Generatie van Alfa-Synuclein voorgevormde fibrillen van monomeren en gebruik in vivo

Samenvatting

Het doel van dit artikel is het schetsen van de stappen die nodig zijn voor de generatie van fibrillen van monomeer Alfa-synuclein, latere kwaliteitscontrole, en het gebruik van de voorgevormde fibrillen in vivo.

Samenvatting

Gebruik van de in vivo Alfa-synuclein voorgevormde fibril (α-SYN PFF) model van synucleinopathy is aan populariteit wint onder onderzoekers gericht op de ziekte van Parkinson-model synucleinopathy en nigrostriatal degeneratie. De standaardisering van α-SYN PFF generatie en in vivo toepassing is cruciaal om te zorgen voor een consistente, robuuste α-SYN pathologie. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de generatie van fibrillen van monomeer α-SYN, post-fibrilization kwaliteitscontrole stappen, en voorgestelde parameters voor een succesvolle neurochirurgische injectie van α-SYN PFFs in ratten of muizen. Beginnend met monomeer α-SYN, komt fibrilization over een incubatieperiode van 7 dagen voor terwijl het schudden bij optimale buffer voorwaarden, concentratie, en temperatuur. Post-fibrilization kwaliteitscontrole wordt beoordeeld door de aanwezigheid van pelletable fibrillen via sedimentatie Assay, de vorming van amyloid conformatie in de fibrillen met een thioflavin T Assay, en elektronen microscopische visualisatie van de fibrillen. Overwegende dat een succesvolle validatie met behulp van deze tests is noodzakelijk voor succes, ze zijn niet voldoende om te garanderen PFFs zal zaad α-SYN opneming in neuronen, als zodanig aggregatie activiteit van elke PFF partij moet worden getest in de cel cultuur of in pilot Animal cohorten. Voorafgaand aan het gebruik, PFFs moet worden sonicated onder nauwkeurig gestandaardiseerde omstandigheden, gevolgd door onderzoek met behulp van elektronenmicroscopie of Dynamische lichtverstrooiing te bevestigen fibril lengtes zijn binnen optimale grootte bereik, met een gemiddelde lengte van 50 nm. PFFs kan dan worden toegevoegd aan cel cultuurmedia of gebruikt bij dieren. Pathologie detecteerbaar door immunokleuring voor phosphorylated α-SYN (psyn; serine 129) is duidelijk dagen of weken later in de cel cultuur en knaagdieren modellen, respectievelijk.

Inleiding

De ziekte van Parkinson (PD) wordt voornamelijk gekenmerkt postmortem door twee belangrijke pathologische kenmerken: wijdverbreide en progressieve Alfa-synuclein (α-SYN) pathologie, en nigrostriatal degeneratie. Na injectie in wild type muizen of ratten, α-SYN voorgevormde fibrillen (PFFs) induceren progressieve accumulatie van pathologische α-SYN, die kan resulteren in langdurige degeneratie van Substantia nigra pars Compacta (SNpc) dopamine neuronen in de loop van vele maanden, evenals sensorimotor tekorten^1,2,3,4,5,6. Neuronen worden blootgesteld aan α-SYN fibrillen, hetzij via directe intracerebrale injectie of toegevoegd aan de media van gekweekte neuronen. Wanneer de PFFs worden genomen in de neuronen, de PFFs handeling "zaad" de vorming van inclusies door middel van sjablonen, en accumulatie van endogene α-SYN in phosphorylated inclusies^{1,7,8, 9}. Inclusies delen gelijkaardige eigenschappen aan Lewy organismen: bevattend α-SYN phosphorylated bij serine 129 (pSyn), ubiquitin, en P62; bezitten amyloid quaternaire structuren zoals aangetoond met positieve thioflavin kleuring; en zijn bestand tegen proteïnase K spijsvertering^{1,3,5,7,8,9,10,11, 12}. PFF blootstelling leidt tot α-SYN inclusie vorming in de primaire en sommige vereeuwigd neuronen in de cultuur, evenals muizen, ratten, en niet-menselijke primaten in vivo^{1,2,3,4, 5,6,7,8,9,13}. Het is belangrijk op te merken dat PFFs niet zal leiden tot α-SYN inclusie vorming in alle modellen van de cel cultuur en sommige gekweekte neuronen zal zaad beter dan anderen.

Een ander belangrijk kenmerk van de in vivo α-SYN PFF model is de verschillende sequentiële pathologische fasen die ontstaan over enkele maanden. In knaagdieren, na intrastriatal injectie, α-SYN inclusie vorming pieken in het algemeen binnen de SNpc en vele corticale regio's binnen 1-2 maanden. Deze aggregatie piek wordt gevolgd door nigrostriatal degeneratie ≈ 2-4 maanden later^1,3,5. Deze afzonderlijke pathologische stadia verstrekken onderzoekers het platform waarmee om strategieën te bestuderen en te ontwikkelen die 1) verminderen α-SYN samenvoeging, 2) duidelijke reeds gevormde α-SYN opneming, en/of 3) verhindert verdere neurodegeneratie. De PFF model biedt verschillende voordelen en nadelen ten opzichte van neurotoxiciteit, transgene, en virale vector gemedieerde α-SYN overexpressie modellen zoals eerder beoordeeld⁶. De keuze van welk model of benadering te nemen moet worden bepaald door welk model het beste past bij de vraag van de onderzoekers vragen.

Hoewel het PFF model met succes door vele laboratoria is gebruikt, zijn er nog groepen die inconsistentie met het produceren van fibrillen en het veroorzaken van verenigbare α-SYN pathologie¹⁴hebben ervaren. Voorbeelden van inconsistenties variëren van PFFs die weinig of geen α-SYN pathologie produceren, batch tot batch zaaien efficiëntie, en zelfs het falen van fibrillen te vormen. Aldus, is de normalisatie van α-SYN PFF generatie en in vivo toepassing kritiek om voor nauwkeurige interpretaties betreffende de invloed van nieuwe therapeutische interventies toe te staan. Het volgende protocol schetst de stappen die nodig zijn voor het genereren van PFFs van α-SYN monomeren, de in vitro kwaliteitscontrole van de PFFs eenmaal gevormd, de sonication en meting van PFFs voorafgaand aan het gebruik, en suggesties om succesvol te vergemakkelijken in vivo injectie van PFFs in ratten of muizen.

