en de beweging te coördineren. Het onvermogen van vliegen om voldoende te klimmen in reactie op prikkels kan daarom duiden op neurologische gebreken11. Zodra een bepaalde defecte klim fenotype is geïdentificeerd, kan verder testen met behulp van een secundair scherm zoals histologische analyse van hersenweefsel worden gebruikt om neurodegeneratie in klimmen-defecte vliegen te identificeren. Daaropvolgende genmapping kan vervolgens worden gebruikt om de genomische regio te onthullen op het chromosoom dat het defecte neuroprotectieve gen van belang draagt. Om de chromosomale regio van belang te verfijnen, kan Meiotische mapping met behulp van Mutante vlieg lijnen met dominante marker genen met bekende locaties op het chromosoom worden uitgevoerd. De marker genen dienen als referentiepunt voor de mutatie, aangezien de frequentie van recombinatie tussen twee loci een meetbare afstand biedt die kan worden gebruikt om de geschatte locatie van een gen in kaart te kunnen gebracht. Ten slotte creëert het kruisen van de gemuteerde lijnen met lijnen die evenwichtige tekortkomingen vertonen op de in de meiotisch toegewezen chromosomale regio van belang een complementatie test waarbij het gen van belang kan worden geverifieerd als het bekende fenotype5wordt uitgedrukt. Polymorfe nucleotide sequenties in het geïdentificeerde gen, mogelijk resulterend in een veranderde aminozuur sequenties, kunnen worden geëvalueerd door het gen te sequentiëren en te vergelijken met de Drosophila genoom sequentie. Latere karakterisering van het gen van belang kan zijn het testen van extra Mutant allelen, mutatie redding experimenten en onderzoek van aanvullende fenotypes.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. voorbereiding en veroudering van vliegen

  1. Verkrijg of Genereer6 een verzameling Drosophila mutanten die zullen worden gebruikt voor het genetische scherm. Hier worden ENU-mutageen lijnen toegewezen aan het tweede chromosoom en evenwichtig over Cyo gebruikt.
  2. Versterk de experimentele genotype-lijnen in een incubator ingesteld bij 25 °C, 12 uur licht/donker cyclus op maïsmeel-melasse medium.
  3. Verzamel ongeveer 20 homozygoot nakomelingen tussen 0-2 dagen van volwassen eclosie van elk experimenteel genotype. Elimineer seks bias door consequent zowel mannelijke als vrouwelijke vliegen te verzamelen.
  4. Leeftijd de vliegen op maïsmeel-melasse medium naar wens bij 29 ° c, het omdraaien van de flesjes elke 2-3 dagen om de vliegen op vers voedsel als ze ouder te houden. In het scherm gepresenteerd hier, vliegen waren leeftijd voor 10-12 dagen.
  5. Monteer een testkamer voor de klim test met twee flacons en tape zoals hierboven beschreven10. De injectieflacons moeten op beide open uiteinden worden aangesloten. Gebruik een liniaal om een lijn van 5 cm aan de ene kant van de kamer te markeren.

2. Protocol 1: klim test (aangepast van Ali et al.10)

  1. Valideer de klim test. In deze studie, test de klim test op basis van eerder beschreven methodologie door Ali et al.10, met behulp van elavC155≫ UAS-tauR406W (exposeren lagere klim tarieven) en elavC155> UAS-GFP ( Control) en ElavC155> UAS-mcherry (Control) vliegen.
  2. Draai de vliegen in een testkamer, één regel tegelijk (gebruik geen CO2 anesthesie) en laat ze om te herstellen voor 5 min. Als de test op verschillende dagen wordt uitgevoerd, voert u de test op hetzelfde tijdstip van de dag uit. In deze studie, alle klimmen assays werden uitgevoerd in de namiddag om te controleren voor circadiane effecten op motoriek12.
    Opmerking: Vermijd het blootstellen van de vliegen aan direct zonlicht tijdens het testen; Dit zal interfereren met hun vermogen om te klimmen.
  3. Raak de kamer (gemarkeerde kant naar beneden) op een muismat geplaatst op een effen oppervlak 3 keer, zodat alle vliegen begint de assay aan de onderkant. Let op vlieg motoriek over een periode van 10 sec.
  4. Noteer het aantal vliegen dat de 5 cm-lijn binnen deze tijd bereikt of passeert, evenals het totale aantal geteste vliegen. Herhaal het Protocol, wacht 1 minuut tussen elke proef, voor een minimum van 3 trial replicaten per regel.
    Opmerking: In de huidige studie, elke injectieflacon tussen 2 en 19 vliegt voor de initiële screening (mannelijke vliegen) en tussen 6 en 21 vliegt voor de Mutant deficiëntie analyse van gekruiste vrouwelijke lijnen (punt 5,3.).

