Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

In vivo beeldvorming van cerebrospinale vloeistof transport door de intact Mouse schedel met behulp van fluorescentie Macroscopie

14.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59774

⸱

29 juli 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Translational Neuromedicine, University of Rochester Medical Center, 2Center for Translational Neuromedicine, University of Copenhagen

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Transcraniële optische beeldvorming maakt het mogelijk om het transport van cerebrospinale vloeistof in de cortex van levende muizen door middel van een intacte schedel te Imaging.

Samenvatting

Cerebrospinale vloeistof (CSF) stroom bij knaagdieren is grotendeels bestudeerd met behulp van ex vivo kwantificering van tracers. Technieken zoals twee-Fobe microscopie en magnetische resonantie imaging (MRI) hebben in vivo kwantificering van de CSF-stroom ingeschakeld, maar ze worden beperkt door respectievelijk lagere beeld volumes en een lage ruimtelijke resolutie. Recent werk heeft geconstateerd dat CSF de hersen parenchym binnenkomt via een netwerk van perivasculaire ruimten rond de Piale en penetrerende slagaders van de knaagdieren cortex. Deze perivasculaire invoer van CSF is een primaire bestuurder van het glymphatische systeem, een traject dat betrokken is bij de klaring van toxische metabole opgeloste stoffen (bijv. amyloid-β). Hier illustreren we een nieuwe macroscopische beeldvormings techniek die real-time mesoscopische beeldvorming van fluorescerende CSF-tracers mogelijk maakt via de intacte schedel van levende muizen. Deze minimaal invasieve methode vergemakkelijkt een veelheid aan experimentele ontwerpen en maakt enkelvoudige of herhaalde tests van de CSF-dynamiek mogelijk. Macroscopen hebben een hoge ruimtelijke en temporele resolutie en hun grote portaal en werkafstand zorgen voor Imaging tijdens het uitvoeren van taken op gedrags apparaten. Deze beeldvormings benadering is gevalideerd met behulp van Two-photon Imaging en fluorescentie metingen verkregen uit deze techniek sterk correleren met ex vivo fluorescentie en kwantificering van radio-gelabelde tracers. In dit protocol beschrijven we hoe Transcraniële macroscopische beeldvorming kan worden gebruikt om glymphatische transport in levende muizen te evalueren, en biedt een toegankelijk alternatief voor duurdere beeldvormings modaliteiten.

Inleiding

Cerebrospinale vloeistof (CSF) bakt de hersenen en het ruggenmerg en is betrokken bij het handhaven van homeostase, leveren van voedingsstoffen, en regulering van intracraniële druk1. CSF in de subarachnoïde ruimte komt de hersenen binnen via een netwerk van perivasculaire ruimten (pv's) rondom de corticale merg slagaders en stroomt vervolgens langs penetrerende arteriolen2. Eenmaal in het parenchym worden CSF-uitwisselingen met interstitiële vloeistof (ISF), die schadelijke metabolieten zoals amyloid-β (Aβ) en Tau-eiwit bevatten, uit de hersenen verzameld door middel van lage weerstand witte materie Tracts en periveneuze ruimten2,3 . Dit traject is afhankelijk van astroglial aquaporin-4 (AQP4) kanalen en is daarom het glial-lymfatische (glymphatische) systeem4genoemd. Afvalproducten van de neuro pil worden uiteindelijk gewist uit het CSF-ISF via lymfevaten in de buurt van craniale zenuwen en in de hersenvliezen naar de cervicale lymfeklieren5. Het falen van dit systeem is betrokken bij verschillende neurologische ziekten zoals de ziekte van Alzheimer6,7, traumatisch hersenletsel3, en ischemische en hemorragische beroerte8.