Protocol

Alle methoden waarbij dieren zijn goedgekeurd door de Michigan State University Institutional Animal zorg and use Comite (DEC).

1. vorming van α-synuclein voorgevormde fibrillen uit monomeren (Figuur 1)

1. Dooi α-synuclein monomeren op ijs, zachtjes onderbreken door flicking de buis, en centrifugeren bij 15.000 x g gedurende 10 min bij 4 ° c.
   Nota: het α-SYN monomeer moet specifiek voor fibrilization worden geformuleerd. Recombinante monomeren kunnen worden gekocht van commerciële bronnen of worden gegenereerd door protocollen op de site^4,9,14,15. Indien gekocht van commerciële bronnen, moet het product vermelden dat het α-SYN monomeer specifiek voor de generatie van fibrillen is. Ongeacht of de monomeren worden gekocht of gegenereerd op de site, de kwaliteitscontrole stappen hieronder beschreven moet worden uitgevoerd met elke partij om ervoor te zorgen fibrillen hebben gevormd en zal efficiënt zaad voorafgaand aan het gebruik in experimenten.
2. Transfer bovendrijvende naar een schone 1,5 mL micro centrifugebuis en noteer het overgedragen bedrag.
   Opmerking: Wees voorzichtig om te voorkomen dat de pellet, die, indien aanwezig, zal klein zijn.
3. Meet de eiwitconcentratie van de overgedragen bovendrijvende door ofwel een standaard bicinchoninic acid assay (), of het meten van de absorptie op 280 nm met een microvolume spectrofotometer.
   Opmerking: de test is niet zo nauwkeurig voor de specifieke meting van α-SYN en kan resultaten opleveren overschatten eiwitconcentratie. Als gevolg daarvan, het meten van de absorptie op 280 nm is de aanbevolen methode voor het bepalen van eiwitconcentratie.
   1. Om met de test te meten, volg standaard de protocollen van het en voer met drie verschillende verdunningen van α-SYN monomeer uit. De voorgestelde verdunningen zijn 1:25, 1:50, en 1:100.
   2. Om te meten met de A280 methode, blanco de lezer met steriele 1x Dulbecco fosfaat gebufferde zoutoplossing (dPBS) zonder calcium en magnesium, met een zoutconcentratie van ongeveer 100 mM NaCl, en pH-bereik 7.0-7.3 (tabel van materialen).
   3. Voeg 2 µ L van het monster aan de lezer en lees de absorptie op 280 nm.
   4. Gebruik de wet bier-Lambert om de concentratie van de monomeren te bepalen.
      
      Opmerking: extinctiecoëfficiënt Epsilon voor menselijke α-SYN is 5.960 M^-1cm^-1 en voor de muis α-SYN is 7.450 M¹cm^-1. Pathlength wordt gemeten in cm. molecuulgewicht van α-SYN (14 kDa) wordt geschat uitgaande van 1 da = 1 g/mol.
4. Verdun de monomeren met 1x dPBS tot een eindconcentratie van 5 mg/mL. Gebruik de onderstaande vergelijking om het bedrag te berekenen van 1x dPBS toegevoegd om de monomeren te verdunnen.
   
   Opmerking: alle concentraties zijn in mg/mL, en volumes in µ L. monomeer verdunningen moeten worden uitgevoerd met 1x dPBS. Het totale volume dat wordt gebruikt om fibrillen te genereren moet tussen 100 en 500 µ L zijn om reproduceerbare fibrilization resultaten te bereiken.
5. Kort Vortex te mengen, en centrifuge om alle vloeistof te verzamelen op de bodem van de buis. Hoeveelheid monomeren voor kwaliteitscontrole vergelijking met fibrillen zoals aangegeven in de stappen 1.8.1-1.8.4.
6. Gebruik een buis vergrendelen of Wax/plastic folie (tabel van materialen) om de micro centrifugebuis deksel gesloten te beveiligen.
7. Plaats de buis in een orbitale Thermo mixer met een deksel voor 7 dagen bij 37 °C, schudden op 1.000 RPM (tafel van materialen).
   Nota: aan het eind van de 7 dagen, zou de inhoud van de buis moeten verschijnen troebel. De Thermo mixer moet een deksel hebben om condensatievorming op de buis deksels te voorkomen.
8. Veeg de buis voorzichtig om de α-SYN fibrillen opnieuw op te schorten. Hoeveelheid fibrillen voor de volgende kwaliteitscontrole stappen zoals aangegeven in de stappen 1.8.1-1.8.4.
   Opmerking: fibrillen voor kwaliteitscontrole stappen kunnen worden opgeslagen op RT 's nachts.
   1. Hoeveelheid 6 µ L voor de sedimentatie assay.
   2. Hoeveelheid 5 µ L voor de thioflavin T-bindende assay.
   3. Hoeveelheid 2 µ L voor de transmissie elektronenmicroscopie voor fibril visualisatie.
   4. Hoeveelheid van ten minste 10 µ L voor de endotoxine assay.
      Nota: voor endotoxine analyse, wordt een commerciële Limulus Amebocyte lysate (LAL) gebruikt, na de instructies van de fabrikant (lijst van materialen). Endotoxine niveaus moeten ≤ 0,5 endotoxine eenheden/mL voor de fibrillen. Een endotoxine Removal Kit kan worden gebruikt als aan dit criterium niet wordt voldaan.
9. De resterende fibrillen en op te slaan. Voor opslag op lange termijn (12-18 maanden), bevriezen snel op droog ijs, en opslag bij-80 °C.
   Opmerking: het bedrag van de hoeveelheid is afhankelijk van de gewenste downstream-toepassing. In vivo vereist het gebruik doorgaans meer fibrillen bij hogere concentraties dan in vitro gebruik, en moeten de hoeveelheids volumes dienovereenkomstig worden gepland. Fibrillen moet worden opgeslagen naar de achterkant van de vriezer om schade te voorkomen van mogelijke bevriezing/ontdooien. Het protocol kan hier worden onderbroken.