3. Protocol 2: selectie van Drosophila stammen voor verdere analyse

  1. Voer de klim assay gegevens in Microsoft Excel of soortgelijke software en bereken de klimsnelheid voor elke regel over alle replicaten als een percentage.
  2. Voer statistische analyses uit om Mutante lijnen te detecteren die significant afwijken van de gemiddelde klim procent waarde van alle lijnen met behulp van het R-softwarepakket13.
    1. Lees in gegevensbestanden die zijn samengesteld voor R (. CSV-of. txt-bestanden met een kolom voor elke variabele of factor en rijen die de specifieke waarden vertegenwoordigen).
      Opmerking: Hier werden gegevens voor mannetjes (initiële assay) en vrouwtjes (lijn 867 gekruist naar deficiëntie lijnen) in afzonderlijke. xlsx-bladen ingevoerd als twee kolommen, een waarbij de rijen van de kolom de gemuteerde lijn identificeren en hoe vaak de assay is gerepliceerd en de andere waar rijen representeren het gemiddelde klim succes (als percentage) voor elke replicaatvial van vliegen.
    2. Lees de gegevens in R met behulp van de volgende code:
      Mali <-read. CSV (".. /male_init.csv ")
      femdef <-read. CSV (".. /fem_def_cross.csv ")
      Opmerking: De ".." in het pad mappen zijn absolute paden uit de hoofdmap van de computer van de gebruiker en zou moeten worden opgegeven door de individuele gebruiker voor de directory-paden van hun computer.
    3. Lineaire modellering uitvoeren
      1. Dummy-variabele regressie uitvoeren met de LM -functie in R. Voor de initiële analyse van de Mutante lijnen, evalueer je de significantie van factor effecten (Mutante lijnen) op percentage klim successen tegen de Grand Mean voor een nulgemiddelde gecentreerde responsvariabele (percentage succes).
        Opmerking: De "-1" aan het einde van de LM -functie oproep in paragraaf 3.2.3.2. verwijdert het snijpunt en stelt ons in staat om alle factor niveaus te testen tegen het nulgemiddelde gecentreerde gemiddelde van percentage klimsnelheid.
      2. Druk de resultaten af op het scherm met behulp van de R- samenvattings functie:
        mali_anova <-LM (schaal (Mali $ P_Success) ~ Mali $ Mutant_line-1)
        Samenvatting (mali_anova)
      3. Gebruik besturings lijnen (indien aanwezig) als de basislijn voor het testen van factor niveau effecten tegen het gebruik van de volgende R-code: x <-relevel (femdef $ Mutant_line, Ref = "a867_plus")
        femdef_anova <-LM (femdef $ P_success ~ x)
        Samenvatting (femdef_anova)
        Opmerking: De eerste regel met code herbestelt de factor niveaus zodat de negatieve controle lijn het basis snijpunt wordt waarmee alle andere factor niveaus (gemuteerde lijnen) worden getest met de ingebouwde t-tests in de LM -functie.
  3. Kies een drempelwaarde voor kandidaatregels, afhankelijk van de leeftijd op het moment van testen. Om de drempel te bepalen, voert u een voorlopige test uit op de gewenste leeftijd met behulp van bekende mutanten die neurodegeneratie en lage klimsnelheid vertonen in vergelijking met wild type, controle vliegen10.
    Opmerking: Een voorbijgaand tarief van minder dan 50% kan geschikt zijn voor 10 dagen-oude vliegen zoals eerder gemeld voor Drosophila Lines die het menselijk neurodegeneratie-gerelateerde gen tau in het zenuwstelsel overexpressie10. Oudere vliegen moeten een hogere drempelwaarde voor het passeren, omdat ze worden verwacht te vertonen verminderde motoriek, dus, verhoogde neurodegeneratie.