CSF transport kan worden gevisualiseerd door het infusie tracers in de Cisterna magna (cm)9,10 en glymphatic studies in het verleden hebben voornamelijk gebruikt twee-photon microscopie4,11,12, 13, magnetische resonantie beeldvorming (MRI) 14,15,16,17en ex vivo imaging3,6,11, 18 om de Tracer kinetiek te evalueren. Two-photon microscopie is een geschikte methode voor gedetailleerde beeldvorming van CSF-tracers in PVSs en het parenchym vanwege de hoge ruimtelijke resolutie, maar het heeft een smal gezichtsveld en vereist een invasief craniaal venster of dunner worden van de schedel. Ex vivo imaging, in combinatie met immunohistochemie, maakt analyses op meerdere niveaus mogelijk, variërend van afzonderlijke cellen tot de hele hersenen19. Het proces van perfusie-fixatie dat nodig is om het postmortemweefsel te observeren produceert echter ingrijpende veranderingen in de CSF-stroomrichting en stort de PVS in, waardoor de verdeling en de locatie van de tracers12aanzienlijk veranderen. Tot slot, terwijl MRI de CSF-stroom over de gehele Murine en het menselijk brein kan volgen, ontbreekt het aan ruimtelijke en temporele resolutie van de perivasculaire stroming.

Een nieuwe techniek, Transcraniële macroscopische beeldvorming, lost sommige van deze beperkingen op door het inschakelen van Wide-veld beeldvorming van perivasculaire CSF transport in de gehele rugschors van levende muizen. Dit type beeldvorming wordt gedaan met een epifluorescerende macro scoop met behulp van een multiband filter kubus, Instelbare LED-lichtbron en hoogrenderende CMOS-camera10. Deze opstellingen zijn in staat om PVSs op te lossen tot 1-2 mm onder het schedel oppervlak en kunnen fluoroforen tot 5-6 mm onder het corticale oppervlak detecteren en de schedel volledig intact laten10. Multiband filters en Led's die de excitatie golflengte snel kunnen afstemmen, maken het gebruik van meerdere fluor Foren mogelijk, waardoor CSF kan worden gelabeld met tracers van verschillende molecuulgewichten en chemische eigenschappen in hetzelfde experiment.

Deze procedure vereist een eenvoudige, minimaal invasieve ingreep om de schedel bloot te leggen en een lichtgewicht Hoofdplaat te plaatsen om het hoofd te stabiliseren tijdens de beeldvormings sessie. Tracers kunnen in de cm worden afgeleverd zonder in de schedel te boren of door het corticale weefsel te penetreren met pipetten of canules9,20. Zowel cm canules als hoofd platen blijven enkele dagen tot weken stabiel en faciliteren complexere experimentele ontwerpen in vergelijking met de klassieke eindpunt visualisatie. Dit protocol beschrijft hoe Transcraniële macroscopische beeldvorming wordt gebruikt om de glymphatische systeemfunctie te bestuderen na acute of chronische injectie van fluorescerende CSF Tracer in de CM van anesthetized/slapende of wakker muizen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimenten werden goedgekeurd door het universitair Comité voor dierlijke hulpbronnen (UCAR, Protocol nr. 2011-023) aan de Universiteit van Rochester en uitgevoerd volgens de NIH-gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.