2. sedimentatie assay

1. In een schone micro centrifugebuis, voeg 6 µ L van PFF tot 54 µ L van dPBS te verdunnen fibrillen 1:10, en pipet te mengen.
   1. Voeg in een aparte buis 6 µ L van monomeer toe aan 54 µ L van dPBS als extra controle.
2. Centrifugeer monsters op 10.000 x g gedurende 30 min bij RT en breng de bovendrijvende over naar een schone micro centrifugebuis.
3. Voeg 60 µ L van dPBS toe aan de resterende pellet en Vortex om opnieuw op te schorten.
4. Voeg 30 µ L van 3x steekproef buffer (140 µ L van 50% glycerol/0.1% bromophenol blauw, 40 µ L van 10% SDS, en 20 µ L van β-mercaptoethanol) aan elke buis toe en Vortex om te mengen.
5. Incubeer monsters bij 100 °C voor 10 min en laat afkoelen voor 5 min op ijs.
6. Gebruik een standaard natrium dodecyl sulfaat-Polyacrylamide gel elektroforese (SDS-pagina) protocol om eiwit te scheiden door massa. Gebruik een eiwit ladder met een bereik dat 14 kDa (de grootte band verwacht voor monomeer α-SYN) omvat.
7. Breng de gel in een kleur schaal en bedek de gel met Coomassie blauwe vlek (0,1% Coomassie briljant blauw, 20% methanol door volume, en 10% azijnzuur door volume in ddH₂O). Incubeer voor 3 uur bij RT tijdens het schudden.
8. Giet de Coomassie blauwe vlek uit en voeg genoeg devlek (50% methanol door volume, en 10% azijnzuur door volume in ddH₂O) toe om het gel te behandelen. Incubeer gedurende 30 min bij RT tijdens het schudden.
9. Giet af en herhaal de devlek stap totdat de gel is duidelijk en bands zijn zichtbaar.
10. Was de gel 3 keer voor 5 min elk door te schudden in ddH₂O en het imago van de gel.

3. transmissie elektronenmicroscopie voor fibril visualisatie

1. Weeg 20 mg uranyl acetaat in een micro centrifugebuis en voeg 1 mL ddH₂O toe om een 2% waterige oplossing te maken. Vortex tot de uranyl acetaat is in oplossing, en laat om te zitten 's nachts.
   Opmerking: uranyl acetaat moet worden gemaakt van de dag vóór de voorbereiding van monsters voor transmissie elektronenmicroscopie. Blootstelling aan licht of agitatie kan leiden tot de uranyl acetaat te neerslaan, als zodanig, de buis met de uranyl acetaat oplossing moet worden gedekt in aluminiumfolie, bewaard in een donkere plaats, en niet geschud na de uranyl acetaat is in oplossing.
2. Voeg 2 µ L van PFF toe aan 98 µ L van dPBS om fibrillen 1:50 te verdunnen, en dan pipet om te mengen.
3. Bereid een schone Wax/plastic folie (tafel van materialen) bedekt oppervlak (ongeveer 50 mm x 50 mm) op de Bank top. Op de schone Wax/plastic folie (tabel van materialen), voeg de volgende (Figuur 2).
   1. Voeg 4 x 10 µ L druppels ddH₂O toe.
   2. Voeg 1 x 10 µ L druppel verdunde fibrillen of monomeer monster toe.
   3. Voeg 2 x 10 µ L druppels van 2% uranyl acetaat.
4. Gebruik fijn-getipt Tang te halen een formvar/Carbon coating, mesh koperen transmissie elektronenmicroscopie grid (tabel van materialen).
   Opmerking: Zorg ervoor dat u alleen het raster bij de rand opneemt en het netgedeelte in het midden vermijdt (Figuur 2a). Als de Tang raak de mesh, de formvar/Carbon coating film zal worden beschadigd, waardoor beeldvorming in dat gebied van het rooster onmogelijk.
5. Float de grid formvar/Carbon coating kant (glanzende kant) naar beneden op de eerste druppel van ddH₂o. voorzichtig gebruik maken van de tang om het rooster te houden en duw naar beneden om ervoor te zorgen het gehele gecoate oppervlak is in contact met de ddH₂o. Laat het rooster 1 minuut zweven.
6. Pick-up het rooster, en zonder het aanraken van de mesh gedeelte van het net, Wick weg de ddH₂O met filtreerpapier.
7. Float het net als hierboven op de tweede druppel van ddH₂o voor 1 min en Wick weg de ddH₂o.
8. Float het raster op de daling van verdunde fibrillen voor 1 min en Wick weg de overmaat als hierboven.
9. Float het raster op de eerste druppel uranyl acetaat voor 1 min en Wick weg de overmaat.
10. Float het raster op de tweede druppel uranyl acetaat voor 1 min, Wick weg de overmaat.
11. Float het net als hierboven op de derde druppel van ddH₂o kort en Wick weg de ddH₂o.
12. Float het net als hierboven op de vierde druppel van ddH₂o kort en Wick weg de ddH₂o, die zeker te verwijderen zo veel ddH₂o mogelijk.
13. Transfer naar een grid box voor opslag tot Imaging.
    Opmerking: roosters moeten minstens 5 minuten drogen voorbeeld vorming. Grids kunnen worden afgebeeld voor ten minste een jaar na de voorbereiding en moet worden bewaard in een droge omgeving.

4. Thioflavin T assay

1. In een schone micro centrifugebuis, voeg 5 µ L van PFF tot 245 µ L van dPBS te verdunnen fibrillen 1:50, en pipet te mengen.
2. Voeg 250 µ L van dPBS om een aparte micro centrifugebuis om te dienen als een negatieve controle.
3. Voeg 5 µ L van monomeer toe aan 245 µ L van dPBS om als monomeer controle te dienen.
4. Voeg 250 µ L van thioflavin T in Glycine buffer (25 µ M thioflavin T, 100 mM Glycine, 1% Triton X-100, pH 8,5) aan elk monster en zachtjes mengen.
5. Pipet 2 repliceert, 200 µ L elk, in een zwarte 96 goed plaat. Houd plaat in het donker om te voorkomen dat fotobleken.
6. Incubeer voor 1 h bij RT en lees de plaat met behulp van een excitatie van 450 nm en de uitstoot van 510 Nm.
   Opmerking: Thioflavin T lezingen zullen fluctueren in de tijd. Monsters moeten worden gelezen op dezelfde incubatietijd. Indien gewenst, kunnen meerdere lezingen worden genomen tijdens het uur incubatie en uitgezet in de tijd.