4. Protocol 3: histologie analyse

  1. Het dragen van handschoenen, sever vliegen hoofden met een chirurgische Blade na de klim test en gebruik een penseel om zachtjes te plaatsen in 1 mL van Carnoy fixeermiddel (6:3:1 van 100% EtOH: chloroform: ijsazijn zuur) in een 1,5 mL micro centrifugebuis O/N bij 4 °C. Zorg ervoor dat de koppen in de fixatieve oplossing zinken.
  2. Vervang de fixatieve oplossing de volgende dag met 1 mL 70% EtOH en onderhoud de monsters nog steeds bij 4 °C voor toekomstige analyse.
    Opmerking: Het protocol kan bij deze stap worden onderbroken.
  3. Plaats de koppen van stap 4,2. maximaal vijf per micro biopsie cassette. Plaats de cassettes onmiddellijk in een container gevuld met 70% EtOH. Bewaar de container bij 4 °C voorafgaand aan de verzending naar een histologie faciliteit voor verwerking en paraffine insluiten van de koppen. Als er apparatuur voor weefsel verwerking en inbedding beschikbaar is, volgt u stap 4,4.
  4. Sluit de koppen in paraffine voor het snijden van microtoom:
    1. Volg de programma-instellingen voor een geautomatiseerde weefselverwerkende machine in de volgorde die wordt weergegeven in tabel 1 om te onthydra teren, te wissen en te infiltreren met paraffine de koppen.
    2. Breng de monsters over in metalen basis mallen die in de cassette passen met behulp van paraffine verwarmd tot 60 °C met behulp van een paraffine-insluitings station.
    3. Oriënteer de koppen (Antero-posterieure oriëntatie tegenover de bovenkant) in de basis mal met behulp van fijne tang om een goede visualisatie van het hersenweefsel na het snijden mogelijk te maken. Dit kan gedaan worden door het opwarmen van de paraffine bij 60 °C en indien nodig de koppen opnieuw te positioneren.
      Opmerking: Metalen mallen kunnen worden vervangen door wegwerp basis mallen.
    4. Plaats de cassette op de bovenkant van de bijbehorende basis mal en verplaats deze voorzichtig naar de gekoelde zijde van het paraffine-insluitings station (4 °C). Wacht tot het blok verhardt alvorens het uit het station te verwijderen.
    5. Verwijder het blok van de mal door de mal voorzichtig van de cassette te ontkoppelen.
  5. Trim elk paraffine blok voorafgaand aan het snijden om het oppervlak dat wordt verdeeld te minimaliseren.
  6. Stel de microtoom in om 5 μm secties van elk blok te knippen.
  7. Plaats het paraffine lint met het weefsel in een verwarmd waterbad (35 °C) gedurende maximaal 5 minuten.
  8. Dompel een poly-lysine gecoate glijbaan (helpt om het weefsel te behouden) in het verwarmde waterbad, het plaatsen van het gesectioneerde lint op de glijbaan met behulp van hout applicators. Laat de dia's lucht drogen O/N bij kamertemperatuur.
  9. Verwarm de glaasjes 15 min bij 63 °C met een schuif warmer.
  10. Plaats de dia's op een schuif kleurrek en beits met hematoxyline en eosine (H & E) onder een rook afzuigkap door de volgende stappen te volgen.
    1. Plaats het rek in Histochoice (niet-toxische vervanging van xyleen, die helpt om de paraffine uit het monster te verwijderen) gedurende 5 minuten.
    2. Breng het rek in een container met Histochoice gedurende 5 min.
    3. Breng het rek over in een container gevuld met 100% EtOH 1 gedurende 5 min.
    4. Breng het rek over in een container gevuld met 100% EtOH 2 gedurende 5 min.
    5. Breng het rek over in een container gevuld met 95% EtOH gedurende 3 min.
    6. Breng het rek over in een container gevuld met 70% EtOH gedurende 3 min.
    7. Breng het rek in een container die gevuld is met gedistilleerd H2O gedurende 5 min.
    8. Breng het rek over in een container gevuld met Harris Hematoxylin voor 2-5 min.
    9. Neem het rek uit de Hematoxylinoplossing en plaats het onder stromend kraanwater gedurende 10 minuten.
    10. Breng het rek over in een container gevuld met gedistilleerd water door een korte dunk te doen.
    11. Breng het rek over in een container gevuld met eosine voor 1-2 min.
    12. Breng het rek in een container gevuld met 95% EtOH door het doen van een korte dunk.
    13. Breng het rek over in een container gevuld met 95% EtOH gedurende 5 min.
    14. Breng het rek over in een container gevuld met 100% EtOH gedurende 5 min.
    15. Breng het rek over in een container gevuld met 100% EtOH gedurende 5 min.
    16. Breng het rek in een container gevuld met Histochoice (of xyleen) voor 5-10 min totdat alle dia's zijn gemonteerd.
    17. Monteer de glijbaan en de dekslip (24 mm x 60 mm van grootte). Gebruik de Tang, neem de Slide uit de Histochoice-of xyleen-oplossing en maak een dun strook afdekmedium op de bovenkant ervan. Plaats de Afdeklijst voorzichtig op de bovenkant en probeer de vorming van bubbels te voorkomen.
    18. Laat het montage medium op gemonteerde dia's vóór de analyse onder de afzuigkap uitharden.
    19. Bewaar gekleurde dia's in een doosje bij kamertemperatuur.
  11. Kwantificeer neurodegeneratie door te kijken naar alle seriële secties op de dia bij 20x vergroting onder een lichte Microscoop. Onderzoek de hele hersenen, rekening houdend met de grootte en het aantal vacuolen die in drie opeenvolgende secties worden weergegeven.
  12. Het verkrijgen van beelden van representatieve hersen secties op ongeveer mid-Brain met behulp van een lichte Microscoop uitgerust met Imaging software.