1. bereiding van de Cisterna magna canule, Hoofdplaat en hoofd houder

  1. Steriliseren alle chirurgische instrumenten en hoofd platen voor de operatie.
    Opmerking: fluorescerende tracers worden direct in CSF geleverd via een Cisterna magna-cannulatie. Voor gedetailleerde instructies over deze procedure, verwijzen wij u naar Xavier et al9.
  2. Kort, met behulp van een naald driver, breek de punt van een 30G x 12,7 mm (1/2 inch) naald, 3/4 van de weg naar beneden, en plaats het botte uiteinde van de naald in één uiteinde van polyethyleen 10 (PE10) slang (ongeveer 45 cm lang). Zorg ervoor dat alleen de schuine kant uitsteekt buiten de rand van de PE10 slang.
  3. Breek 1/4 van het schuine uiteinde van een andere 30G-naald af en plaats het stompe uiteinde van de overgebleven naald in het andere uiteinde van de PE10-slang, waarbij het plastic Luer-slot nog steeds is bevestigd.
  4. Vul een glazen spuit van 100 μL met steriel, kunstmatige CSF (aCSF: 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2po4, 2 mm MgSO4, 2 mM CACL2, 10 mm glucose en 26 mm NaHCO3).
  5. Bevestig de spuit aan het uiteinde van de lijn en vul deze met aCSF totdat de punt van de afgeschuinde naald is bereikt. Het is belangrijk dat de spuit wordt aangevuld met aCSF en niet lucht, omdat een luchtkolom meer vatbaar is voor variabele infusievolumes.
  6. Voor chronische experimenten, laat de lijn gevuld met aCSF en sla stap 1,7.
  7. Voor acute experimenten plaatst u de spuit op een infusiepomp en trekt u ongeveer 5 mm lucht in, waardoor het mengen wordt voorkomen. Daarna trekt u het totale volume van de Tracer (s) die gewenst is voor het experiment (20% extra wordt aanbevolen als gevolg van dode ruimte verliezen).
    Opmerking: de PE10 slang moet lang genoeg zijn, zodat de luchtbel niet in de plastic manchet van de glazen spuit komt bij het laden van de Tracer. Voor een typisch experiment gebruikt het protocol 10 μL bovien serumalbumine, geconjugeerd met Alexa Fluor 647 (BSA-647), verdund in aCSF bij 0,5%.
  8. Bevestig dat het hoofd plaatje in de hoofd houder past en dat het de juiste maat is voor het gebruik van de muis. Anatomische markeringen om dit te waarborgen zijn: de bovenrand van het venster wordt uitgelijnd met de interoculaire lijn en de achterste grens valt rostrale migratoire naar de occipitale kam.
    Let op: roestvrijstalen hoofd platen kunnen worden gesteriliseerd en hergebruikt. De meeste cyanoacrylaat mengsels kunnen met een aceton oplossing worden verwijderd.