5. sonication van α-synuclein voorgevormde fibrillen

Let op: de geen ultrasoonapparaat en alle sonication stappen worden uitgevoerd in een kweek kap om blootstelling aan fibrillen die kunnen aerosolize tijdens sonication te voorkomen. Het personeel het uitvoeren van de sonication stappen moeten dragen persoonlijke beschermingsmiddelen, met inbegrip van handschoenen, kleding bescherming in de vorm van een lab jas, en een gezicht schild, terwijl sonicating. Risico van fibril blootstelling kan worden verminderd door sonicating met een beker hoorn geen ultrasoonapparaat, waardoor de buis met fibrillen te blijven gesloten tijdens sonication.

Nota: de optimale sonische parameters van fibrillen zijn afhankelijk van het gebruikte model van geen ultrasoonapparaat. Om deze reden, zal sommige optimalisering moeten worden uitgevoerd om ervoor te zorgen fibrillen de correcte grootte zijn. De geen ultrasoonapparaat gebruikt kan worden gevonden in de tabel van materialen en de parameters geschetst zijn gebaseerd op eerdere resultaten met dit model van geen ultrasoonapparaat. De parameters hieronder zal werken voor 2-4 µ g/µ L van PFFs in 200-400 µ L van de oplossing. Test sonication met het instrument moet worden uitgevoerd en fibrillen geanalyseerd om ervoor te zorgen gewenste resultaten worden bereikt voorafgaand aan het gebruik van PFFs in experimenten.

1. Bevestig een 3,2 mm diameter sonde (tabel van materialen) aan de convertor, en stel de geen ultrasoonapparaat parameters zoals hieronder vermeld in stap 5.1.1-5.1.3.
   1. Stel de amplitude in op 30%.
   2. Zet de puls op 01 01 (1 s op; 1 s uit).
   3. Stel de tijd in op 0:01:00.
      Nota: 1 min van het pulseren vergelijkt aan 60 impulsen, en dit model van geen ultrasoonapparaat (lijst van materialen) zal automatisch ophouden. Met andere geen ultrasoonapparaat modellen, zal het aantal pulsen moeten worden geteld.
2. Dooi fibrillen bij RT en Verdun met steriele dPBS in een kweek kap.
   Opmerking: een duidelijke 0,6 mL micro centrifugebuis werkt het beste voor sonication en de uiteindelijke fibril concentratie is afhankelijk van het beoogde gebruik. Getoonde representatieve resultaten zijn van een definitieve fibril concentratie van 4 µ g/µ L.
3. Veeg de sonde van de geen ultrasoonapparaat met een Lab weefsel bevochtigd met 70% ethanol om de sonde te reinigen. Dompel de punt van de sonde in ddH₂O en puls 10 keer om verder te reinigen van de sonde, en veeg droog met een Lab weefsel.
4. Plaats de sonde tip in de buis van verdunde fibrillen, en de positie van de tip aan de onderkant van de buis.
5. Bewerk voor 60 pulsen (1 s op; 1 s uit). Verplaats de sonde op en neer tijdens elke puls om ervoor te zorgen alle fibrillen in de vloeistof zijn sonicated. en schoon.
6. Verwijder na 60 pulsen de sonde uit de PFFs en voeg 2 µ L van PFF toe aan 98 µ L van dPBS in een schone micro centrifugebuis om fibrillen 1:50 te verdunnen voor sonicated fibril meting door elektronenmicroscopie.
   Opmerking: Idealiter moet een kleine subset van fibrillen worden gemeten voorafgaand aan in vivo injectie en een meer uitgebreide meting van fibrillen uitgevoerd wanneer de tijd het toelaat.
7. Na sonication, centrifugeer kort PFFs voor 1 s bij 2.000 x g om al vloeistof van de kanten van de buis te verzamelen.
   Let op: als de buis wordt warm om aan te raken, stop sonicating na 30 pulsen, wacht 1 min, en bewerk voor de laatste 30 pulsen.
   Opmerking: terwijl sonicating, houd de sonde tip naar de onderkant van de vloeistof aan het begin van elke puls, te dicht bij de bovenkant van de vloeistof zal leiden tot monster verlies.
8. Dompel de sonde tip in 1% SDS en puls 10 keer om de sonde te reinigen. Verwijder het uiteinde van SDS, dompel in ddH₂O en impuls 10 keer onder.
9. Veeg de sonde met een Lab weefsel bevochtigd met 70% ethanol, en veeg de sonde met een droge Lab weefsel. Maak de sonde los van de converter en op te slaan.
10. Veeg alle oppervlakken in de kap met 1% SDS, gevolgd door 70% ethanol.
    Nota: de 1% SDS-oplossing wordt gebruikt om fibrillen en schone oppervlakten en materiaal te scheiden¹⁶.

6. transmissie elektronenmicroscopie voor de meting van sonicated fibrillen

Opmerking: als elektronenmicroscopie niet haalbaar is, kan een thioflavin T kinetiek Assay, en dynamische lichtverstrooiing worden gebruikt als indirecte maatregelen van zaaien efficiëntie en fibril maat^4,14.