5. Protocol 4: Genmapping van recessieve Mmutant fenotype

  1. Oversteek de kandidaatlijn naar een wild type (BL_ 9517) of een ander wild type of een isogenized stam (bijv. oregonr (BL_ 2376), w1118 (BL_5905) of YW (BL_ 6599) om te bepalen of het fenotype dominant is of Recessief.
    Opmerking:     de resultaten van deze stap zullen de volgende stappen van de toewijzing begeleiden. Als het fenotype recessief is, kan een deficiëntie toewijzing worden uitgevoerd.
    1. Met behulp van een penseel, maak een kruis door het plaatsen van een voedsel bevattende flacon CO2-anesthetized vliegen van de Mutant lijn van belang (5 mannetjes) en de kantons (10-15 Virgin vrouwtjes). Plaats de injectieflacon op 25 °C.
    2. Verzamel heterozygoot F1 nageslacht en herhaal klimmen en histologie experimenten.
    3. Vergelijk de verkregen resultaten met alleen de controle leiding en de homozygoot mutanten. Een goede indicatie van recessieve fenotype zal zijn als heterozygoot mutanten soortgelijke fenotypes vertonen als wild type vliegen.
  2. Voer Meiotische mapping uit om ruwweg de locatie van de mutatie op het tweede chromosoom te schatten met behulp van de WGSP-1 J1 L2 pin1/Cyo (BL_3227) of een gelijkwaardige stam met geassocieerde dominante markers bij bekende cytologische locatie. In dit geval was de mutatie voorheen bekend om zich op het tweede chromosoom te bevinden.
    1. Met behulp van een penseel, maak een kruis door het plaatsen van een voedsel bevattende flacon CO2-anesthetized vliegen van de Mutant lijn van belang (5 mannetjes) en de WGSP-1 J1 L2 pin1/Cyo lijn (10 vrouwtjes). Plaats de injectieflacon op 25 °C.
      Opmerking: Het doel van dit Kruis is het genereren van heterozygoot vrouwtjes die het chromosoom dragen met de nieuwe mutatie en het marker chromosoom, dat tijdens de meiose6,14opnieuw zal worden gecombineerd. Vrouwelijke F1-nakomelingen worden gekozen in plaats van mannetjes, omdat recombinatie niet voorkomt bij mannen.
    2. Verzamel ten minste 15 maagdelijke vrouwelijke nakomelingen die het chromosoom dragen met de nieuwe mutatie en het marker chromosoom en steek ze over naar 5 mannetjes uit een gebalanceerde lijn die een andere zichtbare dominante marker draagt (bijv. Cyo/SNASCO (BL_2555) of equivalent).
    3. Verzamel heterozygoot mannelijke nakomelingen die SCO of Cyo dragen en het potentieel hercombineerbaar chromosoom van het Kruis in stap 5.2.2. en hen individueel te paren tot maagdelijke vrouwtjes uit de kolf die het gemuleerde chromosoom draagt.
    4. Verzamel de nakomelingen van het eind Kruis zoals beschreven in stap 5.2.3. en leeftijd de vliegen op 29 ° c (in deze studie vliegen waren leeftijd voor 10-14 dagen).
    5. Verzamel koppen, voer histologische analyse uit zoals beschreven in Protocol 3 en kijk naar de dia's met hersen secties om de mate van Neuropathologie te bepalen zoals beschreven in stap 4,11. Histologische analyse wordt uitgevoerd in plaats van motorische analyse als gevolg van fenotypes die de klim test kunnen beïnvloeden, zoals Jammed (J), waardoor vloeistof ophoping in de vleugels15ontstaat.
  3. Voer deficiëntie toewijzing op versmald gebied van het chromosoom uit om de locatie van de recessieve mutatie te verfijnen met behulp van de klim test. Elke deficiëntie lijn heeft een verwijdering van verschillende regio van de chromosomen, zodat ze kunnen worden gebruikt voor het testen van de complementatie.
    1. Begin met grote tekortkomingen die de regio die is geïdentificeerd in de Meiotische mapping, die vervolgens verder kan worden verkleind door het gebruik van kleinere tekortkomingen omvatten. Als de deficiëntie analyse resulteert in meer dan één kandidaatgen, wordt het gebruik van RNA-interferentie (RNAi)-aandelen aanbevolen om ze te targeten.
    2. Dwars lijnen van de Drosophila -deficiëntie Kit16 voor het tweede chromosoom (DK2L in deze studie) en zoek naar niet-complementatie van het fenotype van belang (in deze studie: klim tarief van 8,5%, wat overeenkomt met het tarief van Homozygoot vliegt vanaf lijn 867 gebruikt als positieve controle).
    3. Bevestig de neurodegeneratie fenotype met behulp van histologie verificatie zoals beschreven in sectie 4 (Protocol 3).

6. Protocol 5: DNA-sequencing en-analyse

Opmerking: Houd er rekening mee dat ENU mutagenese puntmutaties11introduceert.