2. chirurgische ingreep

  1. Weeg en anesthetiseer de muis (bijv. ketamine/xylazine; 100 mg/kg ketamine, 10 mg/kg xylazine; i.p.).
  2. Zodra de muis niet meer reageert op een teen pinch, Bevochtig je de nek en hoofd met steriel water en Scheer je met behulp van Clippers. Zodra het gebied is geschoren, veeg je het gebied opnieuw met een alcoholdoekje om het resterende haar te verwijderen.
    Opmerking: het bevochtigen van de vacht voordat het knippen drastisch vermindert de hoeveelheid haar in het beeldscherm na de incisie.
  3. Plaats de muis in een Stereotactisch frame bovenop een temperatuurgestuurd pad en breng Petroleum oftalmische zalf aan op de ogen van de muis om ervoor te zorgen dat ze niet uitdrogen.
  4. Reinig de blootgestelde huid met een chloorhexidine-swab. Verwijder na 2 minuten de chloorhexidine met een alcoholdoekje. Ten slotte, breng een jodiumoplossing die kan worden overgelaten om te drogen.
  5. Injecteer subcutane analgesie (0,25% Bupivacaine HCl) naar de bovenkant van de schedel en de nek.
  6. Beginnend op het deel van de nek dat de occipitale kuif bedekt, maak een middenlijn snede in de bovenliggende huid en blijf rostraal naar de interorbital lijn. Zijdelings op de grens waar de stoffelijke spier in de schedel wordt ingevoegd. Verwijder alle huid van de fusiforme incisie om zowel de frontale als de pariëtale botten bloot te leggen.
    Let op: de retroorbitale sinus ligt caudal aan de ogen en grote takken van de posterieure gezichts ader liggen rostrale migratoire aan de Pinna. Wees voorzichtig bij het maken van de incisie om deze structuren te sparen. Als dit gebeurt, stop met bloeden door het handhaven van hemostase met een steriel wattenstaafje gedurende enkele minuten en doorgaan.
  7. Irrigeren de schedel met steriele zoutoplossing en reinig het oppervlak met wattenstaafjes zodat het vrij is van puin en haren, omdat deze de beeldkwaliteit zullen verstoren. Schedel transparantie wordt het best bewaard door het periosteum en de bovenliggende fascia intact te laten.
    Opmerking: als deze structuren per ongeluk worden verwijderd, kan de schedel na verloop van tijd droog en ondoorzichtig worden. Opnieuw bevochtigen met aCSF of een mengsel van paraffineolie en glycerol gebruiken om de schedel reflectie in acute experimenten te verminderen21.
  8. Ga verder met het inbrengen van de Cisterna magna canule-voor chirurgische Details van deze procedure, zie Xavier et al9.
  9. Na het inbrengen van de CM canule, breng een mengsel van tandheelkundige cement met Cyanoacrylaat lijm aan de ventrale kant van het hoofd plaatje rond de grens en plaats het op de schedel zodat de voorste rand van de Hoofdplaat uitgelijnd met de achterste punt van het neusbeen en de Po de sterieure grens wordt uitgelijnd met het voorste deel van het interpariëtale bot, waardoor wordt voorkomen dat het sagittale hechtmiddel (middenlijn) gecentreerd is en recht ten opzichte van het raam (Figuur 1b).
  10. Bevestig de positie van de kopplaat met behulp van een paar druppels lijm versneller. Vul eventuele resterende openingen met het cement mengsel en genezen het met versneller.
    Let op: Zorg ervoor dat het cyanoacrylaat niet in aanraking komt met de ogen van de muis of het beeldvormings venster blokkeert.
  11. Lijm de CM canule aan de Hoofdplaat om ervoor te zorgen dat deze niet losraken tijdens het transport of wanneer de muis wakker wordt.
  12. Voor acute experimenten gaat u verder met stap 2,16.
  13. Voor chronische experimenten, breng een dunne laag van Clear-droging Cyanoacrylaat lijm aan op de blootgestelde schedel, oppassen niet te bellen als deze zal interfereren met de beeldvorming. De lijm zorgt voor bescherming van de schedel en zal de beeldvorming niet verstoren. Zorg ervoor dat de lijm bedekt de blootgestelde schedel helemaal naar de huid bij de incisie grens.
  14. Gebruik een hemostat-klem om de acsf-gevulde PE10-buis 2-3 cm van de cm te houden en snijd de lijn met een hoge temperatuur cauterisatie tip. Zodra het is afgescheiden, afvlakken van de gesmolten PE10 buis om de canule te verzegelen.
    Let op: Zorg ervoor dat u de klem niet vrijlaat nadat de canule is verzegeld en bevestig dat er geen lekken in de slang zijn om een CSF-fistel te voorkomen.
  15. Dien carprofen toe (5 mg/kg elke 24 h gedurende 3 dagen; i.p. of s.c.) en keer de muis terug naar een temperatuurgestuurde kooi met één behuizing en laat deze gedurende ten minste 24 uur vóór de beeldvorming herstellen. Laat de muis niet onbeheerd achter totdat het voldoende bewustzijn krijgt om borstbeen recumbency te behouden. Intacte craniale ramen blijven enkele weken stabiel.
    Opmerking: het chronische experiment kan hier worden onderbroken.
    Let op: sommige postoperatieve complicaties zijn: cefalohema toom/subgaleal hematomen, CSF fistel, en infectie.
  16. Voor acute experimenten, plaats de muis in de hoofd houder met behulp van de Hoofdplaat zodat de schedel in een vaste positie. Zorg ervoor om te controleren anesthesie niveau en plaats een verwarmingskussen onder de muis. De muis is nu klaar om te worden meegenomen naar de macro Scope.
    VOORZICHTIG: vervoer de muis voorzichtig samen met de infusiepomp op een kar. Als de CM-cannulatie wordt verbroken, zal het een daling van de intracraniële druk veroorzaken en zullen eventuele CSF-lekken de experimentele resultaten veranderen.

3. de muis voorbereiden op beeldvorming

Opmerking: het protocol varieert afhankelijk van of het Imaging-experiment wordt uitgevoerd op een verdoverde (start bij stap 3,1) of wakker (start bij stap 3,2) muis.