1. Bereid monsters met behulp van het Protocol van de "elektronenmicroscopie voor fibril visualisatie" sectie hierboven.
2. Gebruik een transmissie elektronenmicroscoop om een beeld van fibrillen van 6 tot 10 verschillende rooster openingen te nemen.
   Nota: de beelden zouden een hoog genoeg vergroting moeten zijn om fibrillen te meten, maar laag genoeg om veelvoudige fibrillen gelijktijdig te visualiseren. Een laatste vergroting van ongeveer 75 x zou voldoende moeten zijn.
3. Meet de lengte van een kleine subset van ten minste 25 fibrillen voorafgaand aan het gebruik van fibrillen in een experiment.
   Opmerking: deze metingen kunnen meestal worden uitgevoerd met behulp van de imaging software in verband met de Microscoop. Voor de snelle validatie moet de persoon die meet representatieve fibrillen selecteren en de gemiddelde grootte berekenen. Fibril lengte moet gemiddeld ongeveer 50 nm of minder, met een meer accurate meting te volgen.
4. Meet de lengtes van 500 + fibrillen voor meer uitvoerige resultaten.
   Opmerking: de imaging software geassocieerd met de microscoop kan worden gebruikt voor fibril metingen. Alternatief, kunnen de beelden worden geopend en fibrillen gemeten met de software van de beeldverwerking, gebruikend de schaal staaf verbonden aan elk beeld als verwijzing van de grootte waarmee de fibril lengten te vergelijken.

7. bereiding van aangepaste glas naald spuiten voor stereotactische injecties (Figuur 3)

1. Voeg ongeveer 10 mL siliconizing reagens (materiaallijst) toe aan een schoon bekerglas van 50 ml.
2. Plaats glazen capillaire buizen (lengte van 54 mm; buitendiameter: 0,86 mm; binnendiameter 0,59 mm) verticaal in het bekerglas van siliconizing reagens en laat capillaire actie om de siliconizing reagens te trekken van de buis door de onderste buis opening ondergedompeld in de siliconizing reagens.
3. Pipet extra siliconizing reagens in de bovenste buis opening die niet is ondergedompeld in siliconizing reagens volledig vullen het glas capillaire buis.
4. Verwijder de capillaire buizen van de siliconizing reagens en DEP de open uiteinden van de buizen op een papieren handdoek om siliconizing reagens te verwijderen in de buizen. Laat capillaire buizen te drogen gedurende ten minste 8 uur.
5. Plaats een silicium glas capillaire buis in een glazen naald trekker (tabel van materialen).
6. Zet het verwarmingselement aan en laat de bijgevoegde gewichten de verwarmde glazen capillaire buis uitrekken.
7. Snijd de getrokken glazen capillaire buis met een schaar op het dunste punt in het midden en verwijder de glas naald uit de glazen naald trekker.
   Opmerking: de getrokken naald binnenste en buitenste diameter moet ongeveer 80 en 100 µm, respectievelijk. Meerdere glas naalden kunnen worden gemaakt in een keer en opgeslagen tot klaar om te hechten aan een glazen spuit met bijgevoegde metalen naald (tabel van materialen).
8. Snijd een lengte van krimp-wrap slang (gemiddelde binnendiameter 0,021 "en de gemiddelde wanddikte 0,001") tot ongeveer 40 mm met een schaar. Schuif de shrink wrap over de metalen naald van een 10 µ L afgeschuinde spuit (tabel van materialen).
9. Gebruik een open vlam te verwarmen en hechten de krimp wrap op de naald tijdens het draaien van de naald om warmte gelijkmatig toe te passen.
10. Schuif het grotere uiteinde van de getrokken glas naald voorzichtig over de metalen naald van de spuit.
11. Snijd een lengte van krimp-wrap slang (gemiddelde binnendiameter 0,036 "en de gemiddelde wanddikte 0,005") tot ongeveer 40 mm met een schaar en voorzichtig glijden over glas naald te overlappen de basis van de glazen naald en de metalen naald van de spuit (tabel van Materialen). Gebruik een open vlam om de krimpfolie te verwarmen om de glas naald op de metalen naald te beveiligen.
12. Voeg een extra laag van shrink-wrap om de glazen naald te beveiligen. Snijd een lengte van krimp-wrap slang (gemiddelde binnendiameter 0,044 "en de gemiddelde wanddikte 0,005") tot ongeveer 40 mm met een schaar en voorzichtig glijden over glas naald te overlappen de basis van de glazen naald en de metalen naald van de spuit (tabel van Materialen). Gebruik een open vlam om de krimpfolie te verwarmen om de glas naald op de metalen naald te beveiligen.
13. Trim de glazen naald met een schaar, zodat de tip is ongeveer 8 mm lang.
    Nota: de naald moet lang genoeg zijn om de gewenste hersenengebieden te richten (de vereiste lengte is afhankelijk van de dorsale/buik coördinaten).
14. Gebruik stappen 7.14.1-7.14.3 om te testen de naald te verzekeren zijn er geen lekken en er is voldoende stroom, zowel in het terugtrekken en doseren vloeistof uit de glazen naald.
    1. Vul een 1 mL spuit met een bijgevoegde 26 gauge naald met dH₂O.
    2. Verwijder de metalen plunjer van de Custom Glass naald spuit en steek de naald van de dH₂O gevulde spuit in de basis van de spuit. Druk toe om dH₂O van de glas naald te doseren. Inspecteer de interface van de glas naald en de metalen naald voor lekkage en bevestig een gestage dH₂O stroom.
       Nota: indien nodig, kan de glas naald worden bijgesneden om het gemak van stroom en extra lagen van krimp-omslag te verhogen die aan flard om het even welke lekken van de basis van de glas naald wordt toegevoegd.
    3. Vul een micro centrifugebuis met dH₂o. Gebruik de aangepaste glas naald spuit te trekken in de DH₂o. Inspecteer de naald om de vloeistof te bevestigen wordt genomen in de spuit en dat er geen bubbels.
       Opmerking: als er bubbels of dH₂O niet wordt getrokken in de naald, trimmen van de naald kan helpen verlichten de druk.
15. Zorgvuldig op te slaan spuit met bijgevoegde glas naalden in de spuit dozen totdat die nodig zijn voor operaties.
16. Gebruik standaard stereotaxische chirurgie methoden voor intrastriatal levering van PFFs bij geoptimaliseerde coördinaten in muizen (een site: AP + 0,2 mm en ML + 2,0 mm van bregma, DV-2,6 mm van Dura) of bij ratten (twee plaatsen: AP + 1,6 mm en ML + 2,0 mm van bregma, DV-4,0 van Dura; AP + 0,1 mm en ml + 4,2 mm van bregma, DV-5,0 van Dura)^1,14,17.
    Opmerking: deze coördinaten zijn gebruikt in C57BL6/C3H muizen en Fischer 344 ratten. Bij het gebruik van andere stammen, moeten de coördinaten worden geoptimaliseerd.