  1. Ontwerp voorwaartse en omgekeerde primer sequenties flaneren van de Exon-coderende regio van het Brat -gen voor versterking door polymerase-kettingreactie (PCR) van het gebied van belang (in het geval van lijn 867 wordt een DNA-fragment van de grootte van 3.247 BP versterkt voor volgorde17).
  2. Extract DNA uit een enkele vlucht18 :
    1. Trek zachtjes de vlieg in een micro centrifugebuis van 0,5 mL met 50 μL squishing buffer (10 mM tris-cl pH 8,2, 1 mM EDTA, 25 mM NaCl en 200 μg/mL proteinase K; het enzym moet vóór elk gebruik vers worden verdund van een bevroren voorraad) met behulp van een P100 of P200 pipetpunt.
    2. Inincuberen gedurende 30 min bij 37 °C
    3. Deactiveer de proteinase K door de buis gedurende 2 min op 95 °C te plaatsen.
      Opmerking: Het geëxtraheerde DNA kan gedurende enkele maanden bij 4 °C worden bewaard.
  3. Voer de PCR-reactie uit met behulp van een high-fidelity DNA Taq polymerase (reagentia en thermische fiets condities die in deze studie worden gebruikt, worden weergegeven in tabel 2 en tabel 3) door de instructies van de fabrikant te respecteren en het PCR-product op een 1 % agarose gel die Invitrogen SYBR Safe DNA gel Stain bevat, een niet giftig alternatief voor ethidium bromide.
  4. Accijns de band van de juiste grootte van de gel met een scalpel en zuiveren het PCR-product met behulp van de wizard SV gel en PCR clean-up System (Promega) of gelijkwaardige Kit, door de instructies van de fabrikant te respecteren.
  5. Ontwerp voorwaartse en omgekeerde primers die zullen worden gebruikt voor DNA-sequencing om zo mogelijk het hele gebied van belang te bestrijken. Volg het gel-gezuiverde DNA uit de vorige stap om puntmutaties te identificeren. Hoge nauwkeurigheid in geautomatiseerde fluorescerende Sanger-sequencing kan worden bereikt voor maximaal 700 BP.
    Opmerking: De ex Taq polymerase (TaKaRa) kan worden gebruikt om PCR-producten te versterken van genomische DNA-sjablonen tot 20 kB aan grootte.
  6. Analyseer verkregen DNA sequenties met behulp van de een plasmide editor (ApE, door M. Wayne Davis) of soortgelijke software door ze te uitlijnen en te vergelijken met de sequenties die zijn verkregen na het sequentiëren van dezelfde genomische regio van een referentiestam (bijv. oorspronkelijk gemutageniseerde lijn).
    1. Open volgorde bestanden met ApE. Gebruik als referentie een ApE-bestand met de genomische consensussequentie van het Brat -gen dat in een fasta-formaat van flybase is gedownload, of een bestand met resultaten voor sequentie van genetische achtergrondcontrole (bijv. oorspronkelijk gemutageniseerde Drosophila lijn).
    2. Ga naar hulpmiddelenen vervolgens reeksen uitlijnen. Selecteer met de muis van de computer alle reeksen die u wilt vergelijken. Vergeet niet om de referentie reeks aan te geven die voor deze uitlijning wordt gebruikt in het drop-menu.
    3. Inspecteer de gesequentieerde regio voor nucleotide wijzigingen in vergelijking met de referentie volgorde. Sla desgewenst de uitlijning op de computer op in RTF-indeling door op tekstte klikken en vervolgens op Opslaan.
      Opmerking: Als er geen mutaties werden vastgesteld, zou het DNA-sequentie-en analyse protocol worden herhaald met primers die ontworpen zijn om niet-Codeer gebieden van het gen op te nemen.