  1. Anesthetized muizen
    1. Plaats de hoofd houder op het podium van de macro Scoop, zorg ervoor dat er geen knikken in de lijn van de spuitpomp naar de CM canule zitten en dat deze niet strak zit omdat dit de Tracer infusie kan beïnvloeden.
    2. Observeer de ademhalingsfrequentie en de roze verkleuring van de slijmvliezen, wat duidt op een goede oxygenatie. Injecteer de zoutoplossing subcutaan om het vochtgehalte zo nodig te beschermen. Controleer om ervoor te zorgen dat het dier voldoende verdoofd en herdosis indien nodig.
    3. Schakel de macro Scope camera en LED in en start de LIVE-modus.
    4. Bevestig de vergroting van het beeldvormings veld zodat de nasofrontale hechting aan de bovenkant van het veld en de hechtdraad aan de bodem duidelijk kunnen worden gevisualiseerd, waarbij de sagittale hechting parallel en gecentreerd is op het midden van de afbeelding (figuur 1c). Bevestig de hoofd houder eenmaal op zijn plaats aan de macroscoop fase met tape.
    5. Richt de macro Scoop op de blootgestelde schedel. Ondanks macroscopen met een relatief grote scherptediepte kan de kromming van de schedel van de muis alleen een bepaald gebied scherp stellen. De beste resultaten worden verkregen wanneer het brandvlak zich aan de laterale zijden van de pariëtale beenderen achter de coronale hechtingen bevindt.
      Opmerking: dit is de locatie van de middelste hersenslagaders (MCA), waar de meeste CSF instroom optreedt (figuur 1d, E)10.
  2. Wakker muizen
    1. Voordat de Imaging sessie, laat de dieren te herstellen voor ten minste 24 h van de kop plaat chirurgie. Langere herstel perioden (5-7 dagen) worden ook aanbevolen. Train gedurende deze tijd de muis om het hoofd vast te stellen op het podium in de bevestigings buis voor 0,5-1 uur per dag voor de duur van de herstelperiode.
      Opmerking: gegemanier laat de muis aan de hoofd houder zonder verdoving worden bevestigd en vermindert stress en angst tijdens het eigenlijke experiment. Als dit niet haalbaar is en anesthesie niet interfereert met het experiment, kan een inductie dosis van een geïnhaleerd anestheticum (bijv. Isofluraan 2% bij 1-2 L/min O2 debiet) worden gebruikt om de muis snel aan het hoofd stadium te bevestigen.
    2. Zodra de muis is bevestigd aan de hoofd houder en in de bevestigings buis, volg de stappen 3.1.1-3.1.5.

4. infusie van fluorescerende CSF tracers

  1. Acute CM-Cannulatie
    1. Aangezien de Tracer al in de canule werd geladen voordat hij in stap 1,6 in de Cisterna magna werd geplaatst, stelt u de infusiepomp in op de gewenste snelheid en volume. De routinematig gebruikte infusie paradigma's zijn 5-10 μL bij 1-2 μL/min, maar deze parameters kunnen worden aangepast afhankelijk van het experiment of de grootte en leeftijd van het dier.
  2. Chronische CM Cannulatie
    1. Voordat u begint met de Imaging sessie, volgt u stappen 1.2-1.7 voor acute experimenten om de infuuslijn voor te bereiden om de tracers te leveren.
    2. Zodra de lijn is voorbereid, met behulp van een hemostat klem snijd het verzegelde uiteinde van de chronische CM canule. Neem de naald uit de lijn voorbereid in stap 4.2.1 en steek deze voorzichtig in de canule. Laat de klem los en gebruik de spuitpomp om de CSF-Tracer op de gewenste infusiesnelheid (bijv. 2 μL/min) voor het experiment te gebruiken totdat de Tracer de geïmplanteerde naald in de CM bereikt.
      Let op: als de naald door de slang doorboorde bij het aansluiten van de lijn, verwijder de naald, snijd het doorboord segment en herhaal deze stap. Elke scheur in de PE10-slang zal een lek veroorzaken en de resultaten van het experiment beïnvloeden.