Resultaten

De generatie van fibrillen van α-SYN monomeren begint met het bepalen van de concentratie van de monomeren. Zowel de test van de A280 als de meting van de absorptie op 280 nm kan gebruikt worden om het eiwitgehalte te meten; de resultaten van de test, echter, suggereerden een hogere concentratie dan de A280 methode. PFFs afgeleid van muis α-SYN monomeer had een waarde van 14,05 ± 0,22 en een A280 van 8,05 ± 0,03 µ g/µ L (Figuur 1). Evenzo bleek PFFs afgeleid van humaan α-SYN monomeer ook bij een hogere concentratie, met een waarde van 12,95 ± 0,38 en een A280 van 7,83 ± 0,05 µ g/µ L (Figuur 1). De A280 metingen zijn specifiek voor α-SYN op basis van de opneming van de extinctie coëfficiënten en deze resultaten werden gebruikt om de monomeren te verdunnen vóór 7-daagse incubatie.

Voorafgaand aan de incubatie was de vloeistof met de α-SYN monomeren duidelijk, maar moet troebel na fibril vorming verschijnen. Onderzoek met transmissie elektronenmicroscopie bevestigde de aanwezigheid van lange fibrillen, metend 10-20 nm breed (Figuur 4). Ter vergelijking, α-SYN monomeren waren nauwelijks zichtbaar zonder waarneembare vorm zichtbaar (Figuur 4). Met visuele bevestiging van fibrillair structuren, amyloid conformatie van de fibrillen is het volgende kenmerk van PFFs dat moet bevestigd met behulp van een thioflavin T assay. Thioflavin T vertoont versterkte fluorescentie bij het binden aan amyloid; aldus, wijst het verhoogde fluorescente signaal van de steekproeven op aanwezigheid van amyloid. Als voorbeeld, thioflavin in dPBS produceerde een signaal van 3.287 ± 580 relatieve fluorescente eenheden (RFU), muis α-SYN monomeer produceerde een signaal van 4.174 ± 158 RFU, en de muis PFFs produceerde een signaal van 59.754 ± 6.224 RFU (Figuur 5). In vergelijking, produceerde het menselijke α-SYN monomeer een gelijkaardig signaal van 4.158 ± 105 RFU aan het monomeer van de muis, en het menselijke PFFs veroorzaakte een hoger signaal van 1.235.967 ± 113.747 RFU in vergelijking tot muis PFFs (Figuur 5). Om de aanwezigheid van pelletable fibrillen te beoordelen, werd een sedimentatie assay uitgevoerd. Fibrillen zal pellet met centrifugeren. In zowel de muis en de menselijke PFF monsters, moet de bovendrijvende fractie hebben meer eiwitten in de pellet dan de bovendrijvende (Figuur 6). In tegenstelling, de meerderheid van het eiwit van de muis en de menselijke monomeren was aanwezig in de bovendrijvende, met weinig aanwezig in de pellet (Figuur 6). Met de PFFs zichtbaar aanwezig door elektronenmicroscopie, amyloid structuren aanwezig, en fibrillen pelletable, de PFFs geslaagd alle in vitro kwaliteitscontrole stappen.

Zowel werden de muis als de menselijke PFFs sonicated om PFFs van aangewezen lengten te veroorzaken voor het zaaien van α-SYN opneming^4,18. PFFs werden verdund tot de gewenste concentratie van 4 µ g/µ L en sonicated. Onmiddellijk voorafgaand aan de operatie, werden 25 representatieve fibrillen afgebeeld door elektronenmicroscopie en gemeten aan vlek controle de fibril grootte. De sonicated muis PFFs gemeten 48,8 ± 3,1 nm, terwijl de menselijke PFFs gemeten 52,1 ± 4,4 nm in lengte; PFFs van beide soorten waren daarom de aangewezen lengte (50 nm of minder) om het zaaien activiteit te veroorzaken. Het uitvoerigere onderzoek van ongeveer 500 fibrillen openbaarde de gemiddelde lengte en de lengte distributie van sonicated muis fibrillen. De gemiddelde lengte was 44,4 ± 0,6 nm, met 86,6% van het PFFs meten van 60 Nm of minder (Figuur 4). In vergelijking, menselijke PFFs gemiddeld 55,9 ± 1,1 nm met 69,6% van PFFs het meten van 60 Nm of minder (Figuur 4).

Na intrastriatal injectie van sonicated muis PFFs in ratten zoals eerder beschreven^3,5, een reeks van weefselsecties werden verwerkt op 2 maanden na de operatie, wanneer het aantal van de opneming met neuronen is bekend dat piek in de SNpc, voor de bevestiging van phosphorylated α-SYN inclusies⁵. Inclusie dragende neuronen, zoals aangegeven door immunohistochemische kleuring voor pSyn (antilichaam in de tabel van materialen) aanwezig zijn binnen de SNpc (Figuur 7), evenals andere regio's in de hersenen die innervate de striatum (anterior reuk kern, motor, cingulate, Piriform, prelimbisch, somatosensorische, entorhinale, en insulaire cortices, amygdala, striatum)^1,3,4,5,19. Deze inclusies delen gelijkaardige eigenschappen met Lewy organismen, zoals bindende thioflavin S, en weerstand van totale α-SYN aan proteïnase K (Figuur 7), zoals aangetoond door immunohistochemische kleuring (antilichaam en proteïnase K in lijst van materialen) . Bevestiging van zaaien in de hersenen geeft aan de in vivo kwaliteitscontrole is doorgegeven, en de hoeveelheid PFFs eerder bevroren en opgeslagen uit dezelfde partij kan worden sonicated onder identieke parameters, met lengtes gevalideerd, in grotere experimenten.