7. Protocol 6: verdere analyse van de kandidaat-genen functie

  1. Voer reddingsexperimenten uit in neuro blasten om te bepalen of het gen Brat verantwoordelijk is voor het fenotype van de neurodegeneratie.
    1. Dubbele balans een UAS-Brat19 en een neuroblast-specifieke worniu-Gal4 (wor-G4) voorraden met de constructies op het derde chromosoom, evenals de 867 lijn, die is Mutant voor het gen Brat gelegen op de tweede Chromosoom.
      1. Maak drie afzonderlijke kruisen door te plaatsen in drie verschillende voedsel bevattende flesjes 5 mannetjes van UAS-Brat, wor-G4 en 867 lijnen en voeg toe aan elke set van mannetjes 10-15 Virgin vrouwtjes uit een lijn dragende markers en load balancers voor de tweede en derde chromosomen (SP/CyO; Dr/Tm3, SB; BL_59967).
      2. Verzamel 10-15 maagdelijke vrouwtjes uit de F1 van elk kruis met de volgende genotypes: +/Cyo; UAS-Brat/Tm3, SB, +/Cyo; wor-G4/Tm3, SB en 867/Cyo; +/TM3, SB en 5 mannetjes van elk van de volgende genotypes: +/SP; UAS-Brat/Tm3, SB, +/SP; wor-G4/Tm3, SB en 867/Cyo; +/Dr.
      3. Kruis collelcted +/Cyo; UAS-Brat/Tm3, SB Virgin vrouwtjes tot +/SP; UAS-Brat/Tm3, SB mannetjes; Maak in een aparte injectieflacon een tweede Kruis met +/Cyo; wor-G4/Tm3, SB Virgin vrouwtjes tot +/SP; wor-G4/Tm3, SB mannetjes en vervolgens in een derde flacon cross 867/Cyo; +/TM3, SB Virgin vrouwtjes en 867/Cyo; +/Dr mannetjes.
      4. Uit de F1 van elk van deze kruisen, verzamel zowel mannetjes als vrouwtjes van de volgende genotypes: SP/CyO; UAS-Brat/Tm3, SB vanaf het eerste Kruis, SP/Cyo; wor-G4/TM3, SB vanaf het tweede Kruis en 867/Cyo; Dr/Tm3, SB van het tweede Kruis.
      5. Voer een laatste kruising tussen broeders en zusters verzameld van elke F1-nakomelingen om permanente dubbele evenwichtige voorraden voor alle drie de lijnen vast te stellen.
    2. Combineer UAS-Brat en wor-G4 met de 867 -mutatie.
      1. Verzamel voldoende aantal (~ 20-30 vliegen) van maagdelijke vrouwtjes uit de 867/CyO; Dr/Tm3, SB dubbel gebalanceerde kolf voor het uitvoeren van twee kruisen.
      2. Plaats 10-15 Virgin vrouwtjes met ~ 5 mannetjes uit de SP/CyO; UAS-Brat/Tm3, SB (kruis #1) en in een tweede injectieflacon 10-15 Virgin vrouwtjes met ~ 5 SP/Cyo; wor-G4/TM3, SB mannetjes.
      3. Verzamel broeders en zusters uit de F1 van elk kruis met de volgende genotypes: 867/CyO; UAS-Brat/Tm3, SB van kruis #1 en 867/Cyo; wor-G4/TM3, SB van kruis #2. Gebruik verzamelde F1-nakomelingen van elk kruis om permanente voorraden vast te stellen door tussen hen broeders en zusters over te steken.
        Opmerking: Naar aanleiding van deze laatste stap, aandelen voor 867/CyO; UAS-Brat/Tm3, SB en 867/Cyo; wor-G4/Tm3, SB moeten worden gegenereerd.
    3. Voer het Rescue-experiment uit.
      1. Verzamelen ~ 15-20 Virgin vrouwtjes uit de 867/Cyo; wor-G4/Tm3, SB voorraad en kruis ze aan 5-10 mannetjes uit de voorraad 867/Cyo; UAS-Brat/Tm3, SB. Als controle, kruis ~ 15-20 Virgin vrouwtjes uit de 867/Cyo; wor-G4/Tm3, SB en ~ 15-20 Virgin vrouwtjes uit de 867/Cyo; UAS-Brat/Tm3, SB lijn alleen naar de 867/Cyo -lijn.
        Opmerking: 867 vliegen dragen een temperatuurgevoelige allel van Brat en het reddingskruis moet worden uitgevoerd bij 29 °c.
      2. Verzamel de volgende F1-nakomelingen van elk kruis door de gemarkeerde balancers zorgvuldig weg te selecteren: 867/867; wor-G4/UAS-Brat (redding), 867/867; wor-G4/+ (controle) en 867/867; UAS-Brat/+ (besturing).
      3. Leeftijd de vliegen zoals gewenst bij 29 ° c en uitvoeren histologie analyse op hersenen te zoeken naar neurodegeneratie met behulp van het protocol beschreven in sectie 4 (Protocol 3).
  2. Voer een leeftijdsafhankelijke analyse uit van neurodegeneratie in 867 mutanten.
    1. Verzamel 867; pcna-GFP en YW controle vliegen, die een reporter gen (pcna-GFP) dragen en zijn levensvatbaar bij 25 ° c en vertonen zowel hogere penetrantie en hogere expressiviteit van de neurodegeneratie fenotype dan 867 alleen op deze temperatuur17.
    2. Leeftijd de vliegen tot 5, 15 en 25 zoals beschreven in paragraaf 1,4 en het uitvoeren van daaropvolgende histologie analyse door het volgen van het protocol in sectie 4 (Protocol 3).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In deze aerticula presenteren we de stappen die worden gebruikt om de genen hersentumor (Brat) te identificeren als een rol spelen bij het onderhoud van neuronale integriteit (bijv. neuroprotectie) bij volwassen vliegen17; een methodologie die kan worden gebruikt om genen te identificeren die betrokken zijn bij neuroprotectie. We gebruikten een voorwaartse genetische benadering (de strategie wordt geschetst in Figuur 1a

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Voorwaartse genetische schermen in Drosophila zijn een effectieve benadering geweest om genen te identificeren die betrokken zijn bij verschillende biologische processen, waaronder leeftijdsafhankelijke neuro bescherming5,23,24, 25. met behulp van deze strategie, we waren succesvol in het identificeren van Brat als een nieuwe neuroprotectieve gen17.