5. de Imaging-sessie instellen

  1. Bepaal de excitatie golflengte en de belichtingstijd voor elk kanaal op basis van de doordrenkte fluorescentie Tracer. Kies de kortst mogelijke belichtingstijd die nodig is om de Tracer te visualiseren om de temporele resolutie van de time-lapse Imaging te maximaliseren. Deze blootstellingstijd zal worden gebruikt voor alle daaropvolgende experimenten gericht op het vergelijken van CSF-transport tussen verschillende dieren.
    Opmerking: een tip is om de Tracer in de CM-lijn te gebruiken om de belichtingstijd aan te passen. Hoewel dit een nuttige eerste benadering is, moet dit in de loop van de tijd worden geoptimaliseerd.
  2. Kies de duur van het experiment en de intervallen waarop de afbeeldingen zullen worden verzameld. Experimenten duren normaal tussen 30-60 min, afhankelijk van welke fase van glymfatische transport van belang is. Framesnelheden van 1 frame/min en sneller zijn voldoende voor de meeste experimenten.
  3. Stel de bestandsnaam en de opslag directory in.
  4. Als de beeldvorming wordt verzameld naast gelijktijdige overname van andere variabelen (bijv. elektrocardiogram, arteriële bloeddruk, elektrofysiologie), kunnen de macro scoop en de pomp worden geprogrammeerd om te worden geactiveerd met de Data Acquisition software. Controleer of de activeringsfunctie op de macro Scope juist is voordat u doorgaat naar de volgende stap.

6. transcranial optisch beeldvormings experiment

  1. Start de Tracer infusie en de beeldvorming op hetzelfde moment.
  2. Controleer de CM canule en de PE10 tubing regelmatig op tekenen van een lek. Als er een Tracer lekt op de CM, moeten de resultaten van dit experiment worden uitgesloten.
    Opmerking: als Tracer begint te accumuleren in het cerebellum en niet de glymfatische route van de MCA reist, is het waarschijnlijk dat de CM canule in het cerebellum werd geïnjecteerd. Deze gegevens mogen niet worden opgenomen.
  3. Voor acute experimenten, na voltooiing van het experiment, verwijder de muis van de Microscoop en controleer of het nog steeds voldoende verdoiseerd. Onthoode de muis snel en oogst het hersenweefsel. Onderdompeling-Bevestig de hersenen in 4% Paraformaldehyde (PFA) 's nachts bij 4 °C.
    1. Voor chronische experimenten, zodra de beeldvorming is voltooid, verwijder de cm-lijn van de canule, spoel met steriele acsf en reseal de cm canule met een hoge temperatuur cauterisatie tip. Verwijder de muis van de hoofd standaard en zet hem terug in de kooi. Herhaal dit proces totdat verdere beeldvorming niet vereist is en volg vervolgens stap 6,3.

7. gegevensanalyse

Opmerking: op MATLAB gebaseerde analyses, zoals CSF front-tracking kunnen grote hoeveelheden kwantitatieve gegevens uit de Tracer fronten extraheren in deze Imaging datasets10,22. Deze bestandstypen kunnen echter ook eenvoudig worden geïmporteerd en geanalyseerd in open-source beeldanalyse software zoals Fiji23.

  1. Importeer de afbeeldingsstapels in Fiji met behulp van het import hulpmiddel voor bio-indelingen. Deze functie zal de metagegevens van het bestand behouden, waaronder de tijd-en pixel resolutie. Sla de afbeeldings stack op als een. TIFF-bestand.
  2. Teken handmatig een interessegebied (ROI) rond de schedel of het interessegebied met behulp van het gereedschap Veelhoek selecteren. In figuur 1g bijvoorbeeld werd een ROI afzonderlijk getekend voor de ipsilaterale en voor de contralaterale hemisfeer na een traumatisch hersenletsel. Zorg ervoor dat u de ROI toevoegt aan de ROI manager (Analyseer > tools > ROI Manager) en sla deze op.
    Opmerking: het CSF-transport kan op twee manieren worden gekwantificeerd: 1) de intensiteit van de fluorescentie in de loop van de tijd of 2), uitgedrukt als een percentage van de ROI of de totale oppervlakte (mm2) nadat een drempel is toegepast. De laatste methode (afbeelding 1h) wordt beschreven in de volgende stappen.
  3. Stel de drempelwaarde op het frame in met maximale fluorescentie (Selecteer afbeelding ≫ pas ≫ drempel aan...). Geautomatiseerde drempel methoden zoals Otsu zijn normaalgesproken goed in het opsporen van CSF Tracer. De drempelwaarde toepassen.
  4. Voordat u voorwaarts gaat, moet u ervoor zorgen dat in analyseren ≫ metingen instellen, het optie gebied en de gebieds breuk zijn geselecteerd. Selecteer vervolgens in de ROI Manager meer > Multi Measure.
  5. Converteer de waarde % Area in mm2 met behulp van de waarde van het gebied van de ROI van de uitvoer. De % gebieds waarden weerspiegelen het percentage van het dorsale corticale oppervlak met CSF Tracer.
  6. Plot CSF Tracer toestroom in mm2 als functie van de tijd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De CSF-toestroom wordt afgebeeld op een epifluorescerende macro Scoop (Figuur 1a), die mesoscopische beeldvorming van CSF Tracer transport in de muriene cortex mogelijk maakt. De hele-schedel Hoofdplaat maakt de visualisatie van de rostrale migratoire nasale botten, zowel frontale en pariëtale botten in het midden, en de rostrale migratoire deel van het interpariëtale bot caudally (Figuur 1b). Tijdens de beeldvorming kunnen de nasofrontale, sagittale, coronale e...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