Figuur 1 . Methodes voor de generatie van α-SYN fibrillen. Schets van de stappen die nodig zijn om fibrillen te produceren van α-SYN monomeren. Monomeren worden gedurende 10 min (15.000 x g, bij 4 °c) gecentrifugeeerd. Bovendrijvende wordt overgebracht naar een schone buis en de eiwitconcentratie wordt bepaald door of de absorptie bij 280 nm, of een test van het doel van het. Grafiek toont de concentraties van mens en muis α-SYN monomeren. Kolommen geven de groep betekent, foutbalken vertegenwoordigen ± 1 standaardfout van het gemiddelde. Na eiwitconcentratie wordt bepaald, α-SYN monomeren worden verdund, kort gewerveld en uitgebroed voor 37 ° c gedurende 7 dagen, terwijl schudden op een orbitale mixer ingesteld op 1.000 RPM. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2 . Kleuring methoden voor transmissie elektronenmicroscopie. Diagram van negatieve kleuring voor elektronenmicroscopie. A) beelden die de elektronen microscopisch specimen rasters afbeelden. Het rooster heeft een doffe of lichte kant en een glanzende of donkere kant. De glanzende/donkere kant is bekleed met een formvar/Carbon ondersteuning film. B) illustratie van de kleuring procedure. De grid is zwevend glanzend/donkere kant naar beneden op de eerste druppel van ddH₂O voor 1 min en de overmaat is Wicked weg met filtreerpapier. Het proces wordt herhaald met de tweede druppel van ddH₂o, verdunde PFFs of monomeren, twee druppels uranyl acetaat, en twee extra druppels ddH₂o. grids kunnen worden opgeslagen in een raster vak totdat het beeld. Schaalbalk = 3 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3 . Montage van aangepaste glas naald spuiten. Schema van de stappen die nodig zijn om glas naald bijgevoegde spuiten monteren. Siliconen glas capillaire buizen worden getrokken en in het midden gesneden om glas naalden te produceren. Shrink wrap slang wordt gebruikt om de metalen naald voor te bereiden en vormen een innerlijke afdichting wanneer de glazen naald wordt geschoven op de metalen naald. Twee extra lagen van krimp-wrap slang die overlapping van de basis van de glazen naald en de metalen naald worden achtereenvolgens toegevoegd en warmte toegepast op de glazen naald veilig en vormen een waterdichte afdichting. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4 . Visualisatie van α-SYN monomeren en α-SYN fibrillen via transmissie elektronenmicroscopie. Representatieve handtekeningen van α-SYN monomeren en fibrillen. Top panelen: muis en menselijke α-SYN monomeer. Middelste panelen: volledige lengte muis en menselijke α-SYN PFFs. onderste panelen: muis en menselijke α-SYN PFFs na sonication. Onderste grafiek: distributie van sonicated muis en menselijke α-SYN PFF lengtes. Schaalbalk = 500 nm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5 . Bevestiging van amyloid structuren door thioflavin T assay. Meting van fluorescent signaal van muis en menselijk α-SYN monomeer en PFF steekproeven. Links: resultaten van de muis α-SYN monomeren en α-SYN PFFs. Rechts: resultaten van menselijke α-SYN monomeren en α-SYN PFFs. In elke grafiek wordt een dPBS negatief besturingselement weergegeven. Alle metingen worden uitgedrukt als relatieve fluorescentie-eenheden (RFU). Kolommen geven de groep betekent, foutbalken vertegenwoordigen ± 1 standaardfout van het gemiddelde. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 6 . Sedimentatie assay voor pelletable α-SYN. beelden van Coomassie gekleurd gels. Getoonde bands zijn op ongeveer 14 kDa gebaseerd op de eiwit ladder. Links: muis monomeer en PFFs. Rechts: menselijke monomeren en PFFs. Voor alle monomeer-en PFF monsters worden de opnieuw gesuspendeerde pellet (P) en bovendrijvende (S) weergegeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 7 . Eigenschappen van opneming in het Rat model dat α-SYN pathologie bevestigt. Representatieve handtekeningen van de Substantia nigra pars Compacta op 2 maanden na de injectie. Links: neuronen met pSyn en counterstained met cresyl Violet. Midden: Thioflavin S positieve neuronen. Rechts: α-SYN-bevattende inclusies bestand tegen proteïnase K. scale Bar = 50 µm. gelieve Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussie

De productie van α-SYN PFFs geschikt voor het zaaien van neuronen en leidt tot Lewy lichaam-achtige inclusies is afhankelijk van meerdere factoren en stappen. Een kritieke factor is dat de monomeren die voor het produceren van fibrillen worden gebruikt specifiek voor fibrilization⁴,^9,14,15moeten worden geformuleerd. Als de monomeren niet voor fibrilization worden geformuleerd, kan fibrillen niet vormen of fibrillen die doen de vorm kan geen α-SYN pathologie veroorzaken. Evenzo, de buffer die de monomeren zijn in ook invloed fibrilization. Als dusdanig, voor de beste resultaten, zou de zoute concentratie ongeveer 100 mM NaCl en pH tussen 7,0 en 7,3 moeten zijn. Een eerste stap die veranderlijkheid introduceert is de methode waarbij het aanvankelijke eiwitgehalte wordt bepaald, met meting bij A280 waarschijnlijk om nauwkeurigere resultaten te veroorzaken en daarom de aangewezen methode is. De discrepantie in eiwitconcentratie kan de doeltreffendheid van het fibrilization proces verminderen evenals de veronderstelde PFF concentratie veranderen die in experimenten wordt gebruikt. Beide kunnen leiden tot een afname van het zaaien efficiëntie en batch variatie tussen experimenten.