...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

We zijn vooral dankbaar voor Dr. Barry Ganetzky, in Who 's Lab het genetische scherm werd uitgevoerd, waardoor de identificatie en karakterisering van Brat als een neuroprotectieve gen. We danken Dr. Steven Robinow voor het vriendelijk verstrekken van de verzameling van ENU-gemutageniseerde vliegen gebruikt in het genetische scherm gepresenteerd in dit artikel. Wij danken de leden van Ganetzky Lab, drs. Grace Boekhoff-Falk en David Wassarman voor nuttige besprekingen gedurende de gehele duur van dit project, Ling Ling Ho en Bob Kreber voor technische assistentie, Dr. Aki Ikeda voor het gebruik van zijn microtoom faciliteit aan de University of Wisconsin en Dr. Kim Lackey en de optische analyse faciliteit aan de Universiteit van Alabama.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Belangrijke apparatuur
Afzuigputting voor histologie
LichtmicroscoopNikonEclipe E100Voorkeursobjectief voor beeldvorming is 20x
BeeldvormingssoftwareNikon
MicroscoopcameraNikon
Thermische cyclerEppendorf
Fly pushing en klimtest
VWR® Drosophila-flesje, smalVWR75813-160
VWR® Algemeen laboratorium etiketteertapeVWR89097-912
Standaard muismat
StereoscoopMoticModel SMZ-168
CO2 verdovingsstation (Blowgun, voetklep, Ultimate Flypad)Genesee Scientific54-104, 59-121, 59-172Bevat geen CO2-tank
Fijne penselenSOLO HORTON BRUSHES, INC.
Drosophila incubatorVWR89510-750
Genmapping
CantonSBloomington Drosophila Stock Center9517
w1118Bloomington Drosophila Stock Center5905
yw Bloomington Drosophila Stock Center6599
Drosophila lijn gebruikt voor recombinatiemappingBloomington Drosophila Stock Center3227Genotype: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3
CyO/sno[Sco] Bloomington Drosophila Stock Center2555Drosophila balancerlijn gebruikt voor recombinatiemapping
Deficiëntiekit voor chromosoom 2LBloomington Drosophila Stock CenterDK2LCook et al., 2012
Histologieanalyse
Ethanol, (100%)Thermo Fischer ScientificA4094
ChloroformThermo Fischer ScientificC298-500
Glacial azijnzuurThermo Fischer ScientificA38-500
Fisherbrand™ Premium Microcentrifugebuisjes: 1,5 mLThermo Fischer Scientific05-408-129
Histochoice clearingagent 1xVWR Life Sciences97060-934
Harris HematoxylinenVWR95057-858
EosineVWR95057-848
Thermo Scientific™ Richard-Allan Scientific™ montagemediumThermo Scientific™ 411222-110-610CyO/sna[Sco]
Unifrost Poly-L-Lysine microscoopglazen, 75 mm x 25 mm x 1 mm, EverMark Select PlusAzer Scientific
Fisherbrand™ Dekglazen: RechthoekenFisherbrand12-545MAfmetingen: 24 mm x 60 mm
Traceable timerVWR
DiawarmerBarnstead Internationalmodelnr. 26025
Dialade en -rekkenDWK Life SciencesRek om 20 dia's te houden
Fisherbrand™ Extra lange pincettenFisherbrand10-316A
Kimwipes™Kimberly-Clark™ Professional 
6 inch Puritan applicatorsHardwood Products Company, Guilford, Maine807-12
VWR® ScheermessenVWR55411-050
Tupperware of glazen containers voor histologievloeistoffen16 + 1 voor stromend water
Gestoomde microtomemesjesVWR95057-834
Corning™ Rond ijsemmer met deksel, 4 LCorning™
KolfOf andere container voor ijswater en cassettes
WeefselbadPrecision Scientific Company66630
MicrotoomLeica Biosystems
Moleculair onderzoek
Wizard® SV Gel en PCR Clean-Up SystemPromegaA9282
Ex Taq DNA polymeraseTaKaRa5 U/μl
Invitrogen™ SYBR™ Safe™ DNA Gel Stain  Invitrogen™
UltraPure™ Agarose Invitrogen™
1 Kb Plus DNA Ladder Invitrogen™
ApE-A plasmid Editor softwareBeschikbaar voor gratis download
Statistisch onderzoek
R softwarepakket
Verder onderzoek
y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1]Bloomington Drosophila Stock Center59967