We hebben een gedetailleerd protocol beschreven voor het uitvoeren van Transcraniële CSF-beeldvorming in levende muizen met behulp van commercieel verkrijgbare fluorescerende macroscopen en tracers. Deze techniek is eenvoudig en minimaal invasief, maar toch kwantitatief. In vivo beeldvorming correleert goed met gevoelige methoden zoals vloeibare Scintillatie telling van radio-gelabelde tracers, waaronder 3H-dextran en 14C-inuline na cm levering, en met ex vivo coronale sectie kwantificering

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door het National Institute of neurologische aandoeningen and Stroke en het National Institute on Aging (U.S. National Institutes of Health; R01NS100366 en RF1AG057575 tot MN), het trans-Atlantisch netwerken van uitmuntendheid-programma van de Fondation Leducq en het EU Horizon 2020-onderzoeks-en innovatieprogramma (Grant No. 666881; SVDs @ target). Ook willen we dan Xue bedanken voor deskundige hulp bij grafische illustraties.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.25% Bupivacaine HClUniversity of Rochester Vivarium
100 µL Gastight Syringe Model 1710 TLL, PTFE Luer LockHamilton Company81020
A-M Systems Dental Cement PowderFisher ScientificNC9991371
CarprofenUniversity of Rochester Vivarium
ChlorhexidinePrevanticsB10800
CMOS CameraHammamatsuORCA Flash 4.0
Head PlateUniversity of RochesterGeen catalogusnummerOp maat gemaakt bij de machinewerkplaats van de University of Rochester
High-Temperature CauteryBovie Medical CorporationAA01
Insta-set AcceleratorBob Smith IndustriesBSI-151
Isoflurane - FlurisoVet One502017University of Rochester Vivarium
KetamineStrong Memorial Hospital Pharmacy
Krazy GlueElmer's Products, IncGeen catalogusnummer, zie link in opmerkingenhttps://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG
Micropore Surgical tapeFisher Scientific19-027-761
ParaformaldehydeSigma-aldrichP6148
PE10 - Polyethylene.011" x.024" per ft., 100 ft. continuousBraintree ScientificPE10 100 FT
Pump 11 Elite Infusion Only Dual SyringeHarvard Apparatus70-4501
PURALUBE VET OINTMENTDechra
Puritan PurSwab Cotton Tipped Cleaning SticksFisher Scientific22-029-553
Research Macro Zoom MicroscopeOlympusMVX10
Simple Head Holder Plate (for mice)Narishige International USA IncMAG-1
Single-use Needles, BD MedicalVWRBD305106
Sterile Alcohol Prep PadsFisher Scientific22-363-750
Tunable LEDPRIOR Lumen 1600-LED
XylazineUniversity of Rochester Vivarium