Initiële kwaliteitscontrole stappen zullen bevestigen kritieke kenmerken van de PFFs, in het bijzonder dat zij een vezelachtig conformatie (elektronenmicroscopie), bevatten amyloid structuren (thioflavin T assay), en zijn pelletable (sedimentatie assay). Het is belangrijk op te merken dat de resultaten van de thioflavin T-assay zal fluctueren met de tijd en zijn niet een directe maatregel van de hoeveelheid amyloid structuren aanwezig zijn, in plaats van, de thioflavin T-assay mag alleen worden gebruikt als een indicator van amyloid structuren aanwezigheid binnen het monster. Thioflavin T wordt typisch gebruikt in in-vitro assays, zoals de bovengenoemde assay om de fibrillen bevatten amyloid structuren te tonen. Alternatief, thioflavin S wordt gebruikt in weefsel op te sporen amyloid structuren, zoals weergegeven in Figuur 7. Met betrekking tot de sedimentatie Assay, de resultaten blijkt alleen dat de PFFs zijn voornamelijk gevonden in de pellet bare Fractie. Als de monsters worden uitgevoerd in denaturerende omstandigheden, een enkele prominente band van ongeveer 14 kDa, de grootte van α-SYN monomeren, is aanwezig op de gels. Dit is in tegenstelling tot de veelvoudige banden huidig bij hogere moleculaire gewichten die met PFFs zouden worden verwacht als een inheems of niet-denaturerende gel werd gebruikt. Ten slotte is het succesvol passeren van al deze initiële kwaliteitscontrole stappen niet garanderen α-SYN inclusie zaaien activiteit. Om deze reden, moeten de de cultuur experimenten van de cel of een kleine cohort van chirurgisch-ingespoten dieren worden gebruikt om de doeltreffendheid van de PFFs vóór gebruik in grotere experimenten te testen.

Sonication is een cruciale stap in het proces en parameters zullen verschillen, afhankelijk van het model van geen ultrasoonapparaat gebruikt. Sonication parameters moeten worden toegepast en geverifieerd om aan te tonen dat korte PFF fragmenten zijn geproduceerd. Fibril grootte heeft invloed op het zaaien, met kortere fibrillen zaaien efficiënter. Hoewel kortere fibrillen zaad efficiënter, dit effect plateaus en de optimale pff lengte is ongeveer 50 nm^4,18. Het is ook belangrijk om de steekproeven niet te bewerk en de PFFs aan bovenmatige hitte bloot te stellen, aangezien dit het zaaien efficiency kan verminderen. Deze sonicated PFFs moeten worden getest op de werkzaamheid in de kleine cel cultuur of in vivo experimenten voorafgaand aan het gebruik in grotere schaal experimenten. Aangezien de verschillende sonische zittingen het potentieel hebben om veranderlijkheid te introduceren, zouden de experimentele behandelingsgroepen moeten dienovereenkomstig worden gepland.

Bij het leveren van PFFs in vivo, de lokalisatie van de injectie site (s) en het totale bedrag PFFs gebruikt kan invloed hebben op het aantal neuronen dat zal de ontwikkeling van inclusies, alsmede de omvang van neurodegeneratie^7,14. De coördinaten in het Protocol bieden een plaats om te beginnen, maar moeten worden getest in het lab om ervoor te zorgen de gewenste doelregio ontwikkelt α-SYN pathologie voorafgaand aan het gebruik in grootschalige experimenten. Indien gewenst, kan het volgen van kleurstof of fluorescente parels als manier worden gebruikt om het regionale richten te testen alvorens PFFs te gebruiken. De hoeveelheid PFFs die in vivo wordt gebruikt varieert tussen groepen, waarbij de meeste groepen met een totaal tussen 5 en 20 µ g PFFs bij één of verdeeld tussen twee injectieplaatsen^{1,2,3,4,5 , 6 , 7 , 14}. aangezien het aantal injectieplaatsen, plaats van injectieplaatsen, en hoeveelheid PFFs ingespoten resultaten en vooruitgang van de synucleinopathy kan beïnvloeden, zouden de stroomafwaartse uitkomsten van de gebruikte parameters voorafgaand aan het gebruiken van het model moeten worden gekenmerkt om test potentiële interventies of het onderzoeken van temporele kenmerken van het model.

Bij het selecteren van een model te gebruiken voor het testen van therapeutische of het bestuderen van progressie van de ziekte, moet het gebruikte model worden geselecteerd om het beste antwoord op de vraag gesteld. Niet alle modellen zullen beschikken over bepaalde ziekte kenmerken van PD, of bieden het tijdschema nodig om potentiële interventies te testen. De PFF model recapituleert belangrijkste kenmerken van PD, zoals α-SYN pathologie en neurodegeneratie, en kan leiden tot een bescheiden motorische beperkingen. Het model biedt een voorspelbare en langdurige tijd-cursus, waar inclusies vorm maanden vóór neurodegeneratie. Hierdoor kunnen onderzoekers de verschillende fasen onderzoeken en exploiteren gedurende de langdurige progressie van de synucleinopathy. De huidige en toekomstige gebruik van het model in het algemeen zal naar verwachting gunstig zijn in de studie van de progressie van de ziekte en de ontwikkeling van nieuwe therapieën.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1x Dulbecco’s phosphate buffered saline	Thermo Fisher (Gibco)	14190144
Anti-alpha-synuclein (gefosforyleerd op serine 129) antilichaam	Abcam	AB184674
Anti-alpha-synuclein antilichaam	Abcam	AB15530
Bicinchoonzuur	Thermo Fisher (Pierce)	PI23228
Doorzichtige medische krimpslang (0,036" binnendiameter)	Nordson Medical	103-0143
Doorzichtige medische krimpslang (0,044" binnendiameter)	Nordson Medical	103-0296
Kopersulfaat	Thermo Fisher (Pierce)	PI23224
Eppendorf ThermoMixer C	Eppendorf	2231000574
Eppendorf ThermoTop verwarmd deksel	Eppendorf	5308000003
Formvar/koolstof gecoate elektronenmicroscoop raster	Eletron Microscopy Sciences	FCF300-Cu
Glas capillaire buis (0,53 mm buitendiameter; 0,09 mm binnendiameter; 54 mm lengte)	Drummond	22-326223
Glas naald puller	Narishige	PC-10
Hamilton spuit	Hamilton	80000
Menselijke alpha-synuclein monomer voor het genereren van voorgevormde fibrillen	Proteos	RP-003
Muis alpha-synuclein monomer voor het genereren van voorgevormde fibrillen	Proteos	RP-009
Oranje medische krimpslang (0,021" binnendiameter)	Nordson Medical	103-0152
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7543
Proteinase K	Invitrogen	25530015
Qsonica 3,2 mm tip	Qsonica	4422
Qsonica Q125 sonicator	Qsonica	Q125
Thioflavine S	Sigma-Aldrich	T1892
Thioflavine T	EMD Millipore	596200
ToxinSensor Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit	Genscript	L00350C
Uranyl acetaat	Eletron Microscopy Sciences	22400