Referenties

  1. Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances. Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).
  2. Aranda-Anzaldo, A. The post-mitotic state in neurons correlates with a stable nuclear higher-order structure. Communicative & Integrative Biology. 5 (2), 134-139 (2012).
  3. Haelterman, N. A., et al. Large-scale identification of chemically induced mutations in Drosophila melanogaster. Genome Res. 24 (10), 1707-1718 (2014).
  4. Moresco, E. M., Li, X., Beutler, B. Going forward with genetics: recent technological advances and forward genetics in mice. The American Journal of Pathology. 182 (5), 1462-1473 (2013).
  5. St Johnston, D. The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3 (3), 176-188 (2002).
  6. Greenspan, R. J. Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Second edition (2004).
  7. Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Research. 11 (6), 1114-1125 (2001).
  8. Rubin, G. M., et al. Comparative genomics of the eukaryotes. Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).
  9. Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
  10. Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
  11. Karres, J. S., Hilgers, V., Carrera, I., Treisman, J., Cohen, S. M. The conserved microRNA miR-8 tunes atrophin levels to prevent neurodegeneration in Drosophila. Cell. 131 (1), 136-145 (2007).
  12. Helfrich, C., Engelmann, W. Circadian-Rhythm of the Locomotor-Activity in Drosophila-Melanogaster and Its Mutants Sine Oculis and Small Optic Lobes. Physiological Entomology. 8 (3), 257-272 (1983).
  13. R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , Foundation for Statistical Computing. (2008).
  14. Bokel, C. EMS screens : from mutagenesis to screening and mapping. Methods in Molecular Bioogyl. 420, 119-138 (2008).
  15. Lindsley, D. L., Zimm, G. G. The Genome of Drosophila Melanogaster. , (1992).
  16. Cook, R. K., et al. The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome. Genome Biology. 13 (3), R21(2012).
  17. Loewen, C., Boekhoff-Falk, G., Ganetzky, B., Chtarbanova, S. A Novel Mutation in Brain Tumor Causes Both Neural Over-Proliferation and Neurodegeneration in Adult Drosophila. Genes Genomes Genetics G3 (Bethesda). 8 (10), 3331-3346 (2018).
  18. Gloor, G. B., et al. Type I repressors of P element mobility. Genetics. 135 (1), 81-95 (1993).
  19. Komori, H., Xiao, Q., McCartney, B. M., Lee, C. Y. Brain tumor specifies intermediate progenitor cell identity by attenuating beta-catenin/Armadillo activity. Development. 141 (1), 51-62 (2014).
  20. Kretzschmar, D., Hasan, G., Sharma, S., Heisenberg, M., Benzer, S. The swiss cheese mutant causes glial hyperwrapping and brain degeneration in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 17 (19), 7425-7432 (1997).
  21. Kang, K. H., Reichert, H. Control of neural stem cell self-renewal and differentiation in Drosophila. Cell and Tissue Research. 359 (1), 33-45 (2015).
  22. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  23. Loewen, C. A., Ganetzky, B. Mito-Nuclear Interactions Affecting Lifespan and Neurodegeneration in a Drosophila Model of Leigh Syndrome. Genetics. 208 (4), 1535-1552 (2018).
  24. Cao, Y., Chtarbanova, S., Petersen, A. J., Ganetzky, B. Dnr1 mutations cause neurodegeneration in Drosophila by activating the innate immune response in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (19), E1752-E1760 (2013).
  25. Lessing, D., Bonini, N. M. Maintaining the brain: insight into human neurodegeneration from Drosophila melanogaster mutants. Nature Reviews Genetics. 10 (6), 359-370 (2009).
  26. Peng, F., et al. Loss of Polo ameliorates APP-induced Alzheimer's disease-like symptoms in Drosophila. Scientific Reports. 5, 16816(2015).
  27. Venken, K. J., Bellen, H. J. Chemical mutagens, transposons, and transgenes to interrogate gene function in Drosophila melanogaster. Methods. 68 (1), 15-28 (2014).
  28. Gonzalez, M. A., et al. Whole Genome Sequencing and a New Bioinformatics Platform Allow for Rapid Gene Identification in D. melanogaster EMS Screens. Biology (Basel). 1 (3), 766-777 (2012).
  29. Palladino, M. J., Hadley, T. J., Ganetzky, B. Temperature-sensitive paralytic mutants are enriched for those causing neurodegeneration in drosophila. Genetics. 161 (3), 1197-1208 (2002).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Klimtesthistologische analysedeficiëntie-mappingDNA-sequencingCarnoy-fixatiefparaffine-inbeddinghematoxylinerkleuring
In vivo genetisch scherm naar voren om nieuwe neuroprotectieve genen in Drosophila melanogaster te identificeren
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.