Referenties

  1. Tumani, H., Huss, A., Bachhuber, F. The cerebrospinal fluid and barriers - anatomic and physiologic considerations. Handbook of Clinical Neurology. , 21-32 (2017).
  2. Jessen, N. A., Munk, A. S., Lundgaard, I., Nedergaard, M. The Glymphatic System: A Beginner's Guide. Neurochemical Research. 40 (12), 2583-2599 (2015).
  3. Iliff, J. J., et al. Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury. The Journal of Neuroscience. 34 (49), 16180-16193 (2014).
  4. Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
  5. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  6. Peng, W., et al. Suppression of glymphatic fluid transport in a mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiology of Disease. 93, 215-225 (2016).
  7. Da Mesquita,, S,, et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
  8. Gaberel, T., et al. Impaired glymphatic perfusion after strokes revealed by contrast-enhanced MRI: a new target for fibrinolysis. Stroke. 45 (10), 3092-3096 (2014).
  9. Xavier, A. L. R., et al. Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents. Journal of Visualized Experiments. 10 (135), (2018).
  10. Plog, B. A., et al. Transcranial optical imaging reveals a pathway for optimizing the delivery of immunotherapeutics to the brain. JCI Insight. 3 (23), (2018).
  11. Kress, B. T., et al. Impairment of paravascular clearance pathways in the aging brain. Annals of Neurology. 76 (6), 845-861 (2014).
  12. Mestre, H., et al. Flow of cerebrospinal fluid is driven by arterial pulsations and is reduced in hypertension. Nature Communications. 9 (1), 4878(2018).
  13. Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the adult brain. Science. 342 (6156), 373-377 (2013).
  14. Plog, B. A., Nedergaard, M. The Glymphatic System. in Central Nervous System Health and Disease: Past, Present, and Future. Annual Review of Pathology. 13, 379-394 (2018).
  15. Iliff, J. J., et al. Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI. Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1299-1309 (2013).
  16. Davoodi-Bojd, E., et al. Modeling glymphatic system of the brain using MRI. Neuroimage. 188, 616-627 (2019).
  17. Lee, H., et al. The Effect of Body Posture on Brain Glymphatic Transport. The Journal of Neuroscience. 35 (31), 11034-11044 (2015).
  18. Hablitz, L. M., et al. Increased glymphatic influx is correlated with high EEG delta power and low heart rate in mice under anesthesia. Science Advances. 5 (2), (2019).
  19. Rasmussen, M. K., Mestre, H., Nedergaard, M. The glymphatic pathway in neurological disorders. The Lancet Neurology. 17 (11), 1016-1024 (2018).
  20. Mestre, H., et al. Aquaporin-4-dependent glymphatic solute transport in the rodent brain. Elife. 7, (2018).
  21. Monai, H., et al. Calcium imaging reveals glial involvement in transcranial direct current stimulation-induced plasticity in mouse brain. Nature Communications. 7, 11100(2016).
  22. Munk, A. S., et al. PDGF-B Is Required for Development of the Glymphatic System. Cell Reports. 26 (11), 2955-2969 (2019).
  23. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  24. Ren, Z., et al. Hit & Run' model of closed-skull traumatic brain injury (TBI) reveals complex patterns of post-traumatic AQP4 dysregulation. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (6), 834-845 (2013).
  25. Plog, B. A., et al. Biomarkers of traumatic injury are transported from brain to blood via the glymphatic system. The Journal of Neuroscience. 35 (2), 518-526 (2015).
  26. Ma, Q., Ineichen, B. V., Detmar, M., Proulx, S. T. Outflow of cerebrospinal fluid is predominantly through lymphatic vessels and is reduced in aged mice. Nature Communications. 8 (1), 1434(2017).
  27. Roth, T. L., et al. Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury. Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).
  28. Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nature Neuroscience. 10 (5), 549-551 (2007).
  29. Ma, Q., et al. Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain. Acta Neuropathologica. 137 (1), 151-165 (2019).
  30. Silasi, G., Xiao, D., Vanni, M. P., Chen, A. C., Murphy, T. H. Intact skull chronic windows for mesoscopic wide-field imaging in awake mice. Journal of Neuroscience Methods. 267, 141-149 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

glymfatisch systeeminfusie van CSF-tracerperivasculaire ruimtencanule in de cisterna magnafixatie van de hoofdplaatmacroscopische beeldvorming
In vivo beeldvorming van cerebrospinale vloeistof transport door de intact Mouse schedel met behulp van fluorescentie Macroscopie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.